一种生产l-丙氨酸的方法
【专利摘要】本发明提供了一种生产L-丙氨酸的方法，涉及基因工程和发酵工程领域，是利用天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶生产L-丙氨酸。本发明方法使用PCR方法从德阿昆哈假单胞菌中获得天冬氨酸-β-脱羧酶的编码基因，诱导天冬氨酸-β-脱羧酶的表达，再对其进行化学交联得到天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶，以其为酶，以L-天冬氨酸作为底物，生产L-丙氨酸。每升反应液中，L-天冬氨酸底物浓度达1800g/L，酶促反应20小时后摩尔转化率达99.9%。
【专利说明】一种生产L-丙氨酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程和发酵工程【技术领域】，具体涉及一种利用天冬氨酸-β -脱羧酶交联聚集体固相酶生产L-丙氨酸的方法。
【背景技术】
[0002]L-丙氨酸是一种应用十分广泛的氨基酸，其外观为白色结晶性粉末，无臭有甜味，溶于水和乙醇，难容于乙醚。在食品上广泛添加于化学调味品、饮料、有机酸、酒类及腌制品中，作为一种重要的添加剂，同时具有增鲜保鲜的作用。L-丙氨酸在医药上主要是合成维生素Β6和氨基丙醇的重要原料，是组成复合氨基酸注射液和口服液的原料。随着对L-丙氨酸不断研究和开发，在医药和食品等行业的应用不断扩大，并有日益增长的趋势。L-丙氨酸产品全球年需要量将超过30000吨。
[0003]目前利用固定化细胞酶转化法是最为有效的工业化生产L-丙氨酸之一。即利用菌体中的天冬氨酸-β -脱羧酶以L-天冬氨酸为原料，酶法脱梭生成L-丙氨酸。由于天冬氨酸-β -脱羧酶位于菌体内，作为底物的L-天冬氨酸必须通过菌体的细胞壁和细胞膜，导致反应速度慢，在工业化生产过程中，生产周期长达4-5天。菌体内含有杂酶，特别是氨基酸消旋酶作用于L-丙氨酸 产出D-丙氨酸，影响产品质量。因此迫切需要一种生产周期短，产物浓度高，杂质少的生产L-丙氨酸的方法。
【发明内容】
[0004]本发明克服上述固相化细胞生产L-丙氨酸技术不足，利用基因工程技术表达天冬氨酸-β -脱羧酶，制备天冬氨酸-β -脱羧酶交联聚集体固相酶，再利用此固相酶。
[0005]本发明的第一个目的是提供天冬氨酸_β -脱羧酶交联聚集体固相酶的制备方法，包括:
[0006](I)使用PCR方法从德阿昆哈假单胞菌(Pseudomonas dacunhae)中获得天冬氨酸-β-脱羧酶的编码基因；
[0007](2) PCR产物连接载体、转化大肠杆菌，超声波破碎菌体，收集上清液，再进行分离纯化；
[0008](3)用化学交联方法得到天冬氨酸_β -脱羧酶交联聚集体固相酶。
[0009]本发明的第二个目的是提供一种生产周期短，产物浓度高，杂质少的生产L-丙氨酸的方法。
[0010]本发明的生产L-丙氨酸的方法含有以下步骤:
[0011](I)使用PCR方法从德阿昆哈假单胞菌(Pseudomonas dacunhae)中获得天冬氨酸-β-脱羧酶的编码基因；
[0012](2) PCR产物连接载体、转化大肠杆菌，超声波破碎菌体，收集上清液，再进行分离纯化；
[0013](3)用化学交联方法得到天冬氨酸_β -脱羧酶交联聚集体固相酶；[0014](4)以磷酸盐缓冲液对步骤(3)获得的酶进行定容，再加入L-天冬氨酸生产L-丙氨酸。
[0015]其中，步骤(1)中PCR方法所用的引物为:
[0016]正向引物:5'-AAACATATGATGAGCAAGGATTATCGG-3'；
[0017]反向引物:5'-AAACTCGAGCTACTCCTTGCCCAGCGC-3'。
[0018]其中斜体字母部分分别为酶切位点Nde I和Xho I。PCR反应在50 μ L总体积中进行，反应条件为在94°C变性5min后开始循环，然后94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸3min，共30个循环后，再于72°C延伸lOmin。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证，结果见图1，回收目的片段，测序验证为正确扩增，序列如SEQ ID N0.1所示，其编码的氨基酸序列如 SEQ ID N0.2 所示。
[0019]其中，步骤(2 )中PCR产物连接载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞，在20_30 V使用乳糖作为诱导剂，诱导天冬氨酸_β -脱羧酶表达。
[0020]具体为将PCR产物连接载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取I个阳性克隆，接种于含50mg/ml卡那霉素抗性的IOml LB液体培养基中，37°C，220rpm振荡培养至OD600为0.6-0.8时，取2ml转接于2000mL的含2.5g/L甘油的LB液体培养基中，36-38°C，200-220rpm振荡培养，待OD6tltl值约达2.0时，加入终浓度为2_6g/L的乳糖，24-26°C诱导6-24h。
[0021 ] 在本发明的一个实施例中，将PCR产物连接入载体pET_28b，构建表达载体pET-Asd，将该表达载体转化大肠杆菌BL21感受态细胞。
[0022]本发明方法中，还包括对诱导的培养液在4_6°C，8000rpm离心，收集菌体，菌体以0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液悬浮，即湿菌体与缓冲液的比例为Ig湿菌体:5-6mL缓冲液，在冰浴中以超声波破碎菌体，破碎后，4-6°C，8000rpm离心收集上清。
[0023]本发明方法的步骤(2)中分离纯化的方法为硫酸铵分段沉淀法，具体为向上清液中加入5%饱和度的硫酸铵溶液，边加边搅拌，然后在4-6°C，8000-10000rpm离心10min，取上清，再向上清液中缓慢加入25%饱和度硫酸铵溶液，边加边搅拌，静置l-5h，4-6°C，8000-10000rpm离心10min，收集沉淀物。
[0024]其中，步骤(3)所述的化学交联方法是以戊二醛作为交联剂，对纯化的天冬氨酸_β -脱羧酶进行固定化处理，得到天冬氨酸_β -脱羧酶交联聚集体固相酶。
[0025]进一步地，是将分离纯化收集到的沉淀按照Ig:10-12mL的比例滴加50%的戊二醛交联剂，混合均匀于4-6°C下交联22-24h后离心，取沉淀物，用蒸馏水洗涤3-5次，再用0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤2-3次，分离得到沉淀即制得天冬氨酸-β -脱羧酶交联聚集体固相酶。
[0026]其中步骤(4)中对7_9g的天冬氨酸-β -脱羧酶交联聚集体固相酶使用0.1Μ,ΡΗ7.0的磷酸盐缓冲液定容至1L。
[0027]具体地，步骤(4)向天冬氨酸-β -脱羧酶交联聚集体固相酶定容液中加入L-天冬氨酸的方法为，初始L-天冬氨酸的加入量为400-500g ;反应4小时后，按每小时100g加入天冬氨酸，每升反应液中可转化L-天冬氨酸量高达1800g。
[0028]步骤(4)的反应温度为36-38°C。
[0029]步骤(4)反应期间每4h取样，16h后每Ih取样，通过HPLC检测反应溶液中L-天冬氨酸和L-丙氨酸含量，当L-丙氨酸含量不再增加时，即为反应终点。
[0030]对于步骤(4 )，本发明的一个实施例的HPLC检测使用的高效液相色谱仪AgilentllOOseries (安捷伦公司)，高效液相色谱柱 ZorbaxSBC18 柱(5 μ m, 4.6mmX 250mm)(安捷伦公司)。
[0031] 流动相:流动相A:0.02mol/L NaAc, pH6.2 ;流动相B:乙腈。采用线性梯度洗脱:时间(min) 0-20，B (%) 5-330流速:1.0ml/min ;柱温:30°C;二极管阵列检测器(DVD)工作条件:检测波长:360nm ;参比波长:600nm。
[0032]本发明提供的生产L-丙氨酸的方法中，首先通过基因工程的方法制备得到天冬氨酸-β -脱羧酶，然后以戊二醛作为交联剂，对纯化的天冬氨酸-β -脱羧酶进行固定化处理，得到天冬氨酸-β -脱羧酶交联聚集体固相酶，通过酶活测定及计算，本发明制得的天冬氨酸-β -脱羧酶聚集体固相酶酶活为28000U/g。再利用制得的天冬氨酸-β -脱羧酶聚集体固相酶，以L-天冬氨酸固体为底物制得L-丙氨酸，酶促反应20小时后摩尔转化率达99.9%，整个过程仅需4天，且杂质少。本发明方法简单有效，具有生产周期短，产物浓度高，杂质少的技术优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为PCR方法扩增天冬氨酸_β -脱羧酶基因的琼脂糖凝胶电泳图。
[0034]图2为天冬氨酸-β -脱羧酶SDS-PAGE图。
[0035]图3为天冬氨酸-β -脱羧酶交联聚集体(X 100)。
[0036]图4为L-天冬氨酸的HPLC图谱。
[0037]图5为天冬氨酸-β -脱羧酶交联聚集体固相酶转化L-天冬氨酸(L-Asp)，反应产物L-丙氨酸(L-Ala) HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0038]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0039]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中，加入各原料除特别说明外，均为市售。实施例1天冬氨酸-β_脱羧酶(Asd)基因的获得
[0040]Wlyg德阿昆哈假单孢菌(Pseudomonas dacunhae)基因组DNA为PCR反应模板，按 SEQ ID N0.3 的序列设计正向引物 Asd-F 为 5' -AAACATATGATGAGCAAGGATTATCGG-3'；反向引物Asd-R为5' -AAACTCGAGCTACTCCTTGCCCAGCGC-3'。其中斜体字母部分分别为酶切位点Nde I和Xho I。PCR反应在50 μ L总体积中进行，反应条件为在94°C变性5min后开始循环，然后94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸3min，共30个循环后，再于72°C延伸lOmin。取3 μ L PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1所示。取100 μ LPCR产物做琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒(购自上海生工生物公司)的步骤回收目的片段，即Asd基因。测序验证为正确扩增，目的片段的核苷酸序列如SEQ ID Ν0.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。[0041]实施例2天冬氨酸_β -脱羧酶基因表达载体的构建
[0042]实施例1中PCR产物经限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切消化后，与用相同限制性内切酶消化的载体pET-28b (购自Novagen公司)进行连接反应，然后将连接的混合物转化大肠杆菌DH5a (购自promega公司),并进行序列测定提取转化菌体库的质粒,构建的表达载体被称为pET-Asd。
[0043]实施例3天冬氨酸β -脱羧酶基因在大肠杆菌中的表达及表达产物分离
[0044]将pET-Asd质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)(购自promega公司)感受态细胞；挑取I个阳性克隆，接种于含卡那霉素抗性(50mg/ml)的IOml LB液体培养基中，37°C，220rpm振荡培养至0D_约为0.6-0.8时，取2ml转接于2000mL的LB液体培养基中(加入2.5g/L甘油)，370C，220rpm振荡培养，待OD6tltl值约达2.0时，加入终浓度为2_6g/L的乳糖，25°C诱导6-24h。然后对诱导的培养液在4°C，8000rpm离心，收集菌体，菌体以0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液悬浮(湿菌体与缓冲液的比例为Ig湿菌体:5mL缓冲液)，在冰浴中以超声波破碎菌体，破碎后，4°C，8000rpm离心收集上清，取100 μ I上清加入5 X SDS-PAGE上样缓冲液，混匀，100°C沸水浴15min后，进行SDS-PAGE分析。结果见图2。
[0045]向100mL上清液中缓慢加入5%饱和度的硫酸铵溶液，边加边搅拌，然后4°C，8000rpm离心10min，取上清，再向上清液中缓慢加入25%饱和度硫酸铵溶液，边加边搅拌，静置3h，4°C，SOOOrpm离心10min，收集沉淀物，即为含有天冬氨酸_ β _脱羧酶组分。
[0046]实施例4天冬氨酸-β -脱羧酶聚集体的交联
[0047]将实施例3中收集的8g沉淀物滴加90ml50%的戊二醛交联剂，再次缓慢搅拌令其混合均匀。于4°C下交联22h后，在4°C，8000-10000rpm离心10min，取沉淀物，先用蒸馏水洗涤三次，再用0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤两次，最终分离得到沉淀。待冰冻干燥后即为制得的天冬氨酸-β_脱羧酶交联聚集体固相酶。光学显微镜下观察到，天冬氨酸-β_脱羧酶交联聚集体固相酶是单体的多聚形式，形状不规则，颗粒较小(图3)。
[0048]实施例5天冬氨酸-β -脱羧酶交联聚集体固相酶的酶活测定
[0049]在ΡΗ7.0，温度为37°C的条件下，每克天冬氨酸-β -脱羧酶交联聚集体固相酶每分钟转化生成lymol L-丙氨酸所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
[0050]取Ig天冬氨酸-β -脱羧酶聚集体固相酶，加入0.1Μ，ρΗ7.0的磷酸盐缓冲液，定容至100ml，再加入IOg L-天冬氨酸作为底物，37°C水浴30min后，高效液相色谱检测溶液中L-丙氨酸含量。
[0051]高效液相色谱仪AgilentllOOseries (安捷伦公司)，高效液相色谱柱ZorbaxSBC18 柱(5 μ m,4.6mmX250mm)(安捷伦公司)。
[0052]流动相:流动相A:0.02mol/L NaAc, pH6.2 ;流动相B:乙腈。采用线性梯度洗脱:时间(min) 0-20，B (%) 5-33?
[0053]流速:1.0ml/min
[0054]柱温:30°C
[0055]二极管阵列检测器(DVD)工作条件:检测波长:360nm ;参比波长:600nm。
[0056]通过HPLC检测酶促反应中底物(L-天冬氨酸)转化为产物(L-丙氨酸)的量来计算酶活，即从反应起始5分钟内每克天冬氨酸-β -脱羧酶聚集体固相酶每分钟产生Iumol L-丙氨酸定义为1U，经HPLC检测酶促反应5分钟内L-丙氨酸摩尔量计算得天冬氨酸-β -脱羧酶聚集体固相酶酶活为28000U/g。
[0057]实施例6天冬氨酸-脱羧酶聚集体固相酶生产L-丙氨酸
[0058]用实施例4制得的8g天冬氨酸-脱羧酶聚集体固相酶为酶源，加入0.1Μ，ΡΗ7.0的磷酸缓冲液，定容至1L，直接加入L-天冬氨酸固体，控制整个反应过程ρΗ7.0，温度37°C。初始L-天冬氨酸加入量400-500g，反应4小时后，按每小时100g加入天冬氨酸，每升反应液中可转化L-天冬氨酸量高达1800g，Oh取样检测，见图4，此时无L-丙氨酸生成。反应期间每4h取样，16h后每I小时取样，通过HPLC检测溶液中L-天冬氨酸和L-丙氨酸含量，当L-丙氨酸含量不再增加时即为反应终点，第20h和第21h取样检测，测定溶液中L-丙氨酸都为1204g。根据计算摩尔转化率达99.9%，且第20小时HPLC检测(图4)杂峰的峰面积占总峰面积小于0.1%。 [0059]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种生产L-丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)使用PCR方法从德阿昆哈假单胞菌(Pseudomonasdacunhae)中获得天冬氨酸-β-脱羧酶的编码基因； (2)PCR产物连接载体、转化大肠杆菌，超声波破碎菌体，收集上清液，再进行分离纯化； (3)用化学交联方法得到天冬氨酸_β -脱羧酶交联聚集体固相酶； (4)以磷酸盐缓冲液对步骤(3)获得的酶进行定容，再加入L-天冬氨酸生产L-丙氨酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中PCR方法所用的引物为: 正向引物:5' -AAACATATGATGAGCAAGGATTATCGG-3'； 反向引物:5' -AAACTCGAGCTACTCCTTGCCCAGCGC-3'。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR产物连接载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞，在20-30°C使用乳糖作为诱导剂，诱导天冬氨酸-β -脱羧酶表达。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于,还包括对诱导的培养液在4-6°C，8000rpm离心，收集菌体，菌体以0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液悬浮，即湿菌体与缓冲液的比例为Ig湿菌体:5-6mL缓冲液，在冰浴中以超声波破碎菌体，破碎后，4-6°C，8000rpm离心收集上清。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中分离纯化的方法为硫酸铵分段沉淀法，具体为向上清液中加入5%饱和度的硫酸铵溶液，边加边搅拌，然后在4-6 °C，8000-10000rpm离心10min，取上清，再向上清液中缓慢加入25%饱和度硫酸铵溶液，边加边搅拌，静置l-5h，4-6°C，8000-10000rpm离心10min，收集沉淀物。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的化学交联方法是以戊二醛为交联剂，将分离纯化收集到的沉淀按照Ig:10-12mL的比例滴加50%的戊二醛交联剂，混合均匀于4-6°C下交联22-24h后离心，取沉淀物，用蒸馏水洗涤3-5次，再用0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤2-3次，分离得到沉淀即制得天冬氨酸_β -脱羧酶交联聚集体固相酶。
7.如权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)中对7-9g的天冬氨酸-β -脱羧酶交联聚集体固相酶使用0.1Μ，ρΗ7.0的磷酸盐缓冲液定容至1L。
8.如权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)向天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶定容液中加入L-天冬氨酸的方法为:初始L-天冬氨酸的加入量为400-500g ;反应4小时后,按每小时100g逐步加入天冬氨酸,每升反应液中可转化L-天冬氨酸量达1800g。
9.如权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)的反应温度为36-38°C。
10.如权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，在步骤(4)反应期间每4h取样，16h后每Ih取样，通过HPLC检测反应溶液中L-天冬氨酸和L-丙氨酸含量，当L-丙氨酸含量不再增加时，即为反应终点。
【文档编号】C12R1/38GK103923955SQ201410106588
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】李荣杰, 尚海涛, 杨为华, 邓远德, 徐斌, 许 鹏 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司