磁驱固定化酶、制备方法及其在大水体催化中的应用的制作方法
【专利摘要】磁驱固定化酶、制备方法及其在大水体催化中的应用，属于酶固定化载体合成及酶固定化【技术领域】。该磁驱固定化酶是以纳米尺度的顺磁性铁粒子为磁驱动核心，以氨基、羧基或巯基基团化试剂修饰的硅基材料为外壳；目标酶或基因工程改造酶通过基团化试剂引入的官能化基团固定化在硅基材料的外壳上，进而形成的单一酶单层磁驱固定化酶、单一酶单层定取向磁驱固定化酶、多种酶单层定比例磁驱固定化酶或多种酶单层定取向定比例磁驱固定化酶。本发明利用硅基化外壳包埋铁粒子，一方面延长酶使用时间；一方面利用硅基材料的大比表面积和表面可进行官能团修饰的性质赋予酶制剂以磁释放、驱动和回收能力，可以在大水体催化反应中得到应用。
【专利说明】磁驱固定化酶、制备方法及其在大水体催化中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于酶固定化载体合成及酶固定化【技术领域】，具体涉及一种具有高稳定性、磁释放、磁回收、磁驱动、高可重复利用率的磁驱固定化酶、制备方法以及其在大水体催化反应中的应用。
【背景技术】
[0002]生物催化剂，例如酶，具有催化的高效性、反应的专一性、反应条件的温和性等优点，越来越多的被用于工业生产。但是由于天然的酶往往存在着稳定性差、不能重复利用以及难于从反应体系中分离等缺点极大的限制了酶制剂的应用。为解决上述问题，拓宽生物催化材料的应用范围，酶固定化技术得以产生和发展。通过酶固定化技术，赋予了酶高稳定性和重复利用性，使得酶固定化技术在催化领域和环境友好绿色化学研究中有较好的发展前景。
[0003]传统的酶固定化技术，诸如共价联接、物理吸附、微囊包封以及半透膜或者凝胶包埋，存在着改变酶的构象或者结构发生改变(共价联接)、酶由于固定化材料的稳定性不佳而在使用的过程中出现从固定化材料中逃逸(物理吸附、微囊包封和凝胶包埋)、反应底物或者产物的理化性质限制酶固定化后的反应能力(微囊包封、凝胶包埋、半透膜)等缺点，同时上述酶固定化方法及技术除了难于解决大水体反应体系(如:污水处理)中酶制剂与反应体系的均匀混合、释放及回收难题外，在酶的固定化时还易于出现因酶固载量过高造成的酶分子之间的堆积，酶分子间的堆积将影响酶的结构和功能，降低单位有效酶活性，使得酶制剂的活性低于理论值。本发明的磁驱酶固定化载体制备技术可以同步解决上述问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一 种具有高稳定性、磁释放、磁回收、磁驱动、高可重复利用率的磁驱固定化酶、制备方法以及磁驱固定化酶在大水体催化反应中的应用。
[0005]本发明是通过构建一种磁驱酶固定化载体，实现对酶的单层固定化，该磁驱固定化酶适用于大水体催化反应，属于无机化学、物理化学和生物化学领域。该酶固定化载体是以纳米尺度铁粒子为磁驱核心，利用硅基材料对铁核心进行包埋，以具有能够载入材料表面官能团的三甲氧基烷为基团化试剂，构建磁驱酶固定化载体；利用酶与硅基载体表面修饰基团间特定相互作用和双功能交联剂构建单层磁驱固定化酶。利用该方法可以合成多种多功能磁驱固定化酶制剂，其特征在于，具有磁驱核心，硅基中间壳层，可选择官能团化载体表面，利用双功能交联剂实现多种酶的固定化。该磁驱固定化酶具有高稳定性、高可重复利用率等优点，在脉冲磁场作用下可以实现酶制剂的释放、驱动和回收。本发明可用于制备针对大水体催化反应的酶制剂制备和应用。
[0006]本发明所述的磁驱固定化酶，是以纳米尺度的顺磁性铁粒子为磁驱动核心，以氨基、羧基或巯基基团化试剂修饰的硅基材料为外壳；目标酶或基因工程改造酶通过基团化试剂引入的官能化基团固定化在硅基材料的外壳上，进而形成的单一酶单层磁驱固定化酶、单一酶单层定取向磁驱固定化酶、多种酶单层定比例磁驱固定化酶或多种酶单层定取向定比例磁驱固定化酶。
[0007]本发明采用纳米尺度(直径20纳米以内)的顺磁性铁粒子作为磁驱动核心，利用在水溶液中具有高稳定性的硅基材料在铁粒子表面形成硅基外壳(厚度20~100纳米)，以基团化试剂对硅基外壳进行修饰，从而在硅基外壳表面引入官能化基团(如:氨基、羧基、巯基等)，利用目标酶分子与官能化基团间相互作用进行目标酶蛋白的固定，从而得到单一酶单层磁驱固定化酶、单一酶单层定取向磁驱固定化酶、多种酶单层定比例磁驱固定化酶和多种酶单层定取向定比例磁驱固定化酶。该磁驱固定化酶能够在脉冲磁场作用下进行释放、驱动和回收，适用于大水体催化反应。
[0008]与【背景技术】相比:
[0009]1)利用纳米尺度顺磁性铁粒子作为磁驱动核心，解决酶制剂处理大水体样本(如:污水)时的酶制剂的释放、驱动和回收；
[0010]2)利用硅基化外壳包埋铁粒子，一方面利用硅基材料的水溶剂中的稳定性对铁核心进行保护，延长其使用时间；一方面利用硅基材料的大比表面积和表面可进行官能团修饰的性质，使得该材料可以进行酶的固定化，同时赋予固定化后制备的酶制剂以磁释放、驱动和回收能力；
[0011]3)利用硅基表面的官能团与酶分子的相互作用实现酶的定量、定比例、定取向、单层固定化，解决【背景技术】中的酶分子过度固定化和堆积造成的单位有效酶活性下降的问题，实现酶固定化后的最大活性保持；
[0012]4)由于酶进行了定取向、定量的磁驱载体表面固定化，与【背景技术】相比，磁驱固定化酶制剂的催化不受产物及底物理化性质局限，与游离酶在溶剂中反应时的底物接触和产物释放能力相似；
[0013]5)由于对酶进行了单层固定化，磁驱固定化载体与酶分子之间的距离进行了有效调控，降低了环境pH、温度、离子强度、蛋白水解酶等物理、化学以及生物因素对固定化酶制剂的稳定性和生物利用度的影响；
[0014]6)该固定化酶需要在脉冲磁场的作用下进行释放、驱动和回收，磁场脉冲频率与脉冲宽度与水体体积和面积有关，磁场强度与酶在磁场下的活性变化能力及水体溶剂条件有关。
[0015]本发明涉及一种磁驱固定化酶及其制备方法，酶固定化进程中存在三个层次，SP(a)酶催化小分子底物反应，其特征在于，固定在载体表面的酶分子取向不影响酶的生物功能，即，单一酶单层磁驱固定化酶；(b)酶催化大分子底物或者产物反应，其特征在于，酶固定时在固定化载体表面的取向影响酶的生物活性，即，单一酶单层定取向磁驱固定化酶；(C)在执行目的反应时，需要一种以上的酶共同存在于同一个固定化酶载体上，根据这些酶的反应效率，需要控制固定化酶载体上多种酶分子之间的比例需要进行定比例固定化，即，多种酶单层定比例磁驱固定化酶，根据这些酶在酶固定化载体表面固定时的取向和活动的关系即，多种酶单层定取向定比例磁驱固定化酶。
[0016]对于单一酶单层磁驱固定化酶由步骤I)~步骤4)所述方法制备；对于单一酶单层定取向磁驱固定化酶，包括利用步骤I)~步骤2)制备铁粒子-硅基核壳结构酶固定化载体，利用步骤5)进行目标酶的分子改造，利用步骤6)实现单一酶单层定取向磁驱酶固定化载体及单一酶单层定取向磁驱固定化酶制备制备；对于多种酶单层定比例固定化磁驱固定化酶和多种酶单层定取向定比例磁驱固定化酶，包括利用步骤I)~步骤2)制备铁粒子-硅基核壳结构酶固定化载体，利用步骤6a)实现单一酶单层定比例磁驱固定化载体制备，按照步骤7)实现多种酶单层定比例固定化磁驱固定化酶制备和多种酶单层定取向定比例磁驱固定化酶制备。
[0017]本发明的具体操作步骤如下:
[0018]I)制备作为磁驱动核心的纳米尺度铁粒子:将摩尔比为1:1的二价铁盐与三价铁盐在pH=4.0~6.0的去离子水中混合，其中二价铁盐可以是硫酸亚铁、硝酸亚铁以及氯化亚铁等，三价铁盐为硫酸铁、硝酸铁、氯化铁等，然后将上述铁盐的酸性反应体系在50~70°C水浴条件下温和振荡(利用悬垂臂搅拌器进行搅拌混合，转速为150~300转每分钟)20~50分钟，再加入质量体积百分比为25%的浓氨水使得反应体系的pH=10~11，继续在50~70°C水浴条件下温和振动20~40分钟；再加入15~30毫升油酸，继续在50~70°C水浴条件下温和振动20~40分钟，反应体系中形成的纳米尺度的铁粒子进入油酸层；最后磁选法收集铁粒子(磁场方向垂直于地磁场方向)，丙酮洗涤后晾干，铁粒子的直径在20nm以内(图O ;
[0019]2)以在水溶剂中高稳定性的硅基材料作为包覆磁驱核心的外壳，制备铁粒子-硅基核壳结构的磁驱酶固定化载体:将上述步骤合成的铁粒子加到乙醇中，浓度为0.15~
0.3毫克/毫升，室温下超声0.5~2小时，使得铁粒子充分分散在乙醇溶液内，移除不能悬浮在乙醇中的固体物质，然后在得到的铁粒子乙醇悬浊液中缓慢加入硅基化试剂，铁粒子与加入的硅基化试剂的质量比为1:10~15，硅基化试剂可以是正硅酸乙酯、正硅酸甲酯、水玻璃等，温和搅拌 过夜；用磁选法收集铁粒子-硅基核壳结构的磁驱酶固定化载体，乙醇洗涤后晾干，铁粒子-硅基核壳结构的磁驱酶固定化载体的直径在20~100纳米(图2)；
[0020]3)通过基团化试剂在硅基外壳上引入适当含量和组成的修饰基团(如:氨基、羧基、巯基等)，制备基团修饰的磁驱酶固定化载体:将步骤2)制备得到的铁粒子-硅基核壳结构的磁驱酶固定化载体在室温下超声分散到乙醇溶液中形成浓度为0.2~0.4毫克每毫升的乙醇悬浊液，将基团化试剂加入到上述悬浊液中，室温下温和搅拌8~14小时，确保基团化完全进行，用磁选法收集基团修饰的磁驱酶固定化载体，用乙醇洗涤后晾干。
[0021]该操作的特征在于:Ca)铁粒子-硅基核壳结构的磁驱酶固定化载体与基团化试剂的质量比为450~500:1 ；(b)基团化试剂为3-氨基丙基-三甲氧基硅烷、3-羧基丙基_ 二甲氧基硅烷、3-疏基丙基_ 二甲氧基硅烷等可以对娃基材料表面进行官能团化的二烷氧基硅烷；(C)修饰基团为氨基化、羧基化、巯基化等能够在硅基材料表面引入的化学基团。
[0022]4)单一酶单层磁驱动固定化酶制备，酶通过与磁驱载体上的修饰基团相互作用，利用双功能交联剂实现酶单层固定化:将基团修饰的磁驱酶固定化载体用磷酸缓冲液(50毫摩尔每升，pH7.4)进行3~5次的洗漆和磁选收集,最后将基团修饰的磁驱酶固定化载体分散于含质量百分比为2~10%双功能交联剂的磷酸缓冲液中进行活化，使得基团修饰的磁驱酶固定化载体的终浓度为1.6~6.7毫克每毫升；活化是在室温温和搅拌的条件下进行0.5~2小时。活化后的载体用磷酸缓冲液再进行3~5次的洗涤和磁选收集，去除未反应的游离的双功能交联剂；将收集后的载体与目标酶分子进行混合，室温下温和振荡8~14小时以确保酶的充分固定化；最后用磷酸缓冲液进行3~5次的磁选收集，从而得到单一酶单层磁驱固定化酶。
[0023]该操作的特征在于:(a)基团修饰的磁驱酶固定化载体与目标酶的质量比为1:3~9，酶分子溶解在50毫摩尔每升、pH=7.4的磷酸缓冲液中。(b)所说的双功能交联剂为戊二醛、丁二酸酐、己二酰亚胺酸二甲酯或双重氮联苯胺_2，2- 二磺酸等能够联接生物材料与磁驱酶固定化载体表面官能团的试剂。
[0024]适合上述操作的酶分子包括:辣根过氧化物酶、超氧化物歧化酶、单胺氧化酶、葡萄糖氧化酶、β_半乳糖苷酶、转氨酶、脱羧基酶、巯基转移酶等，属于氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和合成酶酶类中的以小分子为产物和底物的酶分子。这些酶在固定化时，酶在酶固定载体表面的分子取向不影响酶的活性。
[0025]5)当目标酶在载体表面的分子取向影响酶的活性时，需要先对酶分子本身进行基因工程改造，构建基因工程改造酶。
[0026]这里的酶分子包括，过氧化物酶、拓扑异构酶、连接酶、胶原酶、溶菌酶、脂肪水解酶等，属于氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和合成酶酶类中的以大分子为产物和底物的酶分子。这些酶在酶固定化载体表面得取向影响酶的活性。
[0027]原理及基因工程改造设计要求:利用分子生物技术结合生物信息学技术，在目标酶分子活性口袋和底物结合位点远端(如:Ν末端、C末端或者Loop区)插入成簇的巯基(cys)、氨基(Lys或Arg)、羧基(Glu或者Asp)侧链氨基酸中的两种或三种,构建富含特定的可与双功能交联剂进行反应的团簇区；各种组合中巯基是必须包括的基团，其主要起到酶的定向固定化作用，氨基或者羧基主要起到进一步加强酶的固定化作用；该团簇区实现了酶分子在基团修饰的磁驱酶固定化载体表面的定取向固定化，该操作提高固定化酶的单位有效酶活性。
[0028]操作方法:基 因工程改造酶的基因(DNA)序列可以通过化学合成完成，基因工程改造蛋白的表达、纯化与一般的基因工程蛋白表达纯化途径相同，可以依据一般的基因工程蛋白改造文献进行。该蛋白的表征采用紫外-可见吸收光谱和血红蛋白相同的活性检测方法。
[0029]6)基因工程改造酶与基团修饰磁驱酶固定化载体间的酶单层固定化，利用基因工程改造蛋白上引入的团簇区与基团修饰磁驱酶固定化载体表面特定基团间的特异相互作用实现酶的固定化。
[0030]具体实施方法如下:
[0031]a)单一酶单层定取向磁驱固定化酶载体的制备:考虑到经过步骤5)改造的基因工程改造酶，在其蛋白表面结构中添加了特定的富含巯基、氨基或者羧基的团簇区(巯基是必须包括的基团)，所以在基团修饰的磁驱酶固定化载体表面需要同时引入巯基、氨基或羧基修饰基团，与步骤3的区别在于，为了实现单一酶定取向磁驱固定化，这里需要在磁驱酶固定化载体表面引入一种以上的修饰基团。即，首先按照步骤3)中磁驱酶固定化载体的制备步骤，将步骤2)制备得到的铁粒子-硅基核壳结构的磁驱酶固定化载体在室温下超声分散到乙醇溶液中，形成浓度为0.2~0.4毫克每毫升的乙醇悬浊液，将包含巯基基团化试剂在内的两种或两种以上的基团化试剂，加入到上述悬浊液中，两种或两种以基团化试剂的用量(摩尔比为1:0.1~10:0.1~10)与酶自身结构性质和固定化载体表面性质有关(以酶固定化产品的比活作为判断指标)，室温下温和搅拌8~14小时，确保基团化完全进行，最后用磷酸缓冲液进行3~5次的磁选收集基团修饰的磁驱酶固定化载体，用乙醇洗涤后晾干，制得用于单一酶单层定取向磁驱固定化酶载体。
[0032]b)单一酶单层定取向磁驱酶固定化:将前面制备的单一酶单层定取向磁驱固定化酶载体与基因工程改造酶按质量比为1:3~9在50毫摩尔每升、pH=7.4的磷酸缓冲液中混合0.5~2小时，最后用磷酸缓冲液进行3~5次的磁选收集，从而得到基于二硫键的单一酶单层定取向磁驱固定化酶。
[0033]c)单层定取向磁驱酶固定化的二次固定化:由于二硫键对化学环境敏感，使得基于二硫键的单一酶单层定取向磁驱固定化酶使用范围不够宽，故需要进行利用双功能交联剂对上述单一酶单层定取向磁驱固定化酶进行二次固定化。
[0034]将前述操作中制备的基于二硫键的单一酶单层定取向磁驱固定化酶悬浮在磷酸缓冲液中，得到1.6~7毫克每毫升的悬浊液，然后加入酶的底物(这里选用酶底物中分子较小、来源较广、价格较低的分子，例如:葡萄糖、ABTS, L-dopa等)，使底物(实施例2和3中底物是ABTS，这里加底物主要是为了避免双功能交联剂加入时影响酶的活性中心的结构，用底物保护酶的活性中心，二次固定化时双功能交联剂是在酶进行一次固定化后再添加的，这时如果不用酶的底物对酶的活性中心进行封闭保护，双功能交联剂会影响酶的活性中心的结构和功能)与酶的摩尔比为50~100:1 ;再加入多羟基物质使其质量百分浓度为0.5~10%，加入双功能交联剂使其质量百分浓度为2~5%，室温下温和振荡0.5~4小时，使得二硫键固定的基因工程改造酶通过分子表面团簇内负责进一步加强酶的固定化的修饰基团(氨基或羧基)与单一酶单层定取向磁驱固定化酶载体表面负责进一步加强酶固定化的修饰基团(氨基或羧基)形成共价交联，从而实现酶的二次固定化，最后用磷酸缓冲液进行3~5次的磁选收集，从而得到二次固定化酶。
[0035]该操作中多羟基物质是葡萄糖、海藻糖、蔗糖、PEG等。该操作中，底物与多羟基物质的添加可以最大限度的抑制`双功能交联剂使用时对酶活性相关结构和功能的不利影响，提高酶的有效利用度。
[0036]7)需要固定一种以上的酶，实际生产和研究中往往需要制备固定多种酶的酶固定化制剂或多酶反应器。基于本专利中涉及的磁驱酶固定化载体，可以采用两种方法实现多酶固定化:
[0037]a)第一种是将两种或两种以上的目标酶混合后与用双功能交联剂活化好的基团修饰磁驱酶固定化载体直接混合进行固定化，即得到多种酶单层定比例磁驱固定化酶；
[0038]b)第二种是先按照步骤5)进行第一种目标的酶基因工程改造，然后按照步骤6)先进行第一种酶(基因工程改造酶)的基于二硫键的单层固定化和二次固定化，最后将该固定化酶悬浮在第二种目标酶的溶液中，其中固定化酶的浓度为1.6~7毫克每毫升，第二种酶的浓度为0.2~10毫克每毫升，利用固定化酶的单一酶单层定取向磁驱固定化酶载体表面残余的双功能交联剂活化的基团进行第二种目标酶的固定化，即多酶单层定取向定比例磁驱固定化。
[0039]主要操作如下:将步骤6b)制备的基于二硫键的第一种酶(基因工程改造酶)的单一酶单层定取向磁驱固定化酶悬浮在含有质量百分比为0.5~10%的多羟基物质(如:葡萄糖、海藻糖、蔗糖、PEG等多羟基物质)的磷酸缓冲液中，磁驱固定化酶的浓度为1.6~7毫克每毫升，酶的底物(这里选用酶底物中分子较小、来源较广、价格较低的分子，例如:葡萄糖、ABTS、L-dopa等)与酶的摩尔比为50~100:1，加入双功能交联剂使其质量百分浓度为2~5%，室温下温和振荡0.5~4小时，再用多羟基物质质量百分比浓度为0.5~10%的磷酸缓冲液进行3~5次洗涤磁选收集，将收集得到的固定化酶悬浮在第二种酶的磷酸缓冲液中，其中固定化酶的浓度为1.6~7毫克每毫升，第二种酶的浓度为0.2~10毫克每毫升，两种酶分子的摩尔比为1:0.1~10，室温下温和振荡10小时，确保第二种酶的充分固定化，最后用磷酸缓冲液进行3~5次的磁选收集多种酶单层定取向定比例磁驱固定化酶。
[0040]这里的第一种酶、第二种酶可以是单一种类的酶也可以是多种酶的混合酶。酶按其催化反应性质可以是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和合成酶，具体的酶与目标反应需求有关。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1:本发明制备的磁驱动核心铁粒子的电镜图；
[0042]图2:本发明制备铁粒子-硅基核壳结构磁驱酶固定化载体的电镜图；
[0043]图3:温度对游离酶及固定化酶活性的影响曲线；以游离酶室温下的比活为标准，进行各个固定化酶和游离酶在不同温度下比活力的归一化；
[0044]图4:脉冲磁场对磁驱固定化血红蛋白催化氧化ABTS能力的比活力曲线(a)和对固定化血红蛋白催化氧化ABTS能力的比活力曲线(b);分别以O磁场强度时的酶或固定化酶比活标准进行归一化。
【具体实施方式】
[0045]实施例1:
[0046]磁驱固定化血红蛋白制备及其在大水体ABTS催化氧化中的应用
[0047]以氨基修饰的磁驱固定化酶载体为基质，将来源于屠宰业废弃物-血液中的血
红蛋白进行单层固定化，利用该固定化酶在脉冲磁场作用下进行大水体反应体系中ABTS的过氧化反应，同时检测温度、离子强度、pH、溶液体系中游离的蛋白水解酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶)对该酶制剂的催化活性的影响。
[0048]选用血红蛋白的意义在于，I)它是源自屠宰业的废弃物；2)它具有伪过氧化物酶活性，可以用来清除反应体系中的酚、胺污染物。对ABTS底物的催化氧化能力是检测这类酶或者酶制剂活性的常用方法。
[0049]I)磁驱固定化载体制备:
[0050](I)磁驱核心铁粒子制备:4.21克Fe2 (SO4)3与2.92克FeS047H20在用200微升浓度为35.7%的浓盐酸酸化的80毫升去离子水中混合，然后将上述铁盐的酸性反应体系放在60°C水浴中温和振荡(利用悬垂臂搅拌器进行搅拌混合，转速为200转每分钟)30分钟，加入质量体积百分比为25%的浓氨水40毫升，继续在60°C水浴中温和振动30分钟；然后将该反应体系迅速移至70°C水浴中，加入20毫升油酸，继续温和振动30分钟，反应体系中形成的磁性铁粒子进入油酸层。利用磁选法收集磁性铁粒子，采用丙酮20毫升分3次洗涤，获得目的纳米尺度铁粒子(见图1 )，铁粒子放在空气中过夜晾干，称重，质量为5.35克，如图1所示铁粒子的直径小于20纳米。这种尺度的铁粒子具有超顺磁性。[0051](2)铁粒子-硅基核壳结构酶固定化载体制备:上述步骤合成的75.7毫克磁性铁粒子加到300毫升乙醇中，室温下超声I小时，使得磁性铁粒子充分分散在乙醇溶液内。磁性铁粒子乙醇悬浊液倾倒转移到新的锥形瓶中，移除不能悬浮在乙醇中的固体物质。然后向该悬浊液中缓慢加入3.6毫升正硅酸乙酯，利用悬垂臂搅拌器室温下温和搅拌过夜，利用磁选法收集硅基化的磁驱酶固定化载体，硅基固定化载体利用500毫升乙醇分3次进行洗涤，获得97.8毫克铁粒子-硅基结构酶固定化载体。
[0052](3)氨基修饰的磁驱酶固定化载体制备:96.3mg磁驱娃基固定化载体室温下利用超声分散到300毫升乙醇溶液中形成磁驱硅基固定化载体乙醇悬浊液，210微升APTS(3-氨基丙基三甲氧基硅烷)加入到上述悬浊液中，利用悬垂臂搅拌器室温下搅拌10小时，确保基团化(氨基化)完全进行，氨基化磁驱硅基固定化载体利用磁选法进行收集(磁场方向垂直于地磁场方向)，该载体利用500毫升乙醇分3次进行洗涤，共获得186.0毫克目的载体。如图2所示，我们制备的铁粒子-硅基壳结构磁驱固定化酶载体直径在50nm以内。
[0053]2)磁驱固定化血红蛋白制备:
[0054]150毫克氨基修饰的磁驱酶固定化载体分散于40毫升磷酸缓冲液(50毫摩尔PH7.4)中，利用120毫升磷酸缓冲液分3次磁选法洗涤载体，最后将氨基修饰的磁驱酶固定化载体分散于含10%戊二醛的40毫升磷酸缓冲液中进行活化。活化在室温温和搅拌的条件下进行I小时。活化后的载体利用200毫升磷酸缓冲液分3次进行洗涤。收集后的载体与180毫升、浓度为5晕克每毫升的血红蛋白进行混合,室温下温和振荡10小时以确保蛋白的充分固定化。磁选法收集固定化蛋白的载体获得磁驱固定化血红蛋白。
[0055]3)酶固定化率计算:
[0056]溶液部分进行合并收集，利用光谱法检测未结合于固定化载体上的蛋白的量，计算单位磁驱硅基载体上固定化的蛋白质量和蛋白的固定化率。经计算可知每毫克氨基磁驱硅基固定化载体上血红蛋白的固载量为3.4毫克，900毫克血红蛋白中有52%的蛋白被固定化在载体上。
[0057]4)单位有效酶活性计算:
[0058]制备得到的磁驱固定化血红蛋白室温下单位有效酶活性即固定化酶比活与游离酶比活之比为1.7。有效酶活性=固定化酶比活力/游离酶比活力。
[0059]5)脉冲磁场对磁驱固定化血红蛋白催化氧化ABTS能力的影响:
[0060]用ABTS为底物时，无外磁场作用下，固定化酶呈现非常微弱的温度依赖活性变化规律，游离酶呈现典型的钟形温度依赖活性变化规律(图3)。如图所示，固定化酶(浅色组)呈现出较为微弱的温度相关酶活力变化，游离酶呈现出较为明显的温度相关“钟形”曲线变化，即在酶达到最大活力前，随反应体系的温度上升，游离酶的催化活力明显上升，达到酶的最大活力后，随反应体系的温度上升，游离酶活力出现明显下降，这种活力下降与酶的高温失活有关。这说明，固定化酶对反应体系的温度变化不敏感，它更适用于大水体催化反应；在O~1.2T的磁场作用下，游离酶催化活性呈钟型变化，0.4T时游离酶活性是无磁场强度下游离酶活性的 1.5倍(图4，做固定化酶研究时，需要注意在多个方面与游离酶进行对比，看看固定化操作对酶自身的活性的影响，游离酶是固定化酶研究的参照物)。在周期为0.66次/s,脉冲宽度为42毫秒,磁场强度在O~0.15T之间的交变脉冲磁场磁场作用下，固定化酶催化活性呈钟型变化，磁场强度为0.1T时固定化酶活性是无磁场强度下固定化酶活性的1.5倍(图4)。如图4所示，外磁场强度增加时，游离酶(血红蛋白)呈现“钟形”催化活力变化曲线，说明磁场强度对酶的催化功能有一定的调节和影响，磁场对固定化酶同样存在“钟形”催化活力变化影响，不同的是，固定化酶在较弱的外磁场作用下呈现出与游离酶在较强磁场作用下相似的催化活性。这表明，本专利中制备的磁驱酶固定化载体可以赋予酶较高的磁场敏感性，使得酶在较弱的外磁场作用下获得较为显著的活性调节，这使得外磁场在释放、回收和驱动固定化酶进行大水体体系反应催化时，采用较弱的磁场强度即可获得较高的催化效率，磁场强度低时，诱发磁场所需的能量也随之降低，即，低能耗下获得更高的催化活性。
[0061]上述现象说明，本专利合成的磁驱酶固定化载体在进行酶的单层固定化时，可以使得固定化酶具有更好的温度稳定性，固定化酶的温度稳定性高，使得固定化酶在使用时对环境的温度变化不敏感，具有更加宽广的使用范围；酶固定在本专利制备的磁驱酶固定化载体上时，酶的活性更容易受到外界磁场的影响，达到相同催化活性时，固定化酶需要更低的外磁场强度，这使得外磁场在释放、回收和驱动固定化酶进行大水体体系反应催化时，采用较低的磁场强度即可获得较高的催化效率，磁场强度低时，诱发磁场所需的能量也随之降低，即，低能耗下获得更高的催化活性。
[0062]6)环境因素对酶制剂催化活性的影响:
[0063]实验证明，固定化酶具有较好的稳定性，经过胃蛋白酶和胰蛋白酶长时间酶解后，固定化酶的氧化催化能力保存80%以上；酶制剂经过100°C加热30分钟后生物活性保持50%以上；经过10次重复使用，固定化酶制剂呈现较好的活性稳定性和回收性(99%);酶制剂保存在去离子水中，保存2个月活性未见明显变化。
[0064]上述现象表明，固定在本发明制备的磁驱酶固定化载体上的固定化酶具有很高的活性稳定性和抗蛋白酶酶解能力，这一特点使得该类固定化酶可以用于环境复杂水体中的催化反应。
[0065]实施例2:
[0066]磁驱固定化基因工程透明颤菌血红蛋白
[0067]基因工程改造蛋白构建:根据步骤5)中的基因工程改造蛋白的原则，结合生物信息学技术分析结果，将来源于原核生物透明颤菌的血红蛋白(该蛋白的序列和结构为公知技术，任何人可以从多种渠道获得，也可以直接让公司进行化学合成)进行分子改造，需要在蛋白C末端添加一段序列为GGG￡GG|2iGG的多妝序列，该序列的特征在于含有疏基侧链氣基酸残基Cys及氨基侧链氨基酸残基Lys。这里我们通过基因合成公司用化学合成的办法合成了新的目的蛋白基因(我们提供目的基因序列，由公司化学合成)，该蛋白的表达、纯化与一般的基因工程蛋白表达纯化途径相同。该蛋白的表征采用紫外-可见吸收光谱和血红蛋白相同的活性检测方法。
[0068]选用透明颤菌血红蛋白的意义在于，I)它与血红蛋白相同，同样具有伪过氧化物酶活性；2)它的晶体结构已知，便于利用生物信息学技术进行结构分析；3)它的基因工程改造较为成熟。
[0069]与实施例1相比，主要操作差别存在于这里是利用步骤6)实现目标酶的定取向固定化，具体差异操作如下:
[0070]I)磁驱酶固定化载体官能团 化修饰:磁驱酶固定化载体制备步骤采用130微升APTS+80微升MPTS (3-巯基丙基三甲氧基硅烷)代替210微升APTS作为基团化试剂；
[0071]2)第一次基于巯基的单层定向固定化:磁驱酶固定化载体合成后不利用10%戊二醛进行活化，直接加入180毫升浓度为5毫克每毫升基因工程改造目标蛋白和硫酸铜溶液使得反应体系内铜离子的终浓度为0.5微摩尔每升，促使酶C末端添加序列上的Cys残基的巯基与载体表面巯基间形成二硫键，从而实现酶的单层、定向固定化；室温混合I小时后分三次利用磁选法洗涤未结合目标蛋白，分离得到磁驱固定化酶。由于二硫键存在化学环境敏感的特性，使得固定化酶使用范围不够宽，故需要进行利用双功能交联剂进行的二次固定化；
[0072]3)第二次双功能交联剂固定化:将固定化酶悬浮于PBS缓冲液中，加入大过量酶的底物ABTS (终浓度为2毫摩尔每升)和葡萄糖(终浓度为0.3摩尔每升)，加入戊二醛使其终浓度为2~5%，室温下反应2小时，使得固定在磁驱固定化酶载体上的酶通过二硫键附近的载体上氨基和目标蛋白C末端添加序列上的氨基残基(Lys)间通过戊二醛形成共价交联。利用120毫升的PBS缓冲液分三次洗涤固定化酶制剂，去除多余的ABTS和戊二醛，收集磁驱固定化透明颤菌血红蛋白，按照实施例1中酶固定化率测定方法测试，经计算可知每毫克氨基磁驱硅基固定化载体上透明颤菌血红蛋白的固载量为2.1毫克。二次固定化时，底物和多羟基物质的添加可以最大限度抑制双功能交联剂在活性相关区域的固定化，降低共价交联法对固定化酶活性抑制。
[0073]利用本方法固定化的基因工程改造透明颤菌血红蛋白在催化氧化大水体环境内的ABTS时，室温下单位有效酶活性0.97。
[0074]实施例3:
[0075]磁驱固定化基因工程透明颤菌血红蛋白和葡萄糖氧化酶
[0076]本实施例中 采用是实施例2中的氨基-巯基双官能团修饰磁驱酶固定化载体进行透明颤菌血红蛋白和葡萄糖氧化酶的双酶反应器共固定，该双酶反应器的特征为葡萄糖氧化酶消耗反应体系中外源添加的葡萄糖，利用水中溶解的氧产生过氧化氢，过氧化氢作为具有伪过氧化物酶活性的透明颤菌血红蛋白的底物，经透明颤菌血红蛋白催化产生过氧自由基与反应体系中的ABTS进行催化氧化反应，从而实现大水体反应体系的无外源过氧化氢添加和过氧化氢的高效利用。
[0077]与实施例1和实施例2相比，主要操作差别在于这里是利用步骤7)实现多酶固定化，具体差异操作如下:
[0078]I)第二次双功能交联剂固定化:将固定化酶悬浮于PBS缓冲液中，加入大过量酶的底物ABTS (终浓度为2毫摩尔每升)和葡萄糖(终浓度为0.3摩尔每升)，加入戊二醛使其终质量百分比浓度为2~5%，室温下反应2小时，使得固定在磁驱固定化酶载体上的酶通过二硫键附近的载体上氨基和目标蛋白C末端添加序列上的氨基残基(Lys)间通过戊二醛形成共价交联。利用120毫升的葡萄糖浓度为0.3摩尔每升的PBS缓冲液分三次洗涤固定化酶制剂，去除多余的ABTS和戊二醛，收集磁驱固定化透明颤菌血红蛋白，将其悬浮在180毫升浓度为5毫克每毫升的葡萄糖氧化酶溶液中，温下温和振荡10小时以确保蛋白的充分固定化。
[0079]磁选法收集固定化蛋白的载体，溶液部分与利用120毫升磷酸缓冲液分三次洗涤，溶液部分进行合并收集，利用光谱法检测未结合于固定化载体上的蛋白的量，计算单位磁区硅基载体上固定化的蛋白质量和蛋白的固定化率，经计算可知每毫克磁驱酶固定化载体上固载透明颤菌血红蛋白2.1毫克，固载葡萄糖氧化酶0.3毫克。
[0080]利用本方法固定化的透明颤菌血红蛋白和葡萄糖氧化酶双酶反应体系在催化氧化大水体环境内的ABTS时不需要外界添加过氧化氢，具有高安全性和经济可控的优点，对大水体中的ABTS的催化氧化能力是相同含量葡萄糖氧化酶、透明颤菌血红蛋白混合体系的11 .3倍。
【权利要求】
1.一种磁驱固定化酶，其特征在于:该磁驱固定化酶是以纳米尺度的顺磁性铁粒子为磁驱动核心，以氨基、羧基或巯基基团化试剂修饰的硅基材料为外壳；目标酶或基因工程改造酶通过基团化试剂引入的官能化基团固定化在硅基材料的外壳上，进而形成的单一酶单层磁驱固定化酶、单一酶单层定取向磁驱固定化酶、多种酶单层定比例磁驱固定化酶或多种酶单层定取向定比例磁驱固定化酶。
2.权利要求1所述的磁驱固定化酶的制备方法，其步骤如下: (O纳米尺度铁粒子磁驱动核心的制备:将摩尔比为1:1的二价铁盐与三价铁盐在pH=4.0~6.0的去离子水中混合，然后将上述铁盐的酸性反应体系在50~70°C水浴条件下振荡20~50分钟，加入氨水使反应体系的pH=10~11，继续在50~70°C水浴条件下振动20~40分钟；再加入15~30毫升油酸，继续在50~70°C水浴条件下振动20~40分钟，反应体系中形成的纳米尺度的铁粒子进入油酸层；最后磁选收集铁粒子，丙酮洗涤后晾干; (2)铁粒子-硅基核壳结构的磁驱酶固定化载体的制备:将铁粒子在室温下超声分散到乙醇溶液中形成浓度为0.15~0.3毫克/毫升的悬浊液，然后向该悬浊液中缓慢加入硅基化试剂，铁粒子与硅基化试剂的质量比为1:10~15，搅拌过夜；磁选收集得到的铁粒子-硅基核壳结构的磁驱酶固定化载体，乙醇洗涤后晾干； (3)氨基、羧基或巯基修饰的磁驱酶固定化载体的制备:将铁粒子-硅基核壳结构的磁驱酶固定化载体在室温下超声分散到乙醇溶液中形成浓度为0.2~0.4毫克每毫升的悬浊液，然后将氨基、羧基或巯基基团化试剂加入到上述悬浊液中，室温下搅拌8~14小时，磁选收集得到的氨基、羧基或巯基修饰的磁驱酶固定化载体，乙醇洗涤后晾干；其中，铁粒子-硅基核壳结构的磁驱酶固定化载体与基团化试剂的质量比为450~500:1 ; (4)酶单层固定化的磁驱`酶固定化载体的制备:将氨基、羧基或巯基修饰的磁驱酶固定化载体用磷酸缓冲液洗涤后磁选收集，然后分散于双功能交联剂质量百分含量为2~10%的磷酸缓冲液中进行活化，磁驱酶固定化载体的终浓度为1.6~6.7毫克每毫升；活化后的载体用磷酸缓冲液洗涤后磁选收集，从而去除未反应的游离的双功能交联剂；在磷酸缓冲液中，将收集后的载体与目标酶分子混合，室温下振荡8~14小时；最后用磷酸缓冲液洗涤后磁选收集，从而得到单一酶单层磁驱固定化酶；其中，氨基、羧基或巯基修饰的磁驱酶固定化载体与目标酶的质量比为1:3~9 ; 或将收集后的载体与两种或两种以上的目标酶分子混合，室温下振荡8~14小时；最后用磷酸缓冲液洗涤后磁选收集，从而得到多种酶单层定比例磁驱固定化酶；其中，氨基、羧基或巯基修饰的磁驱酶固定化载体与两种或两种以上目标酶的质量比为1:3~9。
3.权利要求1所述的磁驱固定化酶的制备方法，其步骤如下: (O纳米尺度铁粒子磁驱动核心的制备:将摩尔比为1:1的二价铁盐与三价铁盐在pH=4.0~6.0的去离子水中混合，然后将上述铁盐的酸性反应体系在50~70°C水浴条件下振荡20~50分钟，加入氨水使反应体系的pH=10~11，继续在50~70°C水浴条件下振动20~40分钟；再加入15~30毫升油酸，继续在50~70°C水浴条件下振动20~40分钟，反应体系中形成的纳米尺度的铁粒子进入油酸层，利用油酸与水溶液的不相容性将铁粒子与水溶性反应溶液分离开；最后磁选收集铁粒子，丙酮洗涤后晾干； (2)铁粒子-硅基核壳结构的磁驱酶固定化载体的制备:将铁粒子在室温下超声分散到乙醇溶液中形成浓度为0.15~0.3毫克/毫升的悬浊液，然后向该悬浊液中缓慢加入硅基化试剂，铁粒子与硅基化试剂的质量比为1:10~15，搅拌过夜；磁选收集得到的铁粒子-硅基核壳结构的磁驱酶固定化载体，乙醇洗涤后晾干； (3)基因工程改造酶的构建:在目标酶分子活性口袋和底物结合位点远端插入成簇的巯基(cys)、氨基(Lys或Arg)、羧基(Glu或Asp)侧链氨基酸中的两种或三种,构建富含可与双功能交联剂进行反应的团簇区，各种组合中巯基是必须包括的基团； (4)单层定取向磁驱酶固定化载体的制备:将步骤2)制备得到的铁粒子-硅基核壳结构的磁驱酶固定化载体在室温下超声分散到乙醇溶液中，形成浓度为0.2~0.4毫克每毫升的乙醇悬浊液，将包含巯基基团化试剂在内的两种或两种以上的氨基、羧基或巯基基团化试剂加入到上述悬浊液中，室温下温和搅拌8~14小时，最后用磷酸缓冲液进行3~5次的磁选收集，用乙醇洗涤后晾干，制得用于单一酶单层定取向磁驱固定化酶载体； (5)基于二硫键的单一酶单层定取向磁驱固定化酶的制备:将单一酶单层定取向磁驱固定化酶载体与基因工程改造酶按质量比为1:3~9在50毫摩尔每升、pH=7.4的磷酸缓冲液中混合0.5~2小时，最后用磷酸缓冲液进行3~5次的磁选收集，从而得到基于二硫键的单一酶单层定取向磁驱固定化酶； (6)单层定取向磁驱酶固定化的二次固定化:将步骤(5)获得的基于二硫键的单一酶单层定取向磁驱固定化酶悬浮在磷酸缓冲液中，得到磁驱固定化酶的浓度为1.6~7毫克每毫升的悬浊液，然后加入酶的底物，使底物与基因工程改造酶的摩尔比为50~100:1 ;再加入多羟基物质使其质量百分浓度为0.5~10%，加入双功能交联剂使其质量百分浓度为2~5%，室温下温和振荡0.5~4小时，使得二硫键固定的基因工程改造酶通过分子表面团簇内氨基或羧基基团与单一酶单层定取向磁驱固定化酶载体表面的氨基或羧基基团形成共价交联，实现酶的二 次固定化，最后用磷酸缓冲液进行3~5次的磁选收集，从而得到二次固定化的单一酶单层定取向磁驱固定化酶； 或将步骤(5)获得的基于二硫键的单一酶单层定取向磁驱固定化酶悬浮在含有质量百分比为0.5~10%的多羟基物质的磷酸缓冲液中，得到磁驱固定化酶的浓度为1.6~7毫克每毫升的悬浊液，然后加入酶的底物，使底物与基因工程改造酶的摩尔比为50~100:1，加入双功能交联剂使其质量百分浓度为2~5%，室温下温和振荡0.5~4小时，再用多羟基物质质量百分比浓度为0.5~10%的磷酸缓冲液进行3~5次洗涤磁选收集；然后将收集得到的固定化酶悬浮在第二种酶的磷酸缓冲液中，其中固定化酶的浓度为1.6~7毫克每毫升，第二种酶的浓度为0.2~10毫克每毫升，两种酶分子的摩尔比为1:0.1~10，室温下温和振荡10小时，最后用磷酸缓冲液进行3~5次的磁选收集多种酶单层定取向定比例磁驱固定化酶。
4.如权利要求2或3所述的磁驱固定化酶的制备方法，其特征在于:二价铁盐是硫酸亚铁、硝酸亚铁或氯化亚铁，三价铁盐是硫酸铁、硝酸铁或氯化铁。
5.如权利要求2或3所述的磁驱固定化酶的制备方法，其特征在于:硅基化试剂是正硅酸乙酯、正硅酸甲酯或水玻璃。
6.如权利要求2或3所述的磁驱固定化酶的制备方法，其特征在于:氨基、羧基、巯基化试剂分别是3-氨基丙基_ 二甲氧基硅烷、3-羧基丙基_ 二甲氧基硅烷、3-疏基丙基_ 二甲氧基硅烷。
7.如权利要求2所述的磁驱固定化酶的制备方法，其特征在于:活化是在室温温和搅拌的条件下进行0.5~2小时。
8.如权利要求2或3所述的磁驱固定化酶的制备方法，其特征在于:双功能交联剂为戊二醛、丁二酸酐、己二酰亚胺酸二甲酯或双重氮联苯胺_2，2-二磺酸。
9.如权利要求3所述的磁驱固定化酶的制备方法，其特征在于:多羟基物质是葡萄糖、海藻糖、蔗糖或PEG。`
【文档编号】C12N11/10GK103865916SQ201410114538
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2014年3月24日
【发明者】吕明, 周杰, 吴家安, 杜金玲 申请人:吉林大学