一种防止神经毒素Anntoxin失活的方法
【专利摘要】本发明公开了一种防止神经毒素Anntoxin失活的方法，其目的在于克服神经毒素Anntoxin在蛋白游离状态下容易被分解而失去活性且毒性不能有效针对昆虫产生的问题。本发明将神经毒素Anntoxin包埋在多角体中，使得神经毒素Anntoxin不会受到环境影响而失活，长时间保存活性。此外，将神经毒素Anntoxin包埋在多角体中，多角体易于被昆虫食入，在昆虫体内降解释放神经毒素Anntoxin起作用，而多角体在爬行类、鸟类和哺乳类动物体内稳定，不会被降解而释放神经毒素Anntoxin。
【专利说明】-种防止神经毒素 Anntox i η失活的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学【技术领域】，特别涉及一种防止神经毒素 Anntoxin失活的 方法。
【背景技术】
[0002] Anntoxin是由雨蛙产生的一类对昆虫、爬行类、鸟类和哺乳类动物具有很强致死 毒性的基因编码的神经毒素。可应用于农业害虫的杀灭，但该蛋白质（Anntoxin)不稳定，在 环境中易被分解而失去活性，因此很难用于生物杀虫剂。此外，单独的Anntoxin不但对于 昆虫有很强的致死毒性，同时对于爬行类、鸟类和哺乳类动物也同样有很强的致死毒性，这 样即使Anntoxin能稳定存在能用于生物杀虫剂，但是使用后毒性很威胁到各种动物及人， 因此也是无法应用的。
[0003] 杆状病毒中的核型多角体病毒在感染宿主后的晚期能够产生大量的多角体蛋白， 并聚合形成一种独特的超大分子蛋白质结晶-多角体。它的功能是保护病毒颗粒免受外界 各种不良环境的破坏，它对各种蛋白分解酶有抗性，而在碱中易溶解，释出病毒粒子，目前 的研究表明多角体的功能主要保护包埋在多角体内部的病毒粒子，使之长时间保存活性。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服神经毒素 Anntoxin在蛋白游离状态下容易被分解而失去 活性且毒性不能有效针对昆虫产生的问题，提供了一种防止神经毒素 Anntoxin失活的方 法，将神经毒素 Anntoxin包埋在多角体中，使得神经毒素 Anntoxin不会受到环境影响而失 活，长时间保存活性。此外，将神经毒素 Anntoxin包埋在多角体中，多角体易于被昆虫食 入，在昆虫体内降解释放神经毒素 Anntoxin起作用，而多角体在爬行类、鸟类和哺乳类动 物体内稳定，不会被降解而释放神经毒素 Anntoxin。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 一种防止神经毒素 Anntoxin失活的方法，包括以下步骤： (1) 神经毒素 Anntoxin基因的克隆： 以从华西雨蛙(华西雨蛙的皮肤组织)抽提的总RNA为模板，利用RT-PCR扩增反应得到 神经毒素 Aw 基因；RT-PCR扩增反应所用的引物包括正向引物和反向引物，正向引物 的序列见SEQ ID N0. 1，反向引物的序列见SEQ ID N0. 2 ; 本发明设计了特定的引物用以扩增得到神经毒素基因； 利用琼脂糖凝胶电泳对神经毒素基因进行PCR产物分析和纯化，随后将PCR 产物克隆进pGEM-T Easy载体，得到pGEM-T Easy-J/wiiori/?重组载体； (2) 含有神经毒素 Anntoxin基因的重组杆状病毒的构建： 用限制性内切酶汉和ZAa/消化pGEM-T Easy-J/wiiori/?重组载体得到J/wioxi/? 基因片段，然后将基因片段克隆入杆状病毒转移载体pFastBacHTA得到重组的转 移载体； 将得到的重组的转移载体转化DHlOBmBac (polh+)感受态细胞(感受态细胞的选择十 分重要，若不是选择这样的感受态细胞，则将不能形成多角体，也就不能包被神经毒素)，扩 大培养后，用PCR扩增的方法进行鉴定，提取阳性克隆的Bacmid DNA (现有常规方法)，将 Bacmid DNA、阳离子脂质体和无血清的TC-100培养基混合物在室温培育15min后转染对数 生长期的家蚕Bm5细胞，将该转染后的家蚕Bm5细胞先用无血清的TC-100培养基在27°C条 件下培养5h，再用含有10% (体积比）胎牛血清的TC-100培养基在27 °C条件下培养120 h，收集上清进行二次感染，获得相应的重组病毒，命名为vBmBac(polh+)-Anntoxin ; (3)家蚕Bm5细胞内表达： 对家蚕Bm5细胞接种步骤（2)获得的重组病毒，在27°C下感染三天以进行感染表达，然 后离心收集家蚕Bm5细胞，用PBS缓冲液重悬后超声破碎，离心收集多角体粗提物，将多角 体粗提物加入Percoll细胞分离液与PBS缓冲液混合液中，离心后收集纯净的多角体，最 后将纯净的多角体悬浮于含0.1% (体积比）SDS的PBS缓冲液中，室温放置5 min，然后 用PBS缓冲液洗涤后得到最终纯化的内部固定有神经毒素 Anntoxin的多角体。
[0006] 本发明利用能够形成多角体的杆状病毒表达系统表达神经毒素 Anntoxin，将重组 病毒感染家蚕Bm5细胞，这样产生的多角体在细胞内会将神经毒素 Anntoxin包埋和固定入 多角体内部。这样解决了神经毒素 Anntoxin容易失活的缺点，为开发神经毒素 Anntoxin 作为生物杀虫剂创造了条件。此外，将神经毒素 Anntoxin包埋在多角体中，多角体易于被 昆虫食入，在昆虫体内降解释放神经毒素 Anntoxin起作用，而多角体在爬行类、鸟类和哺 乳类动物体内稳定，不会被降解而释放神经毒素 Anntoxin。
[0007] 作为优选，所述RT-PCR扩增反应参数为：一个循环，94°C模板变性5分钟；接着35 个循环，94°C变性50秒，57°C退火30秒，72°C延伸25秒；最后1个循环，72°C延伸7分 钟。
[0008] 作为优选，步骤（2)所述扩大培养为：在含有50 μ g/ml卡那霉素、7 μ g/ml庆 大霉素、10 yg/ml四环素、100 yg/ml X-gal和40 yg/ml IPTG的LB固体培养基上室 温培养48h。
[0009] 作为优选，步骤（2)中Bacmid DNA、阳离子脂质体和无血清的TC-100培养基混合 物的制备方法为：将2μ g的Bacmid DNA、6y 1的阳离子脂质体加入聚苯乙烯锥形管内，补 充无血清的TC-100培养基至200 μ 1。
[0010] 作为优选，步骤（2)中二次感染具体为将收集的上清用含有10% (体积比）胎牛血 清的TC-100培养基在27°C条件下培养96-120 h。
[0011] 作为优选，步骤（3)中Percoll细胞分离液与PBS缓冲液混合液中Percoll细胞 分离液与PBS缓冲液的体积比为9:1。
[0012] 本发明的有益效果是： 1、将神经毒素 Anntoxin包埋在多角体中，使得神经毒素 Anntoxin不会受到环境影响 而失活，长时间保存活性。
[0013] 2、将神经毒素 Anntoxin包埋在多角体中，多角体易于被昆虫食入，在昆虫体内降 解释放神经毒素 Anntoxin起作用，而多角体在爬行类、鸟类和哺乳类动物体内稳定，不会 被降解而释放神经毒素 Anntoxin。
[0014]
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是基因 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0016] 图2是重组病毒感染家蚕Bm5细胞的显微镜图。
[0017] 图3是多角体中神经毒素 Anntoxin的Western blotting图， Μ代表Marker，1代表重组病毒感染家蚕Bm5细胞收集的多角体，2代表野生型病毒感 染家蚕Bm5细胞收集的多角体。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0019] 本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0020] 1、华西雨蛙：由浙江大学动物科学学院提供。
[0021] 2、pGEM-T Easy 载体：购于公司。
[0022] 3、PCR产物纯化试剂盒：购于公司。
[0023] 4、cDNA合成试剂盒：购于Promega公司。
[0024] 5、杆状病毒转移载体pFast BacHTA、lipofectin (阳离子脂质体)和6XHis的单 克隆抗体：均为美国//? h 公司产品。
[0025] 6、胎牛血清FCS、无血清TC-100培养基均为Gko份￡公司的产品。
[0026] 7、Percoll细胞分离液是Pharmacia公司产品。
[0027] 8、X_gal、IPTG 购自 Sigma 公司。
[0028] 本发明使用的 PBS 缓冲液配方为：20 mmol/L NaH2P04, 20 mmol/L Na2HP04, 150 mmol/L NaCl;pH 7. 2〇
[0029] 实施例： (1)神经毒素 Anntoxin基因的克隆： 以从华西雨蛙的皮肤组织抽提的总RNA为模板(抽提RNA的方法为现有常规的TRIzol RNA提取方法)，利用RT-PCR扩增反应得到神经毒素基因；所述PCR扩增所用的 引物设计如下：正向引物为含有酶切位点的5' GGATCC ATGAAGACTTCTGTGGTTTTC 3' (SEQ ID NO. 1), 反向引物为含有油aJ酶切位点的5 ' TCTAGATTCTGCTGTCACGCAGGT 3 '（ SEQ ID NO. 2)； RT-PCR扩增反应具体过程为： cDNA合成：（采用市售cDNA合成试剂盒） 反应体系：提取的总RNA 2 μ g 01igo(dT)15 0·5μ1(ΜΗ20补充至 5 yl，70°C 5min，然后冰上放置 5min; 5Xbuffer 4μ 1 dNTP 1. 0μ 1 核糖核酸酶抑制剂1.〇μ 1 逆转录酶?.Ομ 1 补充ddH20至15 μ 1 ;将两者混合。
[0030] 扩增体系：25°C退火 5min，42°C延伸 lh，70°C灭活 15min。
[0031] PCR 反应体系：5 X buffer 4 μ 1 模板1 μ 1 dNTP 1. 0μ 1 正反向引物各0. 5 μ 1 Taq 酶(市售）0· 5μ 1 补充 ddH20 至 20 μ 1。
[0032] PCR扩增反应参数为：一个循环，94°C模板变性5分钟；接着35个循环，94°C变性 50秒，57°C退火30秒，72°C延伸25秒；最后1个循环，72°C延伸7分钟。
[0033] 利用1. 2%琼脂糖凝胶电泳对神经毒素基因进行PCR产物分析，如图1 所示，从图1可得知扩增得到了 基因片段，并用PCR产物纯化试剂盒纯化，随后将 PCR产物克隆进pGEM-T Easy载体，得到pGEM-T Easy-J/wiiori/?重组载体，于上海英骏生物 技术有限公司对重组载体进行测序，确认扩增序列的正确性。
[0034] (2)含有神经毒素 Anntoxin基因的重组杆状病毒的构建： 用限制性内切酶(市售）和油aJ (市售）消化pGEM-T Easyj/wiozi/?重组载体 得到基因片段，然后将基因片段克隆入杆状病毒转移载体pFastBacHTA 得到重组的转移载体。
[0035] 将得到的重组的转移载体转化DH10BmBac(polh+)感受态细胞 (DH10BmBac(polh+)感受态细胞的制备方法见 Xingwei Xiang 等，Construction of a BmNPV polyhedrin-plus Bac-to-Bac baculovirus expression system for application in silkworm, Bombyx mori, Appl Microbiol Biotechnol (2010) 87:289_295)，在含有 50 yg/ml 卡那霉素、7 yg/ml 庆大霉素、10 yg/ml 四环素、100 yg/ml X-gal 和 40 yg/ml IPTG的LB固体培养基上室温培养48h，挑取白色单菌落，并用PCR扩增的方法 进行鉴定，提取阳性克隆的Bacmid DNA (Bacmid DNA提取方法为现有常规方法)，将2yg 的Bacmid DNA、6yl的阳离子脂质体（lipofectin)加入聚苯乙烯锥形管内，补充无血清的 TC-100培养基至200 μ 1得混合物，混合物在室温培育15min后转染对数生长期的家蚕Bm5 细胞，将该转染后的家蚕Bm5细胞先用无血清的TC-100培养基在27°C条件下培养5h，再用 含有10%胎牛血清的TC-100培养基在27 °C条件下培养120 h，收集上清进行二次感染，二 次感染具体为将收集的上清用含有10% (体积比)胎牛血清的TC-100培养基在27°C条件下 培养96-120 h，获得相应的重组病毒，命名为vBmBac(polh+)-Anntoxin; (3)家蚕Bm5细胞内表达： 对家蚕Bm5细胞接种步骤（2)获得的重组病毒，在27°C下感染三天以进行感染表达， 后通过离心收集家蚕Bm5细胞(如图2所示，图2表明家蚕细胞被重组病毒感染)。用10 mLPBS缓冲液悬浮后超声破碎。于4°C，15,000 rpm离心10 min收集多角体粗提物。将 Percoll细胞分离液与PBS缓冲液按9:1的体积比混合，调节pH至7. 2。将多角体粗提 物缓慢的加入Percoll细胞分离液与PBS缓冲液混合液中，4°C，12, 000 rpm离心20 min 后收集纯净的多角体。最后将纯净的多角体悬浮于含0.1% (体积比）SDS的PBS缓冲液 (即PBS缓冲液99. 9ml与0. lml SDS配置而成）中，室温放置5 min，然后用PBS缓冲液 洗漆2次得到最终纯化的内部固定有神经毒素 Anntoxin的多角体。
[0036] (4)多角体晶体固定神经毒素 Anntoxin的分析鉴定： 将上述离心收集到的家蚕Bm5细胞样品进行超声波破碎，释放细胞内的多角体，用碳 酸缓冲液裂解，经15% SDS-PAGE凝胶电泳后转移到PVDF膜上，进行Western Blotting 检测，对固定入多角体内的重组神经毒素 Anntoxin进行鉴定，检测多角体用的一抗是鼠抗 6父把8的单克隆抗体（1:1，000)，二抗是！1即标记的羊抗鼠186抗体（1 :1，000，市售）， 最后使用ECL化学发光检测试剂盒(市售）显色并拍照，如图3所示，能特异性的检测到一 条分子量较小、大小约为9 KDa的蛋白条带，与预测的重组神经毒素 Anntoxin分子量大小 一致，证明这是重组神经毒素 Anntoxin，这说明除多角体蛋白外，多角体内还含有神经毒素 Anntoxin,这一结果表明利用多角体固定神经毒素 Anntoxin蛋白成功。
[0037] 神经毒素 Anntoxin基因的序列见基因数据库GenBank，编号FJ598043. 1，具体如 下： ATGAAGACTTCTGTGGTTTTCTTGGTTGTCCTCGCTGCCGGCCTCTTCCTGCTGTCAGAAGGCGCTCAAGAT TATAGATGTCAGTTATCTAGGAATTATGGGAAAGGAAGTGGTTCTTTTACCAATTATTACTACGATAAAGCAACAAG CTCCTGTAAGACATTCAGATACCGCGGCTCCGGGGGAAATGGCAATAGATTCAAAACCCTCGAGGATTGTGAGGCGA CCTGCGTGACAGCAGAATAA (SEQ ID NO. 3)〇
[0038] 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的 限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。 SEQUENCE LISTING 〈110>浙江省海洋开发研究院 〈120> -种防止神经毒素 Anntoxin失活的方法 <130> 2014.03.21 <160> 3 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 27 <212> DNA 〈213>人工序列 <400> 1 ggatccatga agacttctgt ggttttc 27 <210> 2 <211> 24 <212> DNA 〈213>人工序列 〈400> 2 tctagattct gctgtcacgc aggt 24 <210> 3 <211> 246 〈212> DNA 〈213> 雨蛙 〈400> 3 atgaagactt ctgtggtttt cttggttgtc ctcgctgccg gcctcttcct gctgtcagaa 60 ggcgctcaag attatagatg tcagttatct aggaattatg ggaaaggaag tggttctttt 120 accaattatt actacgataa agcaacaagc tcctgtaaga cattcagata ccgcggctcc 180 gggggaaatg gcaatagatt caaaaccctc gaggattgtg aggcgacctg cgtgacagca 240 gaataa 246
【权利要求】
1. 一种防止神经毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 神经毒素 Anntoxin基因的克隆： 以从华西雨蛙抽提的总RNA为模板，利用RT-PCR扩增反应得到神经毒素 基因；RT-PCR扩增反应所用的引物包括正向引物和反向引物，正向引物的序列见SEQ ID NO. 1，反向引物的序列见SEQ ID NO. 2 ; 利用琼脂糖凝胶电泳对神经毒素基因进行PCR产物分析和纯化，随后将PCR 产物克隆进pGEM-T Easy载体，得到pGEM-T Easy-J/wiiori/?重组载体； (2) 含有神经毒素 Anntoxin基因的重组杆状病毒的构建： 用限制性内切酶汉和ZAa/消化pGEM-T Easy-J/wiiori/?重组载体得到J/wioxi/? 基因片段，然后将基因片段克隆入杆状病毒转移载体pFastBacHTA得到重组的转 移载体； 将得到的重组的转移载体转化DH10BmBac(p〇lh+)感受态细胞，扩大培养后，用PCR扩 增的方法进行鉴定，提取阳性克隆的Bacmid DNA，将Bacmid DNA、阳离子脂质体和无血清 的TC-100培养基混合物在室温培育15min后转染对数生长期的家蚕Bm5细胞，将该转染后 的家蚕Bm5细胞先用无血清的TC-100培养基在27°C条件下培养5h，再用含有10%胎牛血 清的TC-100培养基在27 °C条件下培养120 h，收集上清进行二次感染，获得相应的重组 病毒，命名为 vBmBac(polh+)_Anntoxin; (3) 家蚕Bm5细胞内表达： 对家蚕Bm5细胞接种步骤（2)获得的重组病毒，在27°C下感染三天以进行感染表达，然 后离心收集家蚕Bm5细胞，用PBS缓冲液重悬后超声破碎，离心收集多角体粗提物，将多角 体粗提物加入Percoll细胞分离液与PBS缓冲液混合液中，离心后收集纯净的多角体，最 后将纯净的多角体悬浮于含0. 1%SDS的PBS缓冲液中，室温放置5 min，然后用PBS缓 冲液洗涤后得到最终纯化的内部固定有神经毒素 Anntoxin的多角体。
2. 根据权利要求1所述的一种防止神经毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于：所 述RT-PCR扩增反应参数为：一个循环，94°C模板变性5分钟；接着35个循环，94°C变性50 秒，57°C退火30秒，72°C延伸25秒；最后1个循环，72°C延伸7分钟。
3. 根据权利要求1或2所述的一种防止神经毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于： 步骤（2)所述扩大培养为：在含有50 yg/ml卡那霉素、7 yg/ml庆大霉素、10 yg/ml 四环素、100 yg/ml X-gal和40 yg/ml IPTG的LB固体培养基上室温培养48h。
4. 根据权利要求1或2所述的一种防止神经毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于： 步骤（2)中Bacmid DNA、阳离子脂质体和无血清的TC-100培养基混合物的制备方法为：将 2 μ g的Bacmid DNA、6 μ 1的阳离子脂质体加入聚苯乙烯锥形管内，补充无血清的TC-100培 养基至200 μ 1。
5. 根据权利要求1或2所述的一种防止神经毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于： 步骤（2)中二次感染具体为将收集的上清用含有10%胎牛血清的TC-100培养基在27°C条 件下培养96-120 h。
6. 根据权利要求1或2所述的一种防止神经毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于： 步骤（3)中Percoll细胞分离液与PBS缓冲液混合液中Percoll细胞分离液与PBS缓冲 液的体积比为9:1。
【文档编号】C12N7/01GK104059921SQ201410109882
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2014年3月24日
【发明者】相兴伟, 章耀, 周宇芳, 徐珊, 杨会成 申请人:浙江省海洋开发研究院