一种用于检测解脲脲原体的引物对、试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测解脲脲原体的引物对、试剂盒及其应用。本发明的引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ?ID?NO：1上的一段序列，所述下游引物为SEQ?ID?NO：1的互补序列上的一段序列。使用本发明的特异性引物对能够快速、灵敏、准确地从临床样品中检测解脲脲原体，这对于早期诊断、及时治疗和有效控制生殖道解脲脲原体感染极有意义。
【专利说明】—种用于检测解脲脲原体的引物对、试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及疾病检测【技术领域】，尤其涉及解脲脲原体的检测，特别涉及一种用于检测解脲脲原体的引物对、试剂盒及其应用。
【背景技术】[0002]生殖道感染(Reproductive Tract Infection, RTI)是指各种病源微生物和寄生虫感染于生殖道或是经生殖道感染的一组感染性疾病的统称，包括内源性、外源性、医源性及性传播等感染，该病主要发生于生育期。生殖道感染疾病危害性涉及到诸多方面，表现在:(I)危害人类生殖健康，所导致的严重后果包括慢性盆腔炎疼痛、男女不孕症、宫外孕、异位妊娠和感染HIV风险增加等。(2)RTI还会对新生儿的健康带来影响，很多性传播疾病(如梅毒、淋病、衣原体、乙肝、人类乳头状瘤病毒、单纯疱疹病毒和艾滋病毒)可以通过妇女的怀孕期、分娩期和哺乳期传给孩子，这被称为“垂直传播”，给婴儿的健康造成严重后果。另外RTI也会引起自然流产、胎膜早破、早产和由此产生的低出生体重以及死胎。当孕妇为淋病患者时，多达35%的妊娠结果为自然流产和早产，多达10%为围产儿死亡。当孕妇衣原体未经治疗，新生儿先天性感染几率为30%，每年有数千名新生儿因此而失明。(3)生殖道感染疾病影响避孕节育的安全性。(4)生殖道感染还可增加宫颈癌发生的危险。(5)生殖道感染会增加多种疾病混合感染的危险，例如淋病患者感染衣原体、支原体的概率为非感染者的3-5倍。RTI带来这些严重的后果，对男性、女性个人和他们的家庭乃至整个社区造成健康问题。在我国有生殖感染症状的育龄妇女比例高达34.1%，已婚育龄妇女的既往生殖感染率高达73%，同时生殖感染疾病发病率目前也正以30%的速度逐年增长。
[0003]妇女RTI疾病严重影响人类生殖健康，随着RTI发病率的上升，经济生产率受到影响，很多家庭的生活质量下降，RTI已经成为当今人类面临的重大社会问题。
[0004]解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum, UU)是主要的性传播疾病之一,是条件致病菌，当机体免疫力下降，菌群失调或长期滥用抗生素时能迅速繁殖，引起疾病。不断深入的基础和临床研究表明，解脲脲原体感染可引起非特异性泌尿生殖道炎症，可并发前列腺炎、附睾炎、输卵管炎、宫颈炎、膀胱炎等，与早产、流产、死胎、不孕有关，而且上行感染时，引起婴儿肺部与呼吸道疾病、早产儿支气管发育异常(BPD)和系统性感染。人被解脲脲原体感染后常缺乏特异性症状，极易形成隐匿性感染，使临床诊断相当困难。
[0005]UU 分为 2 个物种:Ureaplasma parvum (U.parvum)和 Ureaplasma urealyticum(U.urealyticum)。U.parvum 包含 4 种血清型(I, 3, 6, 14) ；U.urealyticum 包含 10 种血清型(2，4，5，7,8,9, 10, 11，12，13)，分为3个亚型，亚型I包含4种血清型(2，5，8和9)，亚型2包含4种血清型(4，10, 12和13)，亚型3包含2种血清型(7和11)。
[0006]临床检测中，大于85%的病患中被检测出是U.parvum,而感染U.parvum病患中血清型3或14(3和14的蛋白序列只有一个氨基酸不一样，故在临床检测上不区分)和血清型I是最常见的(血清型3或14和血清型I在沙眼生物型I中大概各占46%左右)；少于15%被检测出是U.urealyticum,而感染U.urealyticum大部分是亚型2 (62%)和亚型I (34%),所以感染Ureaplasma的病患中基本是U.parvum。
[0007]目前UU的实验室检测方法主要有涂片法、分离培养法、多重PCR法、酶免疫法。涂片法检出率低；分离培养法(液-固两步培养法)对培养条件苛刻，培养结果受诸多因素影响，阳性率偏低；多重、非对称PCR和荧光偏振检测技术，简单快速，经济，提高了确定性和时效，但需要特殊的设备和技术，而定量PCR需标记探针，成本增加；目前的酶免疫法检测也出现非特异性反应。有报道建立了免疫荧光检测法来检测UU，但还未在临床上大量试验和推广。传统的检测方法重复工作多，繁琐、时效低、费用高，且主观目测判断实验结果的假阳性和印象率偏高。
[0008]据报道在性传播疾病中，UU的感染率和危害性已经超过了淋球菌。UU利用本身表面抗原蛋白的易变性，逃避人体的免疫监控而长期潜伏在人体，进入子宫内膜，引起充血、水肿，进而导致不孕等疾病。UU可单独感染引起引起非淋菌性尿道炎，也可与淋球菌合并感染。目前，遂着社会发展、人们生活环境和传统文化观念的改变等因素，性病病原体感染率增加，UU感染率有逐年增高的趋势。早期治疗是预防脲原体所致疾病的关键，因此开发新的简便、快速检测方法，对早期诊断、治疗和控制至关重要。
[0009]自上世纪80年代起，分子生物学研究的不断深入，PCR技术开始广泛应用于微生物领域，该技术灵敏度好、特异性高，操作简单、快速，很大程度上缩短了诊断时间。
【发明内容】
[0010]针对现有技术的不足，本发明人通过PCR方法确定了一段解脲脲原体的保守序列，通过检测该段保守序列能够检测解脲脲原体的感染，所述保守序列具有SEQ ID N0:1所示的序列。因此，本发明的目的在于提供一种用于检测解脲脲原体的引物对，包括所述引物对的PCR检测试剂盒及其应用。使用本发明提供的解脲脲原体的特异性引物对能够快速、灵敏、准确地从临床样品中检测解脲脲原体，这对于早期诊断、及时治疗和有效控制生殖道解脲脲原体感染极有意义。
[0011]在第一方面，本发明提供一种用于检测解脲脲原体的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ ID NO:1上的一段序列，所述下游引物为SEQ ID N0:1的互补序列上的一段序列。
[0012]本发明人通过研究发现，SEQ ID NO:1是一段在解脲脲原体基因组上具有高度保守性的序列，而且相比于解脲脲原体基因组上的其它序列片段，该序列片段更容易扩增，针对该序列片段通过设计引物对取自人体(如女性生殖器)的样品进行PCR扩增能够判定解脲脲原体的感染情况。发明人针对该序列片段设计了多对引物进行PCR扩增，均能得到预期的扩增产物。而针对解脲脲原体基因组上的其它几个序列片段设计引物进行PCR扩增，没有得到预期的扩增产物。说明本发明的SEQ ID NO:1是易于扩增的序列片段，能够用于确定解脲脲原体的感染。
[0013]作为本发明的优选 技术方案，所述上游引物和下游引物的序列长度均为12-30个碱基，例如12个碱基、15个碱基、16个碱基、18个碱基、20个碱基、22个碱基、25个碱基、27个喊基或29个喊基等。
[0014]作为本发明的优选技术方案，所述上游引物的5’端起始于SEQ ID NO:1的第一个碱基；所述下游引物的5’端第一个碱基与SEQ ID NO:1的最后一个碱基互补。其中，SEQID NO:1的第一个碱基即5’端的首个碱基，最后一个碱基即3’端的首个碱基。这样的一对引物能够扩增出SEQ ID N0:1的全长序列，长度为151bp。
[0015]作为本发明的优选技术方案，所述上游引物和下游引物的PCR扩增产物的大小为100-151bp,例如 102bp、105bp、108bp、120bp、127bp、132bp、135bp、138bp、142bp、149bp 或151bp，优选105-151bp，更优选110_151bp。PCR扩增产物的大小具体是由引物对在SEQ IDNO:1序列上的位置决定的。
[0016]作为本发明的优选技术方案，所述引物对的扩增产物为SEQ ID NO:USEQ ID NO:
8、SEQ ID N0:13 或 SEQ ID NO: 18，大小分别为 151bp、139bp、127bp 和 llObp。
[0017]作为本发明的优选技术方案，所述上游引物选自SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14 或 SEQ ID NO:16 ;所述下游引物选自 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:170可以从上游引物的具体例中选择一个引物与从下游引物的具体例中选择的一个引物配对进行PCR扩增。[0018]作为本发明的优选技术方案，所述引物对选自下列任一项:
[0019](a)所述上游引物为SEQ ID NO:2，所述下游引物为SEQ ID NO:3 ；
[0020](b)所述上游引物为SEQ ID NO:4，所述下游引物为SEQ ID NO:5 ；
[0021](c)所述上游引物为SEQ ID NO:6，所述下游引物为SEQ ID NO:7 ；
[0022](d)所述上游引物为SEQ ID NO:9，所述下游引物为SEQ ID NO:10 ；
[0023](e)所述上游引物为SEQ ID NO:11，所述下游引物为SEQ ID NO:12 ；
[0024](f)所述上游引物为SEQ ID NO:14，所述下游引物为SEQ ID NO:15 ；
[0025](g)所述上游引物为SEQ ID NO:16，所述下游引物为SEQ ID NO:17。
[0026]本发明人使用(a)~(g)中的7对引物进行PCR扩增，分别得到151bp、151bp、139bp、139bp、127bp、127bp和IlObp的扩增产物，与预期相符，因此可使用这7对引物作为检测解脲脲原体感染的引物对。
[0027]在第二方面，本发明提供一种解脲脲原体的PCR检测试剂盒，包括第一方面所述的引物对。
[0028]作为本发明的优选技术方案，所述PCR检测试剂盒还包括PCR缓冲液、MgCl2溶液、dNTPs和Taq DNA聚合酶。
[0029]在第三方面，本发明提供一种第一方面所述的引物对在作为解脲脲原体的PCR检测试剂盒的特异性引物或作为解脲脲原体的基因芯片探针序列中的应用。
[0030]本发明的有益效果为:本发明人研究发现了一段解脲脲原体的保守序列SEQ IDNO:1，该段保守序列易于扩增，具有高度的解脲脲原体特异性，本发明针对该序列设计了引物对，使用本发明提供的引物对扩增临床样品，能够快速、灵敏、准确地从临床样品中检测解脲脲原体，对于早期诊断、及时治疗和有效控制生殖道解脲脲原体感染极有意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为本发明实施例1的引物对扩增临床标本的PCR扩增产物鉴定结果图，其中泳道Mr为DNA Marker,泳道I和2为从临床阳性样品(解脲脲原体感染)DNA中扩增的产物，泳道3为阴性对照。[0032]图2为本发明实施例1阳性扩增产物的测序结果图，其中，测序图谱上第169位A到319位T之间的序列为PCR产物的序列，与预计序列一致。
[0033]图3为本发明实施例1阳性扩增产物的测序结果与NCBI数据库中Blast比对结
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【具体实施方式】
[0034]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。
[0035]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
[0036]实施例中，pMD18-T载体、PCR buffer、MgCl2, dNTPs、Taq DNA 聚合酶和 DNALigation Kit 购自 Takara (大连)，DNeasy Plant Mini Kit 购自 Qiagen 公司。试剂盒保存于-20°C，尽量避免反复冻融。
[0037]实施例1:
[0038]本实施例以ACTAMCTAGTTTCTGTACACGATCC(SEQ ID NO:2)和 ACTAGCGMATTMTTGCCCCTG(SEQ ID NO:3)作为弓丨物对扩增临床样本。
[0039](I) PCR扩增反应
[0040]准备好3支PCR 反应管，分别向其中加入临床阳性样品DNA和阴性对照样品，随后分别加入0.1yL Taq 酶、0.8μ L dNTPs (2.5mM)U μ L PCR buffer (10*PCR buffer),
0.6μ L MgCl2(25yM)、0.1 μ L上游引物(100 μ M)和 0.1 μ L下游引物(100 μ Μ)，用 ddH20补充至总体积10 μ L。将已经加好样的PCR管放置PCR仪上，设置PCR反应参数(见表1)，进行扩增；反应结束后，用1%的琼脂糖凝胶进行鉴定，结果如图1，样品大小结果与预计大小相符，阴性结果正常。
[0041]表1PCR反应参数
【权利要求】
1.一种用于检测解脲脲原体的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQID NO:1上的一段序列，所述下游引物为SEQ ID NO:1的互补序列上的一段序列。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述上游引物和下游引物的序列长度均为12-30个碱基。
3.根据权利要求1或2所述的引物对，其特征在于，所述上游引物的5’端起始于SEQID NO:1的第一个碱基；所述下游引物的5’端第一个碱基与SEQ ID NO:1的最后一个碱基互补。
4.根据权利要求1或2所述的引物对，其特征在于，所述上游引物和下游引物的PCR扩增产物的大小为100-151bp，优选105-151bp，更优选110-151bp。
5.根据权利要求1-4任一项所述的引物对，其特征在于，所述引物对的扩增产物为SEQID NO:U SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13 或 SEQ ID NO:180
6.根据权利要求1-5任一项所述的引物对，其特征在于，所述上游引物选自SEQIDNO:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:14 或 SEQ IDNO:16 ;所述下游引物选自 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQID NO:12, SEQ ID NO:15 或 SEQ ID NO:17。
7.根据权利要求1-6任一项所述的引物对，其特征在于，所述引物对选自下列任一项: Ca)所述上游引物为SEQ ID NO:2，所述下游引物为SEQ ID NO:3 ； (b)所述上游引物为SEQID NO:4，所述下游引物为SEQ ID NO:5 ； (c)所述上游引物为SEQID NO:6，所述下游引物为SEQ ID NO:7 ； Cd)所述上游引物为SEQ ID NO:9，所述下游引物为SEQ ID NO:10 ； Ce)所述上游引物为SEQ ID NO:11，所述下游引物为SEQ ID NO:12 ； Cf)所述上游引物为SEQ ID NO:14，所述下游引物为SEQ ID NO:15 ； (g)所述上游引物为SEQ ID NO:16，所述下游引物为SEQ ID NO:17。
8.一种解脲脲原体的PCR检测试剂盒，包括权利要求1-7任一项所述的引物对。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR缓冲液、MgCl2溶液、dNTPs和Taq DNA聚合酶。
10.一种权利要求1-7任一项所述的引物对在作为解脲脲原体的PCR检测试剂盒的特异性引物或作为解脲脲原体的基因芯片探针序列中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103882133SQ201410125738
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月31日 优先权日:2014年3月31日
【发明者】黄钟, 李小青 申请人:深圳意达凯生物科技有限公司