痕量rna实时动态检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种痕量RNA实时动态检测方法，包括以下步骤：A1、首先进行DNA探针在芯片上的包被；A2、然后将待检痕量RNA与预先包被的DNA探针杂交，再加入DSN酶以降解杂交双链中的DNA，使RNA游离出来与DNA探针杂交，进而RNA-DNA复合物中的DNA继续被DSN降解，再次使RNA游离出来，重复上述过程，可以使体系中所有RNA-DNA复合物中的DNA均可被DSN酶降解。由于芯片上包被的DNA探针的量与SPR角度值成正相关，随着芯片上的DNA探针被逐渐酶切，导致其SPR角度值逐渐改变，通过该SPR角度值的变化对靶分子RNA进行快速定量实时检测。
【专利说明】痕量RNA实时动态检测方法【技术领域】
[0001]本发明涉及检验【技术领域】，尤其涉及的是一种痕量RNA实时动态检测方法。
【背景技术】
[0002]核糖核酸RNA是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体，对基因的表达与蛋白质生物合成起重要的作用。在生物体内主要有四种不同的RNA分子，分别是信使 RNA (mRNA)、转移 RNA (tRNA)、核糖体 RNA (rRNA)、微小 RNA (microRNA，miRNA)。它们参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。最近的研究发现，miRNA表达与多种癌症相关，这些miRNAs所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能。要了解RNA在基因调控中扮演的角色，很关键的一个方法就是迅速、准确地定量检测RNA基因的表达。因此如果早期能对疾病进行分子水平RNA的检测，将为疾病的早期诊断提供重要的依据。
[0003]但是由于小分子RNA是一类很小的分子，部分小分子RNA表达水平极低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。传统常用的检测方法有Northern blot技术、RNA芯片技术和实时定量PCR技术三类。Northern blot技术是验证和确认RNA的重要方法，但该方法操作繁琐并且灵敏度低，不适用于临床样本的高通量检测芯片技术检测方法可以实现快速、高通量的检测，但其需要的RNA初始样本量大，并且以杂交为基础，因此无法区分单碱基差异的RNA，再者，芯片技术检测的结果为半定量，该方法的重现性和准确性较差，一般多用于初筛。实时定量PCR技术可以定量分析RNA的表达，且样本需要量较少，显著提高了敏感度，但对于miRNAs检测存在以下问题，由于成熟miRNAs长度较短，难以针对成熟miRNAs设计有效的特异性引物和探针，只能用前体miRNAs来代替，因此无法真实体现相应的成熟miRNAs水平。另外，实时定量PCR是基于体外扩增的技术，易受扩增温度的影响，后来演变出以滚环扩增(RCA)技术为代表的等温扩增技术，可以实现低丰度核酸的等温检测。然而该技术同样存在着如下缺陷，当前，RCA均相检测RNA多采用荧光染料与DNA产物相结合并产生强荧光进行检测，但由于荧光染料与溶液中的DNA和RNA都能结合，在实际样品分析时易使检测的背景值偏高，降低检测的灵敏度。并且，上述实时定量PCR技术、RCA技术都是是以扩增为基础，检测结果的特异性存在风险，极大的限制了核酸检测技术的应用。因此，实现无需荧光标记无需核酸扩增的低丰度核酸直接检测和实时动态监测将是方法学上的一大突破。
[0004] 双链特异性核酸酶(Duplex-specificnuclease, DSN)能够选择性降解DNA-RNA杂交体中的DNA，对单链核酸分子几乎没有作用，因此是构建RNA文库中的最经典工具之一。近年来，有文献报道了将DSN用于miRNA检测，其原理也是基于DSN能够选择性降解DNA-RNA杂交体中的DNA。通过使体系中RNA与DNA探针杂交，再运用DSN酶切DNA-RNA双链中的DNA单链，使RNA单链游离后继续与预先包被的DNA探针进行杂交。重复上述“杂交-酶切-游离”过程即可实现检测信号的放大。然而上述方法有两个问题尚无法克服:DmiRNA检测技术是基于终点观测，无法动态观测miRNA-DNA结合与选择性酶切这一动态过程，因此检测结果的可靠性受到质疑。2)由于芯片上的包被的DNA数量是有限的(过高则存在较大空间位阻，过低则灵敏度差)，从而使得上述miRNA检测的最低检出限差，无法真正实现临床样本中低浓度miRNA的无扩增直接检测。
[0005]表面等离子体共振(SPR)技术可以实时动态监测生物大分子间的反应，是观测生物分子结合与解离的可靠检测技术。本发明拟通过SPR技术平台构建能够实时动态监测痕量RNA的核酸检测技术。并且通过发明一维碳纳米材料石墨烯金膜包被技术和纳米金修饰探针技术，数量级放大已包被的DNA探针质量信号，结合DSN的循环酶切技术，从而指数级提高检测灵敏度，从而实现RNA的无需扩增直接检测与动态观测。最终建立一套“可视化” DSN信号放大RNA实时动态监测方法，以期为疾病的早期诊断提供可靠技术支撑(原理如图1所示)。为增强检测方法的灵敏度，引入了一种吸附性很强的石墨烯，通过构建的石墨烯芯片实现高效包被DNA探针，同时，对DNA探针进行纳米金修饰，增加探针的质量，从而增大SPR的监测信号。另外，石墨烯芯片上的石墨烯可以将纳米金与芯片上的金膜物理隔离，避免造成SPR信号干扰。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的灵敏度不足和无法实时动态观测的问题提供一种痕量RNA实时动态检测方法。
[0007]本发明的技术方案如下:
[0008]一、首先进行DNA探针在芯片上的包被；包括如下方法:石墨烯系统，纯金膜-巯基系统，短链羧化物-氨基系统(如常用的链酶亲和素-生物素)。
[0009]二、然后将待 检痕量RNA与预先包被的DNA探针杂交，再加入DSN酶以降解杂交双链中的DNA，使RNA游离出来与DNA探针杂交，进而RNA-DNA复合物中的DNA继续被DSN降解，再次使RNA游离出来，重复上述过程,可以使体系中所有RNA-DNA复合物中的DNA均可被DSN酶降解。
[0010]三、由于芯片上包被的DNA探针的量与SPR角度值成正相关，随着芯片上的DNA探针被逐渐酶切，导致其SPR角度值逐渐改变，利用表面等离子体共振(SPR)平台，可观测每个时刻SPR角度值的变化，其反映了检测RNA每个时刻的情况，通过该SPR角度值的变化可对靶分子RNA进行快速定量实时检测。本方法可根据酶切完全时间来定量RNA，或者确定某一时刻根据相应的SPR角度值来定量RNA。
[0011]四、为了增大DNA探针在SPR上的监测信号，以纳米金修饰DNA探针。
[0012]五、构建了石墨稀芯片以闻效包被DNA探针,确保检测的灵敏度。同时，石墨稀可以将纳米金与芯片上的金膜物理隔离，从而避免SPR信号干扰。
[0013]六、酶切过程中加入的双链特异性核酸酶(DSN)的反应温度可在20°C -50°C，这里首选37 °C作为反应最适温度。
[0014]七、为了增强DSN酶在反应过程中的活性，可加入一定浓度SDS，巯基乙醇，或者H202水溶液。
[0015]八、本方法利用表面等离子体共振(SPR)平台，可完成检测过程中对RNA水平的实时动态监测。
[0016]本发明具有以下有益效果:[0017]构建石墨烯芯片，以石墨烯的高亲和性提高包被DNA探针数量，以纳米金修饰DNA探针，增强单个探针的SPR信号，从而确保所包被探针具有较高的基础SPR信号。以双链特异性核酸酶(DSN)进行选择性酶切，既可以实现在等温情况下对痕量RNA的检测信号进行放大提高检测灵敏度，又可以利用DSN的酶切校正功能确保检测特异性。同时，包被的多层石墨烯可以将纳米金与芯片上的金膜物理隔离，从而避免SPR信号干扰。通过表面等离子体共振(SPR)技术实现痕量RNA的无需标记实时监测。有机整合上述方案可实现痕量RNA恒温实时监测。同时本方法适合各种RNA分子的检测，实用性广。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1DSN对于双链的切割过程原理图；
[0019]图2DSN在不同条件下活性的检测电泳图；
[0020]图3石墨稀芯片构建不意图；
[0021]图4石墨烯系统纳米金DNA探针包被前后及解离后SPR图；
[0022]图5纯金膜-巯基系统DNA探针包被前后及解离后SPR图；
[0023]图6短链羧化物-氨基系统DNA探针包被前后及解离后SPR图；
[0024]图7DNA探针包被、miRNA21杂交及DSN酶切动态过程图；
[0025]图8不同浓度miRNA21杂交标准曲线图；
[0026]图9DNA探针与miRNA特异性检测图；
[0027]图10不同浓度miRNA酶切时间比较图；
[0028]图1lmiRNA酶切完全时间标准曲线图；
[0029]图12定量检测miRNA21标准曲线图；
[0030]图13验证DSN活性最适条件图；
[0031]图14石墨烯系统RNA的DNA探针包被前后及解离后SPR图；
[0032]图15RNA的DNA探针包被、RNA杂交及DSN酶切动态过程图；
[0033]图16不同浓度RNA杂交标准曲线图；
[0034]图17RNA的DNA探针与RNA特异性检测图；
[0035]图18不同浓度RNA酶切时间比较图；
[0036]图19RNA酶切完全时间标准曲线图；
[0037]图20定量检测RNA标准曲线图。
【具体实施方式】
[0038]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0039]具体实施方案一(检测痕量miRNA):
[0040]一、双链特异性核酸酶(DSN)酶切条件的优化
[0041]双链特异性核酸酶(DSN)最适反应温度为60°C，本实验需要采用SPR技术，而SPR芯片的运行温度不超过50°C。所以需要找到某种特定浓度的物质使酶在37°C有较高的活性。
[0042]1.双链特异性核酸酶(DSN)分装(由everogen公司生产的DSN试剂盒)
[0043]2.在整个反应体系(3ul 双 链 DNA，lullOXDSNmasterbuffer，lulDSN 酶)中加入5ul2%的SDS，优化得到的双链特异性核酸酶(DSN)的最适反应条件，保证最终SDS占1%。
[0044]在1.5%琼脂糖、TBE缓冲液、80V电压下，电泳30min。(图3) M: 2000的marker,1.模板+37°C +未酶切，2.模板+37°C +酶切，3.模板+37°C +酶切+1%SDS，4.模板+65°C +酶切，5.模板+65°C +酶切+1%SDS。参考图3，通过1.5%琼脂糖电泳验证DSN酶的活性，每个泳道的DNA加样量为200ng ;泳道1-DNA模板在37°C孵育未加DSN酶，泳道2-DNA模板与DSN酶在37°C孵育，泳道3-DNA模板与DSN酶、1%SDS在37°C共同孵育，泳道4-DNA模板与DSN酶在65 °C孵育，泳道5-DNA模板与DSN酶、1%SDS在65 °C共同孵育。
[0045]泳道I在IOObp处可见高亮度的DNA条带，泳道2、3、4在IOObp处模糊可见DNA条带的痕迹，泳道5在IOObp处可见亮度明显高于泳道2、3、4的DNA条带，泳道3、5在750bp处的条带痕迹是未溶解的SDS。
[0046]该实验结果说明在37°C时加入1%的SDS’ DSN具有较好的酶切活性，在65°C时加入1%的SDS，DSN的酶切活性明显受到抑制，使泳道5可以看见明显条带。
[0047]二、DNA探针和miRNA的合成(由上海生物工程公司合成)
[0048]1.合成 miRNA21:UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
[0049]2.合成 miRNA21 的 DNA 探针 ATCGAATAGTCTGACTACAACT，在探针的 5 ‘端进行纳米金修饰(Pl)
[0050]3.合成 miRNA21 的 DNA 探针 ATCGAATAGTCTGACTACAACT，在探针的 5 ‘端进行巯基修饰(P2) [0051]4.合成 miRNA21 的 DNA 探针 ATCGAATAGTCTGACTACAACT，在探针的 5 ‘端进行氨基修饰(P3)
[0052]三、DNA探针在芯片上的包被(三种方法)
[0053](一)方法一:利用石墨烯高亲和性包被探针Pl
[0054]1.从炭美石墨烯产品网络销售中心购买浓度为3mg/ml的氧化石墨烯水溶液。
[0055]2.制作基底芯片(具体过程见图3):底层为石英玻璃(SiO2)，依次向上镀有5nm的钛(Ti)或者铬(Cr)金属层，50nm的金膜层。
[0056]3.构建石墨烯芯片:石墨烯芯片是通过电泳沉积分别使0.lmg/ml,0.3mg/ml,
0.5mg/ml,0.7mg/ml,0.9mg/ml的氧化石墨烯沉积到基底芯片上，电压均为150V,时间20s,(可控制电压、时间来决定沉积的氧化石墨烯的量)每个浓度做3组平行试验。通过SEM/AFM检测，筛选出氧化石墨烯沉积分布最均一的浓度，作为制备石墨烯芯片的最适浓度。这里首选0.5mg/ml的氧化石墨烯。
[0057]4.系统自动采样，采样容量是实际的样品量减去30微升，采样流速一般为5微升/min。采样成功后，停止采样，停止扫描，停止柱塞泵，系统进行自动包被Pl探针30-40min(包被前后数据图如图4)，参考图4，通过SPR对石墨烯芯片在0-1162S进行连续扫描，SPR角度值为68015毫度左右；P1探针包被后在1163-6500S对石墨烯芯片进行连续扫描，SPR角度值为69915毫度左右；6500s之后进行的是石墨烯芯片的再生处理，DNA解离后石墨烯芯片连续扫描的SPR角度值为68000毫度左右。该实验表明在SPR上Pl探针的包被和解离过程现象十分明显，可清晰的看见实验的动态过程。
[0058](二)方法二:巯基化DNA探针P2包被
[0059]1、没有点样的金芯片(金芯片UMPH0A600芯片由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供)首先用30%的H202对新芯片进行预处理，除去杂质，并使金膜表面暴露。
[0060]2、在SPR上进行P2探针的包被
[0061]P2探针的包被过程同包被方法(一)的步骤4，(包被前后数据图如图5)，参考图5，通过SPR对裸金芯片在0-1162s进行连续扫描，SPR角度值为67082毫度左右；P2探针包被后在1163-6500S对金芯片进行连续扫描，SPR角度值为67315毫度左右；6500s之后进行的是金芯片再生处理，DNA解离后金芯片连续扫描的SPR角度值为67051毫度左右。该实验表明在SPR上进行P2探针的包被和解离过程现象明显，可看见实验的动态过程。
[0062](三)方法三:氨基化DNA探针P3包被
[0063]1、表面为短链羧基的芯片(由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供)，该芯片可以偶联带有氨基、巯基、醛基、羟基、羧基的分子。
[0064]2、在SPR上进行P3探针的包被
[0065]P3探针的包被过程同包被方法(一)的步骤4，(包被前后数据图如图6)，参考图6，通过SPR对短链羧基的芯片在0-1162s进行连续扫描，SPR角度值为67155毫度左右；P3探针包被后在1163-6500S对金芯片进行连续扫描，SPR角度值为67409毫度左右；6500s之后进行的是金芯片再生处理，DNA解离后金芯片连续扫描的SPR角度值为67152毫度左右。该实验表明在SPR上进行P3探针的包被和解离过程现象明显，可看见实验的动态过程。
[0066]以上三种方法均可用 于DNA探针包被，这里我们为了增大DNA探针在SPR上的监测信号，以纳米金修饰DNA探针，所以选择石墨烯芯片以高效包被DNA探针，确保检测的灵敏度。同时，石墨烯可以将纳米金与芯片上的金膜物理隔离，从而避免SPR信号干扰。
[0067]以下则是选用石墨烯芯片包被DNA探针对本专利具体实施方案进行说明。
[0068]四、SPR用于实时监测miRNA与DNA探针的杂交
[0069]1、加入50ul含20uM的纳米金修饰的DNA探针Pl混合体系，进行DNA探针包被；
[0070]2、40min后，加入50 μ I的miRNA21和IU/ μ IDSN酶的混合体系，使其进行反应；
[0071]3、37摄氏度下反应60min，期间采用SPR仪器自动采样并记录反应后的SPR曲线。图7中SPR角度为68000毫度时，是石墨烯芯片的角度值；74000毫度时，是完成了 Pl探针的包被此时石墨烯芯片的角度值；之后图中曲线呈不规则下降，是加入了 miRNA21和DSN酶，杂交和酶切共同作用的动态过程。
[0072]五、SPR检测miRNA的条件优化
[0073]1、向已经包被了固定浓度的Pl探针的石墨烯芯片上，加入50微升0.01nM的miRNA21,检测在30min时SPR角度值，同上步骤加入50微升0.1nM的miRNA21、lnM的miRNA21、IOnM的miRNA21、IOOnM的miRNA21，分别检测在30min时SPR角度值，绘制标准曲线(图8)。参考图8，该实验结果表明随着miRNA21浓度的增加，其与Pl探针杂交的效果呈上升趋势。
[0074]2、分别加入50微升30nM的碱基完全匹配、单碱基不匹配、双碱基不匹配、三碱基不匹配、四碱基不匹配、完全不匹配的靶分子序列，判断该方法的特异性(附图9)。参考图9，该实验表明，杂交过程中加入的miRNA碱基不匹配，其酶切时间明显延长，结果明显受到影响，说明本方法特异性高。
[0075]3、向已经包被了固定浓度的Pl探针的石墨烯芯片上，加入50微升不同浓度的miRNA21和IU/μ IDSN酶混合体系，检测其酶切完成的时间，观察酶切过程。miRNA的浓度分别为 0.03ηΜ(0.01lng)，0.3ηΜ(0.ling)，3ηΜ(1.lng)，30nM(llng)，60nM(22ng).(附图10)。参考图10，该实验说明，在包被了等量的Pl探针石墨烯芯片上，加入等量的DSN酶，随着加入miRNA21浓度的增加，酶切杂交的时间将会缩短。
[0076]4、向已经包被了固定浓度的Pl探针的石墨烯芯片上，加入50微升不同浓度的miRNA21和IU/μ IDSN酶混合体系，检测其杂交酶切完成的时间，绘制标准曲线。miRNA的浓度分别为0.01nM, 0.1nM, InM, IOnM, IOOnM.(附图11)。参考图11，该实验说明，在包被了等量的Pl探针石墨烯芯片上，加入等量的DSN酶，随着加入miRNA21浓度的增加，杂交酶切完全时间呈下降趋势。
[0077]六、定量检测的标准曲线绘制
[0078]在已经包被了固定浓度的Pl探针的石墨烯芯片上，加入50微升不同浓度的miRNA21和IU/ μ IDSN酶混合体系，在60min后，检测不同浓度miRNA21的SPR角度值，绘制标准曲线，miRNA21 的浓度分别为 0.0OlnM,0.01nM,0.1nM, InM, IOnM, IOOnM.(附图 12)。参考图12，在包被了固定浓度的PI探针石墨烯芯片上，当反应60min后，根据SPR角度值可定量miRNA21的浓度。[0079]具体实施方案二 (检测痕量RNA):
[0080]一、采用具体实施方案一所得的双链特异性核酸酶(DSN)最适反应条件进行验证试验。
[0081]在1.5%琼脂糖、TBE缓冲液、80V电压下，电泳30min。(附图13)M:2000的marker，
1.模板+37°C +未酶切，2.模板+37°C +酶切+1%SDS。参考图13，通过1.5%琼脂糖电泳试验对DSN酶活性验证，每个泳道的DNA加样量为200ng ;泳道1-DNA模板在37°C孵育未加DSN酶，泳道2-DNA模板与DSN酶、1%SDS在37 °C共同孵育。
[0082]泳道I在IOObp处可见高亮度的DNA条带，泳道2在IOObp处仅隐约可见DNA条
带的痕迹。
[0083]该实验结果再次验证在37°C时加入1%的SDS’ DSN具有较好的酶切活性。
[0084]二、DNA探针和RNA的合成(由上海生物工程公司合成)
[0085]1.合成RNA:人类胰岛素mRNA的部分序列:
[0086]ccugcagccc uuggcccugg aggggucccu gcagaagcgu ggcauugugg aacaaugcug
[0087]uaccagcauc ugcucccucu accagcugga gaacuacugc
[0088]2.合成 RNA 的 DNA 探针 atggtcgtag acgagggaga tggtcgacct,在探针的 5 ‘端加上纳米金(Ρ1')。
[0089]三、RNA的DNA探针P1’在石墨烯芯片上的包被同具体实施方案一的步骤三。(包被前后数据图如图14)，参考图14，通过SPR对石墨烯芯片在0-1162S进行连续扫描，SPR角度值为68500毫度左右；Ρ1'探针包被后在1163-6500S对石墨烯芯片进行连续扫描，SPR角度值为73000毫度左右；6500s之后进行的是石墨烯芯片再生处理，DNA解离后石墨烯芯片连续扫描的SPR角度值为68450毫度左右。
[0090]该实验表明在SPR上进行Ρ1'探针的包被和解离过程现象十分明显，可清晰的看见实验的动态过程。
[0091]四、SPR用于实时监测RNA与DNA探针的杂交同具体实施方案一的步骤四。
[0092]1、加入50ul含20uM的DNA探针混合体系，进行P1’探针包被；[0093]2、40min后，加入50 μ I的RNA和IU/ μ IDSN酶的混合体系，使其进行反应；
[0094]3、37摄氏度下反应60min，期间采用SPR仪器自动采样并记录反应后的SPR曲线。图15中，SPR角度值为68000毫度时，是石墨烯芯片的角度值；75000毫度时，是完成了 P1’探针包被此时石墨烯芯片的角度值；之后图中曲线呈不规则下降，是加入了 RNA和DSN酶，杂交和酶切共同作用的动态过程。
[0095]五、SPR检测RNA的条件优化同具体实施方案一的步骤五。
[0096]1、向已经包被了 ΡI探针的石墨烯芯片上，加入50微升0.01nM的RNA，检测在30min时SPR角度值，同上步骤加入50微升0.1nM的RNA、InM的RNA、IOnM的RNA、IOOnM的RNA，分别检测在30min时SPR角度值，绘制标准曲线(附图16)。图16中，实验结果表明随着RNA浓度的增加，其与ΡI探针杂交的效果呈上升趋势。
[0097]2、分别加入50微升30nM的碱基完全匹配、单碱基不匹配、双碱基不匹配、三碱基不匹配、四碱基不匹配、五碱基不匹配的靶分子序列，判断该方法的特异性(附图17)。图17中，实验表明，杂交过程中加入的RNA碱基不匹配，其酶切时间明显延长，结果明显受到影响，说明本方法特异性高。
[0098]3、向已经包被了固定浓度的ΡI探针石墨烯芯片上，加入50微升不同浓度的RNA和IU/μ IDSN酶混合体系，检测其酶切完成的时间，RNA的浓度分别为0.03nM(0.01lng)，
0.3nM(0.llng)，3nM(l.lng)，30nM(ling)，60nM(22ng)(附图 18)。参考图 18，该实验说明，在包被了等量的ΡI探针石墨烯芯片上，加入等量的DSN酶，随着加入RNA浓度的增加，酶切杂交的时间将会缩短。 [0099]4、向已经包被了固定浓度的ΡI探针的石墨烯芯片上，加入50微升不同浓度的RNA和lU/μ IDSN酶混合体系，检测其杂交酶切完成的时间，绘制标准曲线。RNA的浓度分别为0.01nM, 0.1nM, InM, IOnM, IOOnM.(附图19)。参考图19，该实验说明，在包被了等量的ΡI探针石墨烯芯片上，加入等量的DSN酶，随着加入RNA浓度的增加，杂交酶切完全时间呈下降趋势。
[0100]六、定量检测的标准曲线绘制同具体实施方案一的步骤六。
[0101]在已经包被了固定浓度的ΡI探针的石墨烯芯片上，加入50微升不同浓度的RNA和IU/ μ IDSN酶混合体系，在60min后，检测不同浓度RNA的SPR角度值，绘制标准曲线，RNA的浓度分别为 0.0OlnM, 0.01nM, 0.1nM, InM, IOnM, IOOnM.(附图 20)。参考图 20，在包被了固定浓度的ΡI探针石墨烯芯片上，当反应60min后，根据SPR角度值可定量RNA的浓度。
[0102]应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
[0103]
【权利要求】
1.一种痕量RNA实时检测方法，其特征在于，包括以下步骤: Al、首先进行DNA探针在芯片上的包被；包括如下方法:石墨烯系统，纯金膜-巯基系统，短链羧化物-氨基系统(如常用的链酶亲和素-生物素)； A2、然后将待检痕量RNA与预先包被的DNA探针杂交，再加入DSN酶以降解杂交双链中的DNA，使RNA游离出来与DNA探针杂交，进而RNA-DNA复合物中的DNA继续被DSN降解，再次使RNA游离出来，重复上述过程，可以使体系中所有RNA-DNA复合物中的DNA均可被DSN酶降解； A3、由于芯片上包被的DNA探针的量与SPR角度值成正相关，随着芯片上的DNA探针被逐渐酶切，导致其SPR角度值逐渐改变，利用表面等离子体共振(SPR)平台，可观测每个时刻SPR角度值的变化，其反映了检测RNA每个时刻的情况，通过该SPR角度值的变化可对靶分子RNA进行快速定量实时检测；本方法可根据酶切完全时间来定量RNA，或者确定某一时刻根据相应的SPR角度值来定量RNA。
2.根据权利要求1所述的痕量RNA实时检测方法，其特征在于: Al、为了增大DNA探针在SPR上的监测信号，以纳米金修饰DNA探针； A2、构建了石墨稀芯片以闻效包被DNA探针，确保检测的灵敏度；同时，石墨稀可以将纳米金与芯片上的金膜物理隔离，从而避免SPR信号干扰； A3、酶切过程中加入的双链特异性核酸酶(DSN)的反应温度可在20°C -50°C，这里首选，37 °C作为反应最适温度； A4、为了增强DSN酶在 反应过 程中的活性，可加入一定浓度SDS，巯基乙醇，或者H2O2水溶液； A5、本方法利用表面等离子体共振( SPR)平台，可完成检测过程中对RNA水平的实时动态监测。
【文档编号】C12Q1/68GK103882132SQ201410122611
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】罗阳, 邱晓沛, 张洪, 蒋天伦 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院