黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记及其专用引物和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记及其专用引物和应用。该分子标记，是用以下引物对自黄瓜总DNA中扩增出来的核苷酸序列之一：序列表中SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2、序列表中SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4。上述分子标记可鉴定目的基因黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的存在，实现对抗病植株的间接选择，由于不受其他基因效应和环境因素的影响，可用于早代选择，缩短育种年限，提高育种效率。
【专利说明】黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记及其专用引物和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】的分子标记，特别涉及与黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4连锁的分子标记及其在黄瓜种质资源选择中的应用。
【背景技术】
[0002]黄瓜(Cucumis Sativus.L)在世界上广泛栽培，中国是世界上黄瓜栽培面积最大、
总产量最高的国家。
[0003]黄瓜枯萎病(Fusarium Wilt)，又名萎蔫病、蔓割病、死秧病，由尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum Owen.)侵染所致，是一种由土壤传染，从根或根颈部侵入，在维管束内寄生的系统性病害(导管型枯萎病)，是黄瓜生产上较难防治的三大病害之一，是目前世界各地黄瓜，特别是温室和其他保护地黄瓜的主要土传病害，一般年份可使黄瓜产量损失25%-35%，严重发病时可使黄瓜绝产。枯萎病采用化学防治效果不理想，不仅使生产投入增加且会造成环境安全隐患，倒茬嫁接虽常用于防控但增添技术困难和劳动成本。因此选育抗病品种是解决枯萎病危害的最佳途径。
[0004]黄瓜枯萎病抗病基因影响黄瓜对枯萎病的抗性，它的研究将会推动抗病育种进程。用与目的性状紧密连锁的分子标记进行标记辅助选择在黄瓜遗传育种中十分有效，分子标记是在DNA水平上对目标性状进行选择，具有高效、快速、不受环境条件限制等优点，可在苗期进行选择，加快育种进程。因此，开发用于辅助鉴定黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记十分必要。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的缺陷，本发明的`目的在于提供一种黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记及其专用引物和应用。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案:
[0007]—种黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记，是用以下引物自黄瓜总DNA中扩增出来的核苷酸序列之一:序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2、序列表中SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4。
[0008]获得上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记的引物如下:1)获得黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记FWSNPl的引物为序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2 ;2)获得黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记FWSNP2的引物为序列表中SEQ ID NO: 3和SEQID N0:4。
[0009]利用上述引物对，通过常规PCR法可得到上述分子标记。
[0010]本发明涉及的与黄瓜抗枯萎病共分离的dCAPs标记FWSNP1，是利用抗/感遗传群体(母本:WF2757，抗枯萎病；父本:津研二号，感枯萎病)进行精细定位和克隆获得的。通过利用90个RIL-F8株系，130株的F2:3群体对枯萎病抗病基因Foc_4进行初步定位，然后利用2000株的F2群体对Foc-4进行精细定位到25kb的区间内。该区间内含2个基因，分别是TIR NB-ARC抗病基因和bHLH96-like转录因子，其中TIR NB-ARC基因经过验证分析，被证实为枯萎病抗病基因Foc-4的重要候选基因。通过对比研究Foc-4基因在抗/感黄瓜材料中的序列差异，发现一个 SNP 位点，依据 http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html,在线设计软件，开发设计了与抗/感枯萎病紧密连锁的dCAPs分子标记FWSNP1。同时利用FffSNPl标记分析2000多株遗传群体材料，结合田间枯萎病接种鉴定研究，发现FWSNPl标记与抗感枯萎病紧密连锁，达到共分离。
[0011]本发明涉及的另一个黄瓜抗枯萎病SNP2关键位点，其在抗病基因Foc-4中导致了氨基酸编码的变化。该SNP位点是通过对不同遗传背景的黄瓜枯萎病抗感材料进行基因组重测序获得的,通过对多个黄瓜抗感材料进行重测序,利用BWA-Samtools (v0.1.12a,mpileup按照默认参数)软件分析Foc_4基因在不同材料中的SNP位点，结合黄瓜基因组9930-V2和基因组注释，发现Foc-4基因的915位存在单碱基差异SNP2位点(由A到C)，导致了 Foc-4基因中编码氨基酸的差异(从Ile到Leu)。并利用该SNP2位点设计标记，获得FWSNP2分子标记，通过分析上述黄瓜材料的基因型，结合田间枯萎病接种鉴定材料抗感病表型，发现FWSNP2标记分析的基因型与抗感表型一致，证明FWSNP2可作为枯萎病紧密连锁分子标记，筛选黄瓜材料。
[0012]上述分子标记或引物在选育抗黄瓜枯萎病品种中的应用。
[0013]在上述应用中，优选地，所述分子标记FWSNPl在选育抗黄瓜枯萎病品种中的应用的具体方法为:以待测黄瓜材料的基因组DNA作为模板，用序列表中SEQ ID NO:1和序列表中SEQ ID NO: 2所示的核苷酸组成的特异性引物进行PCR扩增，然后采用SalI内切酶对PCR产物酶切，如果得到164bp的酶切产物，则待测黄瓜为抗病材料；如果得到134bp的酶切产物，则待测黄瓜为感病材料；更优选地，所述待测黄瓜材料为WF2757、M21或者COUNTYFAIR Fl，或者以WF2757、M21和/或COUNTY FAIR Fl作为亲本得到的子代；
[0014]在上述应用中，优选地，所述分子标记FWSNP2在选育抗黄瓜枯萎病品种中的应用的具体方法为:以待测黄瓜材料的基因组DNA作为模板，用序列表中SEQ ID NO: 3和序列表中SEQ ID N0:4所示的核苷酸组成的特异性引物进行PCR扩增，然后采用MaeII内切酶对PCR产物酶切，如果得到165bp的酶切产物，则待测黄瓜为抗病材料；如果得到135bp的酶切产物，则待测黄瓜为感病材料；更优选地，所述待测黄瓜材料为VICTORY或者DIHUANGGUA,或者以VICTORY和/或者DI HUANGGUA作为亲本得到的子代。
[0015]本发明具有如下有益效果:
[0016]本发明的dCAPs标记FWSNPl和FWSNP2与黄瓜枯萎病抗病存在紧密连锁关系(共分离)，可鉴定目的基因黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的存在，实现对抗病植株的间接选择，由于不受其他基因效应和环境因素的影响，可用于早代选择，缩短育种年限，提高育种效率，为进行黄瓜枯萎病抗病育种提供技术支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1是黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4定位连锁图谱，其中左图黄瓜枯萎病基因初定位不意图，中图为枯委病抗病基因精细定位不意图，右图为25kb区间范围内基因分布情况及基因注释；[0018]图2是Foc-4基因FWSNPl分子标记在某一群体中酶切验证结果示意图；
[0019]图3是Foc-4基因FWSNP2分子标记在某一群体中酶切验证结果示意图；
[0020]图4是Foc-4基因FWSNPl分子标记在另一群体中的酶切鉴定结果示意图；
[0021]图5是Foc-4基因FWSNP2分子标记在另一群体中的酶切结果示意图。
【具体实施方式】
[0022]下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。
[0023]实施例1黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的获得
[0024]一、黄瓜枯萎病生理小种4的抗病基因Foc-4初步定位和精细定位
[0025]具体的定位方法包括以下步骤:
[0026]A、黄瓜枯萎病抗病基因定位研究亲本及遗传群体:
[0027]分别选择WF2757 (父本)和津研二号(母本)为抗感亲本，构建90个RIL-F8株系，130株的F2:3群体和超过2000株的F2大群体。其中，父本WF2757和母本津研二号购自北京市农作物种质资源库。
[0028]B、黄瓜枯萎病抗病基因定位研究病情指数调查:
[0029]将亲本及各群体的种子用纱布包裹，温汤浸种，28°C恒温催芽后播于50孔穴盘中，在空调温室育苗，育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土。
[0030]供试菌种黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.cucumerinum Owen.)生理小种4号是根据黄仲生等的中国黄瓜枯萎病菌生理小种鉴定及防治文献(中国黄瓜枯萎病菌生理小种鉴定及防治，华北农学报，1994，9 (4):81-86)中记载的方法分离获得的。采用翁祖信等(黄瓜枯萎病抗病性鉴定方法研究一胚根接种法，中国蔬菜，1985年02期)的方法制备黄瓜枯萎病菌液，血球计数板测定孢子浓度。采用浸根接种法:当黄瓜幼苗子叶展平时，拔出幼苗，用水洗净根部，在I X IO6~5 X IO6个孢子/mL的接种液中浸根，然后栽入装有灭菌营养土的塑料营养钵(规格6.5cmX 6.5cm)中，在温室中培养。白天维持在24~28°C，夜间在16~20°C。3次重复，每次重复30株。
[0031]按上述方法接种后7~IOd进行病情调查。病情分级标准为:0级:无症状；1级:I片子叶黄化；2级:2片子叶黄化或萎蔫；3级:1片真叶轻度萎蔫；4级:1~2片真叶明显萎蔫；5级:全株严重萎蔫或枯死。其中2以下为抗病，3以上为感病类型。
[0032]对亲本及各群体的病情进行精确统计。
[0033]C、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的初步定位:
[0034]利用 Cavagnaro 等(Genome-wide characterization of simple sequencerepeats in cucumber, BMC Genomics, 2010)发表的黄瓜高密度遗传图引物信息,结合90个RIL-F8株系和130株的F2:3群体病情指数的精确统计，对亲本和RIL群体进行分子标记分析，编码采集亲本及RILs群体各单株基因型数据。母本基因型记为A，父本的基因型记为B，F1杂合基因型记为H，模糊或缺失数据记为U。用x2test对数据进行比例适合性检验分析，采用JoinMap4.0软件(Staml993 ；Van 0oijen2001)构建连锁图谱(参见图1)，设置软件LOD阀值为4.0以及选取Kosambi公式(Kosambi 1944)，将黄瓜抗枯萎病基因初步定位在2号染色体的分子标记UW017820 和UW084909之间的160kb区间内(参见图1)，根据Li等(RNA-Seq improves annotation of protein-coding genes in the cucumber genome, BMCgenomics, 2011)对黄瓜基因组的注释并通过Softberry在线软件进行预测,该区间存在一个由多个NBS-LRR抗病基因组成的NBS-LRR串联抗病基因(NBS-LRR为抗病基因保守结构域)，难以预测和选择候选基因，所以需要进一步扩大群体进行精细定位研究。
[0035]D、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的精细定位:
[0036]经过构建超过2000株的F2大群体继续对抗枯萎病基因进行精细定位，同时,本实验室对所用抗感亲本进行了基因组重测序，经过生物信息比对分析，在双亲间开发了 79560个Indel和108727个SNP分子标记，在初定位区间的160kb范围内选择设计了 14对Indel分子标记(参见表1)进行群体分析，经过验证后利用这14对Indel标记对抗枯萎病基因进行了精细定位研究，其中引物的合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，同样利用JoinMap4.0软件进行遗传连锁作图分析，最终在2000株的F2大群体将抗枯萎病基因精细定位到分子标记UW017805和Indel2027634的25kb的范围内，在精细定位区间内近2300株的试验材料中存在I个交换单株。
[0037]采用上述14对Indel分子标记进行精细定位时的各PCR反应体系(10 μ L)如下:25ng 模板DNA，0.5μΜ上游引物，0.5μΜ 下游引物，0.2mM 的 dNTP mix ；0.5U Taq DNA 聚合酶，IXPCR Buffer (Fermentas) 2 μ L，ddH20 补足到 10 μ L。
[0038]PCR 反应程序为:阶段 1:95 V 预变性 3min ;阶段 2:94 V 30s, 60 V lmin，72°C lmin，退火温度每个循环降1°C，共8个循环；阶段3 -MV 30s, 53°C 30s, 72°C lmin,共32个循环；阶段4:72 °C延伸5min ;阶段5:4 °C保存；其中，PCR仪为购自Appl iedBiosystems 公司的 Veriti96well Thermal Cycler。
[0039]表1用于精细定位的14对Indel分子标记引物信息
[0040]
【权利要求】
1.一种黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记，是用以下引物自黄瓜总DNA中扩增出来的核苷酸序列之一:序列表中SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2、序列表中SEQ ID N0:3和SEQID N0:4。
2.获得权利要求1所述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记的引物如下:1)获得黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记FWSNPl的引物为序列表中SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2 ；2)获得黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记FWSNP2的引物为序列表中SEQ IDNO:3 和 SEQ ID NO:4。
3.权利要求1所述分子标记或权利要求2所述引物在选育抗黄瓜枯萎病品种中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述分子标记FWSNPl在选育抗黄瓜枯萎病品种中的应用的具体方法为:以待测黄瓜材料的基因组DNA作为模板，用序列表中SEQID NO:1和序列表中SEQ ID NO: 2所示的核苷酸组成的特异性引物进行PCR扩增，然后采用SalI内切酶对PCR产物酶切，如果得到164bp的酶切产物，则待测黄瓜为抗病材料；如果得到134bp的酶切产物，则待测黄瓜为感病材料。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述待测黄瓜材料为WF2757、M21或者COUNTY FAIR F1，或者以WF2757、M21和/或COUNTY FAIR Fl作为亲本得到的子代。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述分子标记FWSNP2在选育抗黄瓜枯萎病品种中的应用的具体方法为:以待测黄瓜材料的基因组DNA作为模板，用序列表中SEQID N0:3和序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸组成的特异性引物进行PCR扩增，然后采用MaeII内切酶对PCR产 物酶切，如果得到165bp的酶切产物，则待测黄瓜为抗病材料；如果得到135bp的酶切产物，则待测黄瓜为感病材料。
7.根据权利要求6所 述的的应用，其特征在于，所述待测黄瓜材料为VICTORY或者DIHUANGGUA,或者以VICTORY和/或者DI HUANGGUA作为亲本得到的子代。
【文档编号】C12Q1/68GK103882017SQ201410115373
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月25日 优先权日:2014年3月25日
【发明者】温常龙, 毛爱军, 董从娟, 张海英, 王永勤, 王永健, 于拴仓, 许勇 申请人:北京市农林科学院