一种植物抗旱相关蛋白TaRBP2及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱相关蛋白TaRBP2及其编码基因和应用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的抗旱相关蛋白及其编码基因对改良、增强拟南芥抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。
【专利说明】-种植物抗旱相关蛋白TaRBP2及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱相关蛋白TaRBP2及 其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 小麦作为我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，每 年因干旱、盐碱等逆境胁迫条件对我国小麦造成的减产约800亿公斤，严重影响着小麦的 产量和品质，制约着我国小麦粮食安全。随着现代分子生物学的发展，利用基因工程技术从 分子水平上深入研究植物与非生物逆境之间的关系，揭示植物对逆境胁迫信号传导及基因 表达调控分子机理，为培育作物抗逆新种质提供了理论基础。
[0003] 真核生物基因表达是一个被高度调控的过程，其主要涉及到三方面：转录、转录后 及翻译后。基因表达调控首先就是在转录水平，主要是一些转录因子参与调节在各种内外 环境刺激下特定基因RNA的合成。另外，就是在蛋白质水平的翻译后调控，如激酶磷酸化、 泛素连接酶等被公认为能在时空上控制细胞内功能蛋白的产生。然而，对于介于上述两方 面之间的转录后调控的认识还特别少。近几年，通过研究低等真核生物如酵母、克氏锥虫 等越来越多的发现表明：转录后调控RNA的作用因子为一系列RNA结合蛋白（RNA-Binding Proteins, RBPs)〇
[0004] RBPs在mRNA存在的各个主要环节中都发挥着重要作用，如mRNA的剪接、RNA转 运、RNA稳定性与讲解、细胞内定位、翻译调控、多腺苷化作用及序列编辑等。在细胞核内 RBP结合在mRNA前体（Pre-mRNA)上调节促进内含子的剪切及拼接形成成熟的mRNA ;RBP还 能调节成熟mRNA从细胞核转运到细胞质；RBP能调节mRNA识别定位目标，如mRNA识别定位 线粒体；RBP还参与调控mRNA的稳定性，调节mRNA的退化；在调控mRNA的翻译过程中RBP 也发挥重要作用。在这些复杂过程中RNA结合蛋白通过与RNA相互作用形成核糖核蛋白复 合体（Ribonucleoprotein Complex),直接或间接地参与了这些过程。RNA结合蛋白种类很 多，估计占细胞编码蛋白的6-8%，但迄今为止只有为数不多的几种RBP，如HuR、AUFl、TTP、 TlAl及CUGBP2等被证实可特异参与mRNA拼接、稳定性、翻译和其他层面的基因调控。
[0005] RBP具体参与细胞内外调控信号共同作用来调节mRNA形成的各个环节是非常复 杂的(如图1-2)。例如RBP家族成员之一的sam68,介导细胞外信号作用下RNA的选择性剪 接，如佛波酯处理的T细胞中⑶44拼接改变。SAM68的RNA结合活性通过磷酸化和调控其 与其它蛋白的相互作用来调节，如佛波酯处理的T细胞刺激RAS/MAP激酶通路，激活ERK磷 酸化Sam68,诱导CD44选择性剪接。Sam68除调节转录后基因表达的作用外，还与转录因子 如CBP相互作用来调节基因表达。Sam68的KH结构域出现在细胞有丝分裂间期的Gl向S 过渡以刺激阻止有丝分裂。
[0006] RBPs基因家族在植物生长发育等多种生理活动中发挥重要的调控作用，其作用于 基因表达调控过程的转录后调控，这类基因控制生成的RBPs与相关的RNA相互作用形成 核糖核蛋白复合体（Ribonuc leoprote in Complex, RNP Comp lex),从而直接或间接地参与 mRNA的代谢调控[8~]。众多的RBPs氨基酸序列有一定的同源性，目前已经发现许多RNA结 合结构域（RNA-binding domain，RBD)，包括 RNA 识别基序（RNA Recognition Motif，RRM)、 KH 结构域、锌指结构（Zine finger)、RGG box、DEAD/DEAH box、Pumilio/FBF(PUF)、双链 RNA 结构域（double-stranded RNA bindingdomain, dsRBD)、富含精氨酸基序（Arginine-rich motif)、Sm-protein模体等[11]。这些结构域各自具有特定的保守序列及不同的功能，一些 RBP含有1个或者多个相同结构域拷贝，而另外一些RBP则含有2个或者更多不同的结构 域。
[0007] 对RBP各种模体/结构域研究得较清楚的是RRM，也称为RNP motif [12_15]。RRM基 序是空间上反向平行的P折叠和a螺旋形成的三明治结构，约由90个氨基酸组成，中间 有两段保守序列，定义为RNPl和RNP2。RNPl有8个保守的氨基酸残基，RNP2有6个保守 的氨基酸残基，同时RNPl和RNP2位于P折叠的中间，分别为0 3和￠/1' RRM基序中的 3 -折叠创造了一个平的、外露的RNA结合表面，第二个和第三个0 -折叠组成了带正电荷 的平台边缘[12，13]。KH结构域的交联和保守序列为RNA连接提供了一个潜在的位于两个螺 旋之间环中心的表面 [17]。锌指结构域中位于DNA大凹槽内的螺旋在DNA连接中起主导作 用，但在RNA连接作用方面研究较少 [18]。RGG box结构域在揭开RNA二级结构时起作用[4]。
[0008] 富含甘氨酸RNA结合蛋白（GR-RBP)至少在氨基端含有一个典型的RRM结构域， 同时在羧基端富含长度可变的甘氨酸序列。GR-RBPs是植物中丰度较高的蛋白，植物中 GR-RBPs基因最早在玉米中被克隆，随后相继在拟南芥、烟草、大麦等多种植物中被克隆得 至IJ。研究表明，这种蛋白参与了植物对多种逆境条件的反应调节，如冷害、干旱、水涝、伤 害、盐压、外源脱落酸（AB A)或水杨酸（SA)处理等[19,29]。在众多植物中研究较多、较深入的 是拟南芥的GRBPs。遗传学和生理学方面的数据提供了清楚的证据表明GRRBPs在植物抗逆 反应中起重要作用。研究表明拟南芥中的GRRBP1、GRRBP2、GRRBP3、GRRBP4、GRRBP7、GRRBP8 基因表达量在低温条件下显著增加。干旱、盐分压力也会引起GRRBP1、GRRBP4和GRRBP7转 录产物不同程度地增加。与低温条件下GRRBP2表达量增加相对应，拟南芥GRRBP2突变株 低温条件下与野生型相比表现出发芽、幼苗生长延迟的现象；而过量表达GRRBP2植株发芽 时间提早，幼苗生长更好，而且对冻害表现出更强的耐受力 [25]。
[0009] GR-RBPs基因家族参与植物激素、生理节奏、冷冻、机械伤害、干旱等抗逆调控[19]。 早在1992年Sturm从胡萝卜中克隆分离出编码受伤口诱导富含甘氨酸蛋白的cDNA，分析 证明在受到机械伤害过程中富含甘氨酸蛋白参与异质核RNA的生物合成和特定mRNA成熟 反应 [2°]。Dunn等发现大麦中1个GR-RBP参与低温胁迫调控，还控制mRNA的稳定性；同 时，通过实验证明其在体外还能磷酸化 [21]。研究还发现高粱中1个编码GR-RBP的基因受 到盐和ABA (Abscisic Acid,脱落酸）诱导表现出上调控[22]。Nakaminami等通过实验证明 小麦中一种冷激结构域蛋白WCSPl与单链DNA/RNA结合行为的必须条件是具有富含甘氨酸 区域，而富含甘氨酸与这个蛋白的热稳定性没有必然的关系 [23]。Sahi等研究表明水稻幼 苗中0sGR-RBP4基因能调控多种非生物胁迫，0sGR-RBP4为核蛋白，其主体主要定位在细胞 质中，可能结合并稳定应力诱导的转录过程 [24]。同时，Kim等研究证明水稻中OsGR-RBPl、 0sGR-RBP4和0sGR-RBP6都有使冷敏感大肠杆菌突变体BX04在低温环境存活的能力；并 且OsGR-RBPl、0sGR-RBP4能够保护冷敏感拟南芥AtGR-RBP7突变植株在寒冷和冰冻条件 下的生长缺陷 [25]。Chen等研究发现烟草中四种GR-RBPs分别命名为NtRGP-la，NtRGP-lb， NtRGP-2, NtRGP-3,其中 NtRGP-2 与 NtRGP-3 与拟南芥中 AtGR-RBP 基因接近，NtRGP-Ia 和 NtRGP-Ib与禾本科中GR-RBP基因接近；同时，四种NtRGPs特别是NtRGP-Ia和NtRGP-3受 到水、创伤、严寒和高温等处理的强烈诱导，受PEG、干旱和水杨酸处理较弱诱导，不受ABA 处理影响 [26]。Kim等研究表明拟南芥AtGR-RBP7在寒冷胁迫环境中涉及mRNA从细胞核转 出到细胞质；同时，AtGR-RBP7还影响拟南芥在高盐、脱水胁迫条件下的生长和抗逆性，使 植株具有抗冻性，这些调控过程都是通过在保卫细胞中调节气孔开闭来完成 [27]。景润春等 实验发现RRM RNA结合蛋白基因家族参与了细胞核与细胞质的相互作用，同时，细胞质雄 性不育性的形成与育性恢复均与细胞质内线粒体基因组变异与转录后调控有关 [28]。董霞 等研究表明富含甘氨酸的RNA结合蛋白GRPs基因可作为烟草水杨酸代谢途径中的一个标 记基因研究其途径对逆境的应答 [29]。
[0010] 综上所述，GR-RBPs蛋白在调节植物的逆境反应，提高植物的抗逆性中起着至关重 要的作用，对抗逆育种和农业生产会产生巨大推动作用和经济效益。因此，利用抗逆相关 RBP蛋白基因改良和提高作物的抗逆性具有非常重要应用前景。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是提供一种植物抗旱相关蛋白TaRBP2。
[0012] 本发明的再一目的是提供编码上述植物抗旱相关蛋TaRBP2的基因。
[0013] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0014] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的转基因细胞系。
[0015] 本发明的另一目的提供上述植物抗旱相关蛋白TaRBP2的应用。
[0016] 本发明所提供的抗旱、耐盐相关蛋白TaRBP2,来源于小麦品种京花9,其氨基酸序 列如SEQ ID NO. 1所示。
[0017] 本发明的蛋白由232个氨基酸残基组成。自SEQ ID NO. 1的氨基末端第31-73位 氨基酸残基是RRM结合域，自SEQ ID NO. 1的第154-185位氨基酸残基为丝氨酸/苏氨酸 结合域。
[0018] SEQ ID NO. 1
[0019]
【权利要求】
1. 一种植物抗旱相关蛋白TaRBP2,其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -种植物抗旱相关基因 TaRBP2,其特征在于，编码权利要求1所述的植物抗旱相关 蛋白 TaRBP2。
3. 如权利要求2所述的植物抗旱相关基因 TaRBP2,其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO. 2所示。
4. 包含权利要求2或3所述植物抗旱相关基因 TaRBP2的重组载体。
5. 包含权利要求2或3所述植物抗旱相关基因 TaRBP2的转基因细胞系。
6. 权利要求1所述植物抗旱相关蛋白TaRBP2提高植物抗寒性的应用。
7. 权利要求2或3所述植物抗旱相关基因 TaRBP2的应用。
【文档编号】C12N15/29GK104292318SQ201410117687
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】高世庆, 赵昌平, 唐益苗, 杨涛 申请人:北京市农林科学院