一种基于纤维载体的固定化漆酶及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于纤维载体的固定化漆酶及其制备方法和应用。所述基于纤维载体的固定化漆酶包括：作为载体的纤维、分布于所述纤维表面的活性分子、包覆所述纤维和活性分子的介孔氧化硅层以及包埋在所述介孔氧化硅层中的漆酶；其中所述介孔氧化硅层是所述活性分子催化有机硅烷在所述纤维表面沉积形成的。本发明的固定化漆酶的酶活回收率高、固定化效率高、重复使用性好且可操作性好；所述制备方法的反应条件温和，极大地保护了漆酶的活性；本发明的固定化漆酶可用于食品、纺织、纸浆造纸或污水处理等领域中。
【专利说明】一种基于纤维载体的固定化漆酶及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及固定化酶【技术领域】，尤其涉及一种基于纤维载体的固定化漆酶及其制备方法和在染料脱色中的应用。
【背景技术】
[0002]酶是生物体的生命活动中重要的催化物质，它控制着生物体的整个新陈代谢。在生物体外，酶因其高效专一的特点被广泛用于制药、食品和酿造等领域。但是，当酶离开了生物体这个相对稳定且条件温和的环境，就变得极其脆弱。在高温、强酸性或碱性、有机溶剂的环境中特别容易变性失活，使酶在工业中的广泛应用受到限制。并且由于酶在反应体系中不易被分离，导致酶不能反复多次使用，增加了成本，还给产品提纯带来了困难。为了解决这些问题，在上个世纪六十年代兴起了酶的固定化技术，开辟了酶工业的另一研究方向。酶固定材料通过其独特的表面特性与酶的表面相互作用，来控制酶的空间构象，使酶固定在材料表面并且有效地稳定其构象，让酶在相对苛刻的条件下发挥催化作用。
[0003]漆酶是一类含铜的多酚氧化酶，已证实其能广泛应用于造纸、纺织、污物处理、化工合成以及生物传感等工业领域。相比现今广泛采用的其他物理化学方法，使用漆酶能大幅度减少能量的投入和环境不友好化合物的使用。但类似工业领域的真正应用要求漆酶具有足够的稳定性、良好的可操作性、能够重复使用及便于分离等性能。
[0004]因此，固定化漆酶的研究成为实现漆酶工业化应用的一个手段之一，而被广泛研究。目前，已经开发出的固定化漆酶的技术大致分为三类:物理吸附法、化学键连接法和包埋法。物理吸附法一般采 用比表面积大的微纳米材料作为载体，利用静电、亲疏水性等将漆酶吸附在材料表面。这种方法简单，且通常涉及的固定化条件较温和，但由于这种方法本身可设计程度低，难以保证固定化效率，使用中已经吸附在载体表面的漆酶也很容易再脱附离开载体。化学键连接法通常利用化学反应生成的化学键将漆酶固定在载体材料上。这种方法可设计性高，化学键保证了漆酶和材料之间可靠的连接，但是化学连接反应中，可能涉及到对于自由漆酶活力损伤性比较大的反应条件和化学分子。因此，这种方法的缺点是酶活回收率低。包埋法通常利用多孔材料做载体，将漆酶约束在材料内部，从而实现漆酶的固定和载体材料对漆酶的保护。通常，这种方法具有较高的固定化效率，在固定化过程中对漆酶活力的保护也较好，使用过程中酶的泄露少；但是由于包裹在载体内部的漆酶，很难参与到后续的反应，其酶活回收率不见得很高。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的不足，本发明提供一种基于纤维载体的固定化漆酶及其制备方法和在染料脱色中的应用。所述固定化漆酶的酶活回收率高、固定化效率高、重复使用性好且可操作性好；所述制备方法的反应条件温和，极大地保护了漆酶的活性。
[0006]在第一方面，本发明提供一种基于纤维载体的固定化漆酶，包括:作为载体的纤维、分布于所述纤维表面的活性分子、包覆所述纤维和活性分子的介孔氧化硅层以及包埋在所述介孔氧化硅层中的漆酶；其中所述介孔氧化硅层是所述活性分子催化有机硅烷在所述纤维表面沉积形成的。
[0007]本发明中，所述纤维表面的活性分子的突出特点在于具有在生理条件(例如常温、常压、PH值中性附近以及水相条件)下催化有机硅烷在纤维表面沉积形成介孔氧化硅层的特性。因此，任何具有这种催化特性的活性分子均可用于本发明中。本发明的实施方案中采用的活性分子具有胺基。因此，作为本发明的优选方案，所述活性分子具有胺基，其胺基具有催化有机硅烷在纤维表面沉积形成介孔氧化硅层的特性。
[0008]优选地，所述活性分子是胺基含量很高的分子，例如所述活性分子选自聚甲基丙烯酸N，N- 二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)、聚醚酰亚胺(PEI)或它们的共聚物。
[0009]本发明中，可以通过层层自组装、表面接枝和/或表面引发聚合将所述活性分子修饰到所述纤维表面。本领域技术人员可以根据其具备的专业知识和现有技术实现，比如Marc R.Knecht等利用多胺基的树枝状高分子做模板和催化剂，在其上矿化氧化硅小球(Langmuir2004, 20(11)，pp4728 - 4732),Fen Zhou等利用富含胺基的多孔微凝胶作为模板，催化氧化娃原位沉积(Langmuir2007, 23(19)，pp9737 - 9744),Dong Jin Kim等在金表面修饰上富含胺基的PDMAEMA，催化沉积氧化硅层(Langmuir2004，20 (19)，pp7904_7906)。
[0010]本发明中，所述纤维可以是各种加工方式制备的各种高分子纤维，例如所述纤维可以选自聚苯乙烯纤维、聚对苯二甲酸乙二醇酯纤维、聚乙烯纤维、聚丙烯纤维、聚醚酰亚胺纤维、尼龙纤维、纤维素纤维和/或蚕丝蛋白纤维。优选地，所述纤维的直径为50nm~50 μ m,例如 80nm、120nm、200nm、300nm、500nm、800nm、900nm、1.2 μ m、2μ m、5μ m、8μ m、10 μ m、20 μ m、35 μ m、40 μ m、45 μ m或48 μ m,以及这些具体点值中任意两个之间的范围。
[0011]本发明中，可以通过直接纺丝法、纺丝-机械(化学)剥离法、共混纺丝-溶解(水解)剥离法等工艺得到所述纤维`。本领域技术人员可以根据其具备的专业知识和现有技术实现，如张大省等(北京服装学院学报2004，24(2)，pp62-68.)综述了直接纺丝法制备超细涤纶、超细尼龙、超细聚丙烯腈纤维；纺丝-机械剥离法，或者纺丝-化学剥离法制备尼龙/聚乙烯、尼龙/聚苯乙烯复合超细纤维；以及共混纺丝-溶解剥离法制备的超细尼龙/聚乙烯“海岛”状结构纤维。
[0012]作为本发明的优选方案，所述介孔氧化硅层的厚度为IOnm~10 μ m，例如12nm、20nm、50nm、80nm、150nm、200nm、400nm、700nm、900nm、1.2 μ m、1.5 μ m、2 μ m、3 μ m、5 μ m、
8μ m、9 μ m或9.5 μ m，以及这些具体点值中任意两个之间的范围。所述介孔氧化娃层的厚度由固定化反应时间和硅烷分子浓度决定。其中，介孔氧化硅层中的氧化硅可以是二氧化硅，也可以是具有某些活性基团的氧化硅沉积物。
[0013]作为本发明的优选方案，所述有机硅烷为能在水中水解和缩合的硅烷。优选地，所述有机硅烷选自四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷、二甲氧基硅烷、3-疏丙基二乙氧基硅烷、氣丙基二乙氧基硅烷、3- (2, 3-环氧丙氧)丙基二甲氧基硅烷、3-氨丙基二乙氧基硅烷和/或乙烯基三甲氧基硅烷。可以单独使用上述任一种有机硅烷，也可以混合使用两种或两种以上上述有机硅烷，优选单独使用。
[0014]本发明中，所述漆酶可以是任何来源于植物、微生物和/或动物的任何种类和形式的漆酶。
[0015]在第二方面，本发明提供一种制备第一方面所述的固定化漆酶的方法，包括:将表面具有所述活性分子的纤维浸泡于含有所述有机硅烷和漆酶的溶液中，待所述有机硅烷在所述纤维表面沉积形成介孔氧化硅层，并将所述漆酶包埋在所述介孔氧化硅层中，得到所述固定化漆酶。
[0016]其中，所述表面具有所述活性分子的纤维可以是通过层层自组装、表面接枝和/或表面引发聚合将活性分子修饰到纤维表面得到的，也可以直接制备富含胺基的超细纤维；所述活性分子具有在生理条件(例如常温、常压、PH值中性附近以及水相条件)下催化有机硅烷在纤维表面沉积形成介孔氧化硅层的特性。所述活性分子、纤维和有机硅烷的具体选择如第一方面所述，在此不再赘述。
[0017]所述含有所述有机硅烷和漆酶的溶液，可以分别先配制有机硅烷溶液和漆酶溶液，然后混合得到混合溶液；也可以同时将有机硅烷和漆酶溶于溶剂中得到混合溶液；优选先分别配制再混合得到混合溶液。其中，溶剂可以是普通水、去离子水或双蒸水等，优选去离子水。
[0018]作为本发明的优选方案，所述方法包括:将表面具有所述活性分子的纤维以0.05-5mg纤维/mL溶液的量，浸泡于含有0.01-1mM有机硅烷、0.1-lOmg/mL漆酶和0.0Ol-1mM氢离子的溶液中，在4-30V下浸泡0.1-48小时，得到所述固定化漆酶。
[0019]优选地，所述纤维的量为0.1-1mg纤维/mL溶液，例如0.1lmg纤维/mL溶液、0.12mg纤维/mL溶液、0.15mg纤维/mL溶液、0.2mg纤维/mL溶液、0.4mg纤维/mL溶液、0.7mg纤维/mL溶液、0.9mg纤维/mL溶液、0.95mg纤维/mL溶液或0.98mg纤维/mL溶液，以及这些具体点值中任意两个之间的范围；优选为0.2-0.Smg纤维/mL溶液，更优选0.3-0.6mg 纤维 /mL 溶液。
[0020]优选地，所述溶液中有机硅烷的浓度为0.02-0.8mM,例如0.025mM、0.03mM、0.05mM、0.08mM、0.09mM、0.llmM、0.15mM、0.18mM、0.25mM、0.4mM、0.6mM、0.7mM、0.75mM或0.78mM,以及这些具体点值中任意两个之间的范围；优选为0.05-0.5mM，更优选为0.1-0.3mM。
[0021]优选地，所述溶液中漆酶的浓度为0.2-8mg/mL,例如0.25mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.7mg/mL、0.9mg/mL、l.lmg/mL、l.5mg/mL、l.9mg/mL、2.lmg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6.5mg/mL、6.8mg/mL、7.2mg/mL、7.5mg/mL或7.9mg/mL,以及这些具体点值中任意两个之间的范围；优选为0.5-5mg/mL,更优选为0.8_2mg/mL。
[0022]优选地，所述溶液中氢离子的浓度为0.001-0.8mM,例如0.003mM、0.005mM、0.007mM、0.01mM、0.03mM、0.05mM、0.llmM、0.15mM、0.18mM、0.25mM、0.4mM、0.48mM、0.52mM、0.60mM、0.75mM或0.78mM,以及这些具体点值中任意两个之间的范围；优选为0.005-0.5mM,更优选为 0.05-0.1mM。
[0023]优选地，所述溶液中氢离子的来源为盐酸、硫酸和/或硝酸，也可以是其它强酸或弱酸。
[0024]优选地，在8-25°C下浸泡0.5-24小时，浸泡温度例如9°C、10°C、12°C、15°C、17°C、19°C、21°C、23°C或2 4°C，以及这些具体点值中任意两个之间的范围；浸泡时间例如0.6小时、0.8小时、1.2小时、1.8小时、2.5小时、4小时、8小时、12小时、15小时、18小时、20小时、22小时、23小时或23.5小时，以及这些具体点值中任意两个之间的范围；优选为在12-20°C下浸泡1-12小时。[0025]在第三方面，本发明提供一种第一方面所述的固定化漆酶在食品、纺织、纸浆造纸或污水处理中的应用，优选染料脱色中的应用。
[0026]本发明的有益效果为:本发明的漆酶固定化在常温、常压、水相、pH中性附近等十分温和的反应条件下进行，极大地保护了漆酶的活性；所述方法采用在载体纤维表面用介孔氧化硅包埋的方法固定漆酶，解决了传统吸附法固定化效率低的问题，以及包埋法和传统的纤维表面共价接枝漆酶法的酶活力回收率低的问题。而且，比起微纳米颗粒作为载体的固定化漆酶，本发明的固定化漆酶具有更强的重复使用性和可操作性。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为本发明的固定化漆酶的反应原理示意图和结构示意图，其中I表示载体纤维，2表示活性分子，3表示介孔氧化硅层，4表示漆酶。
[0028]图2为本发明实施例1中超细纤维在固定漆酶之前的扫面电镜图片(a和c)以及固定漆酶之后的扫描电镜图片(b和d)，显示固定漆酶之后超细纤维表面有包覆物。
[0029]图3为本发明实施例1中制备固定化漆酶的过程中，随着固定化时间的变化，漆酶和硅烷水解物混合溶液中的漆酶含量的变化，可见固定化120min时得到漆酶固定化效率为 98%ο
[0030]图4为本发明实施例1中制备的固定化漆酶与自由漆酶在高温(60°C)条件下，酶活力随时间的变化。
[0031]图5为本发明实施例1中制备的固定化漆酶与自由漆酶分别与蛋白酶K共孵育(37°C，蛋白酶K浓度为100 μ g/mL, 50mM Tris-HCl，ρΗ7.5)时，酶活力随时间的变化。
[0032]图6为本发明实施例1中制备的固定化漆酶重复使用时酶活力随使用次数的变化。`
[0033]图7为本发明实施例1中制备的固定化漆酶和自由漆酶对活性艳蓝KN-R的脱色率随时间的变化(a)，以及重复使用固定化漆酶对活性艳蓝KN-R脱色时，每一天对新的活性艳蓝KN-R的脱色效率随重复使用次数(每天重复使用一次)的变化(b)。
【具体实施方式】
[0034]下面结合附图并通过【具体实施方式】详细描述本发明。
[0035]如图1所示，本发明提供的基于纤维载体的固定化漆酶，包括:作为载体的纤维1、分布于所述纤维I表面的活性分子2、包覆所述纤维I和活性分子2的介孔氧化硅层3以及包埋在所述介孔氧化硅层3中的漆酶4 ;其中所述介孔氧化硅层3是所述活性分子2催化有机硅烷在所述纤维I表面沉积形成的。
[0036]本发明的沉积反应，在生理条件(例如常温、常压、pH值中性附近以及水相条件)下，由活性分子2催化有机硅烷在纤维I表面沉积形成介孔氧化硅层3，同时将漆酶4包埋在介孔氧化硅层3中形成固定化漆酶。本发明的沉积反应不需要苛刻条件，保护了漆酶的活性。
[0037]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。[0038]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
[0039]实施例1
[0040]本实例中，采用最难修饰的聚苯乙烯(PS)静电纺丝超细纤维作为固定化漆酶的载体，该纤维的平均直径为700nm。
[0041]首先，取IOmg纤维浸没在9.8M的浓硫酸中，5min后捞出，用去离子水反复漂洗，直到漂洗前后，漂洗液体PH值不再变化。其后，将纤维浸泡在lmg/mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDADMAC)的水溶液，IOmin后将纤维捞出，用去离子水洗涤3次，然后泡在lmg/mL的聚丙烯酸接枝烷基溴(PAA-g-Alkyl Bromide)水溶液中，IOmin后,捞出纤维,用去离子水洗涤3次。重复上述PDADMAC和PAA-g-Alkyl Bromide水溶液浸泡并洗涤的操作2次。其后，将IOmg纤维分散在16mL水中，并在其中加入2mL甲基丙烯酸N，N- 二甲基氨基乙酯(DMAEMA)和8mg2，2-联吡唆，冻-抽-融操作3次后，在气体保护下，加入5mg溴化亚铜(CuBr)，常温下过夜搅拌。至此，聚苯乙烯(PS)纤维上修饰上了富胺基的PDMAEMA。
[0042]在ImM盐酸中配制浓度为ImM的3_巯丙基三乙氧基硅烷，静置直到观察溶液清澈透明。称取漆酶20mg，分散在ISmL去离子水中，反复震荡，直至溶液清澈透明。将漆酶溶液与2mL硅烷溶液混合，再将IOmg修饰好的纤维浸没在混合溶液中，常温下2h或者4°C过夜，即可得到固定化漆酶。固定漆酶前后纤维的形貌变化如图2所示。相比固定漆酶之前，固定漆酶后的纤维表面变得粗糙，纤维直径变大，纤维表面可以观察到硅壳。
[0043]实施例2:在聚苯乙烯(PS)超细纤维表面固定化漆酶
[0044]取IOmg纤维(同实施例1)浸没在9.8M的浓硫酸中，5min后捞出，用去离子水反复漂洗，直到漂洗前后，漂洗液体PH值不再变化。其后，将纤维浸泡在lmg/mL的聚醚酰亚胺(PEI)的水溶液中，IOmin 后将纤维捞出，用去离子水洗涤3次，然后泡在lmg/mL的聚丙烯酸(PAA)水溶液中，IOmin后，捞出纤维，用去离子水洗涤3次。重复上述PEI和PAA水溶液浸泡并洗涤的操作2次，最后再重复一次PEI水溶液中的浸泡与漂洗。由于PEI分子本身富含胺基，至此，聚苯乙烯(PS)纤维表面引入了富含胺基的分子。
[0045]在ImM盐酸中配制浓度为ImM的3_巯丙基三乙氧基硅烷，静置直到观察溶液清澈透明。称取漆酶20mg，分散在ISmL去离子水中，反复震荡，直至溶液清澈透明。将漆酶溶液与2mL硅烷溶液混合，再将IOmg修饰好的纤维浸没在混合溶液中，常温下12h或者4°C静置两天，即可得到固定化漆酶。
[0046]实施例3:在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)超细纤维表面固定化漆酶
[0047]本实施例中，采用PET纱线为载体，该载体纤维平均直径为50 μ m。
[0048]首先，取IOmg纤维浸没在9.8M的浓硫酸中，5min后捞出，用去离子水反复漂洗，直到漂洗前后，漂洗液体PH值不再变化。其后，将纤维浸泡在lmg/mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDADMAC)的水溶液，IOmin后将纤维捞出，用去离子水洗涤3次，然后泡在lmg/mL的聚丙烯酸接枝烷基溴(PAA-g-AlkylBromide)水溶液中，IOmin后,捞出纤维,用去离子水洗涤3次。重复上述PDADMAC和PAA-g-Alkyl Bromide水溶液浸泡并洗涤的操作2次。其后，将IOmg纤维分散在16mL水中，并在其中加入2mL DMAEMA和8mg2，2-联吡唆，冻-抽-融操作3次后，在气体保护下，加入5mg CuBr，常温下过夜搅拌。至此，PET纤维上修饰上了富胺基的I3DMAEMA。[0049]在ImM盐酸中配制浓度为ImM的3_巯丙基三乙氧基硅烷，静置直到观察溶液清澈透明。称取漆酶20mg，分散在ISmL去离子水中，反复震荡，直至溶液清澈透明。将漆酶溶液与2mL硅烷溶液混合，再将IOmg修饰好的纤维浸没在混合溶液中，常温下2h或者4°C过夜，即可得到固定化漆酶。
[0050]实施例4
[0051]本实施例与实施例1的不同点在于，漆酶固定过程如下:在0.1mM硫酸中配制浓度为0.2mM的氯丙基三乙氧基硅烷，静置直到观察溶液清澈透明。称取漆酶4mg，分散在18mL去离子水中，反复震荡，直至溶液清澈透明。将漆酶溶液与2mL硅烷溶液混合，再将IOmg修饰好的纤维浸没在混合溶液中，常温下12h，即可得到固定化漆酶。
[0052]实施例5
[0053]本实施例与实施例1的不同点在于，漆酶固定过程如下:在2mM盐酸中配制浓度为5mM的四乙氧基硅烷，静置直到观察溶液清澈透明。称取漆酶50mg，分散在38mL去离子水中，反复震荡，直至溶液清澈透明。将漆酶溶液与2mL硅烷溶液混合，再将40mg修饰好的纤维浸没在混合溶液中，8°C下6h，即可得到固定化漆酶。
[0054]实施例6
[0055]本实施例与实施例1的不同点在于，漆酶固定过程如下:在5mM盐酸中配制浓度为IOmM的四甲氧基硅烷，静置直到观察溶液清澈透明。称取漆酶80mg，分散在98mL去离子水中，反复震荡，直至溶液清澈透明。将漆酶溶液与2mL硅烷溶液混合，再将IOOmg修饰好的纤维浸没在混合溶液中，30°C下0.5h，即可得到固定化漆酶。 [0056]实施例7
[0057]本实施例与实施例2的不同点在于，漆酶固定过程如下:在3mM盐酸中配制浓度为IOmM的3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，静置直到观察溶液清澈透明。称取漆酶50mg，分散在58mL去离子水中，反复震荡，直至溶液清澈透明。将漆酶溶液与2mL硅烷溶液混合，再将50mg修饰好的纤维浸没在混合溶液中，15°C下2h，即可得到固定化漆酶。
[0058]试验例1:固定化漆酶与自由漆酶活力的测试
[0059]配制0.5mM2, 2_联氮-二(3-乙基-苯并噻唑_6_磺酸)二铵盐(ABTS)水溶液。取固定化漆酶(实施例1)约lmg，lmg/mL的自由漆酶水溶液0.1mL分别加入3mL和2.9mLABTS水溶液，震荡lmin。测其在420nm出的吸光度值。
[0060]试验例2:固定化效率和酶活力回收率测试
[0061]在实施例1的固定化过程中，不断检测漆酶硅烷水解物混合液中漆酶的含量随固定化时间的变化，结果如图3所示。固定开始时(Omin)，漆酶和硅烷水解物混合液中的漆酶含量与某时刻混合液中漆酶含量的差值，即为该时刻固定在超细纤维上的漆酶的量。由图3可以看出，在常温固定120min后，固定化效率达到了 98%，而酶活力回收实验表明，酶活力回收率达到了 94%。
[0062]试验例3:固定化漆酶在高温下的稳定性
[0063]将固定化漆酶(实施例1)和lmg/mL的自由漆酶置于60°C水浴锅内，每隔30min取出漆酶，测定其活力值。以水浴Omin时，漆酶的活力值为100%，将活力值对水浴时间作图，得到图4所示的结果。由图4可知，固定化漆酶的活力在高温下比自由漆酶的活力要稳定很多。[0064]试验例4:固定化漆酶在蛋白酶K存在时的稳定性
[0065]将固定化漆酶(实施例1)和lmg/mL的自由漆酶分别加入含有蛋白酶K的缓冲液(100 μ g/mL，50mM Tris-HCl, pH7.5)，并置于37°C水浴锅内，每隔一段时间取出漆酶，测定其活力值。以水浴Omin时，漆酶的活力值为100%，将活力值对水浴时间作图，得到图5所示的结果。由图5可知，固定化漆酶的活力在蛋白酶K存在时比自由漆酶的活力要稳定很多。
[0066]试验例5:固定化漆酶的重复使用稳定性
[0067]被固定在纤维上的漆酶，可以通过捞出纤维等操作很方便地实现固定化漆酶与反应体系的分离。当需要再次使用漆酶时，再将固定了漆酶的纤维浸泡入反应体系即可实现固定化漆酶的重复利用。为了测定固定化漆酶的重复使用性能，连续十次用同一个固定化漆酶(实施例1)与ABTS反应，并测其活力，具体操作同试验例1，重复十次试验例I操作，并且每一次更换新的ABTS溶液，每次操作后用去离子水清洗固定化漆酶三次。结果如图6所示。由图6可知，该固定化漆酶在第一次使用的时候酶活力下降幅度最大，但也不到5%，从第二次开始，固定化漆酶的活力几乎不变。说明该固定化漆酶有良好的可重复使用的性能，且固定化后的漆酶不容易脱离载体。
[0068]试验例6:固定化漆酶对活性艳蓝KN-R脱色的研究
[0069]取2mg固定化漆酶(实施例1 )，和0.1mL浓度为lmg/mL的自由漆酶水溶液，分别加入IOOmL浓度为lmg/mL的活性艳蓝KN-R，37°C下水浴。每隔一段时间，取样品少量，测试其在565nm处的吸光度值，换算出脱色效率，结果如图7a所示，由图7a可以看出，固定化漆酶最终脱色效率要高于自由漆酶。
[0070]用同一固定化漆酶连续十天处理十批新的活性艳蓝KN-R，每天更换一次新的活性艳蓝染料溶液。结果如图7b所示，该固定化漆酶能稳定工作6天，但是从第5天开始，明显感觉固定化漆酶的纤维变软，开始在反应器底部出现固定化漆酶的碎屑，从而导致固定化漆酶酶活力损失，该现象在第6`天后加剧，固定化漆酶的纤维碎屑增多，固定化漆酶活力损失严重。可以预料:更换更加稳固的纤维载体，或者选择直径更粗的纤维载体，该现象能得到明显改善。
[0071] 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属【技术领域】的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【权利要求】
1.一种基于纤维载体的固定化漆酶，包括:作为载体的纤维、分布于所述纤维表面的活性分子、包覆所述纤维和活性分子的介孔氧化硅层以及包埋在所述介孔氧化硅层中的漆酶；其中所述介孔氧化硅层是所述活性分子催化有机硅烷在所述纤维表面沉积形成的。
2.根据权利要求1所述的固定化漆酶，其特征在于，所述活性分子具有胺基； 优选地，所述活性分子选自聚甲基丙烯酸N，N-二甲基氨基乙酯、聚醚酰亚胺或它们的共聚物。
3.根据权利要求1或2所述的固定化漆酶，其特征在于，通过层层自组装、表面接枝和/或表面引发聚合将所述活性分子修饰到所述纤维表面。
4.根据权利要求1-3任一项所述的固定化漆酶，其特征在于，所述纤维选自聚苯乙烯纤维、聚对苯二甲酸乙二醇酯纤维、聚乙烯纤维、聚丙烯纤维、聚醚酰亚胺纤维、尼龙纤维、纤维素纤维和/或蚕丝蛋白纤维； 优选地，所述纤维的直径为50nm~50 μ m ; 优选地,所述纤维是通过直接纺丝法、纺丝-机械剥离法、纺丝-化学剥离法或共混纺丝-溶解剥离法工艺得到的。
5.根据权利要求1-4任一项所述的固定化漆酶，其特征在于，所述介孔氧化硅层的厚度为IOnm~10 μ m。
6.根据权利要求1-5任一项所述的固定化漆酶，其特征在于，所述有机硅烷为能在水中水解和缩合的硅烷； 优选地，所述有机硅烷选自·四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷、三甲氧基硅烷、3-巯丙基三乙氧基硅烷、氣丙基二乙氧基硅烷、3- (2, 3-环氧丙氧)丙基二甲氧基硅烷、3_氛丙基二乙氧基硅烷和/或乙烯基二甲氧基硅烷。
7.一种制备权利要求1-6任一项所述的固定化漆酶的方法，包括:将表面具有所述活性分子的纤维浸泡于含有所述有机硅烷和漆酶的溶液中，待所述有机硅烷在所述纤维表面沉积形成介孔氧化硅层，并将所述漆酶包埋在所述介孔氧化硅层中，得到所述固定化漆酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括:将表面具有所述活性分子的纤维以0.05_5mg纤维/mL溶液的量，浸泡于含有0.01-1mM有机硅烷、0.1-lOmg/mL漆酶和0.0Ol-1mM氢离子的溶液中，在4-30°C下浸泡0.1-48小时，得到所述固定化漆酶。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述纤维的量为0.1-1mg纤维/mL溶液，优选为0.2-0.8mg纤维/mL溶液，更优选0.3-0.6mg纤维/mL溶液； 优选地，所述溶液中有机硅烷的浓度为0.02-0.8mM,优选为0.05-0.5mM,更优选为0.1-0.3mM ； 优选地，所述溶液中漆酶的浓度为0.2-8mg/mL,优选为0.5-5mg/mL,更优选为0.8_2mg/mL ； 优选地，所述溶液中氢离子的浓度为0.001-0.8mM，优选为0.005-0.5mM,更优选为0.05-0.1mM ； 优选地，所述溶液中氢离子的来源为盐酸、硫酸和/或硝酸； 优选地，在8-25°C下浸泡0.5-24小时，优选为在12_20°C下浸泡1_12小时。
10.一种权利要求1-6任一项所述的固定化漆酶在食品、纺织、纸浆造纸或污水处理中的应用。
【文档编号】C12N11/14GK103849616SQ201410112485
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月25日 优先权日:2014年3月25日
【发明者】蒋兴宇, 王铈汶, 孙佳姝, 陈威 申请人:国家纳米科学中心