用于检测原发性胆汁性肝硬化的血清miRNA标志物及标志物组合及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属生物【技术领域】，涉及一种用于区分原发性胆汁性肝硬化与正常人的血清miRNA标志物及标志物组合及应用。本发明的用于检测原发性胆汁性肝硬化的血清miRNA标志物为下列三种has-miRNA中的一种：has-miR-122、has-miR-34a、has-miR-141。本发明的用于检测原发性胆汁性肝硬化的miRNA探针，具有以下序列中的一种：SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.2、SEQ?ID?No.3。本发明能够实现原发性胆汁性肝硬化的早期发现以及迅速的无创性检测。
【专利说明】用于检测原发性胆汁性肝硬化的血清mi RNA标志物及标志物组合及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及本发明属生物【技术领域】，涉及一种用于区分原发性胆汁性肝硬化与正常人的血清miRNA标志物及标志物组合及应用。
【背景技术】
[0002]原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是一种慢性炎症性、进行性肝内胆汁游积性自身免疫性病，以血清出现抗线粒体抗体(antimitochondrialantibody，ΑΜΑ)、肝脏门脉周围淋巴细胞浸润、小胆管特异性破坏为特征，最终发展成肝硬化和肝衰竭[1，2]。目前PBC诊断主要依赖于外周血AMA抗体和肝脏病理。虽然AMA对于PBC诊断敏感性达高达90%，但该抗体也可存在于其他自身免疫病，特异性不高，而PBC患者中也常常存在AMA阴性者；其次，该抗体也与疾病活动程度、预后无相关性；再者，对于早期肝脏生化指标正常但AMA阳性的患者或者AMA阴性但胆管酶增高的患者，则必须通过肝穿刺才能明确诊断，因较大创伤性、风险及花费常使诊断受到很大限制。因而目前仅血清中特异性自身抗体己经无法满足临床需求，积极寻找与疾病诊断和预后相关的新的疾病标志物，能有助于临床诊断和治疗水平提高[3]。
[0003]miRNA (microRNA)是一类内源性非编码单链小分子RNA，长度为18~24个核苷酸。miRNA普遍存在于人类的体液中，性质稳定，可以定量检测，且存在显著的疾病特异性。近年的研究表明，血液、唾液、尿液、乳汁及脑脊液等体液miRNA检测可应用于妊娠等生理状态的判断以及口腔癌、膀胱癌及阿尔海默茨病等疾病的诊断和预后判断。体液特异性miRNA检测的临床意义及应用前景已引起高度关注，miRNA作为一类非编码调节性的小分子RNA有可能取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物。体液miRNA含量丰富且性质稳定，具备成为优异生物标志物的潜质，并且拥有以蛋白质为代表的传统生物标志物不具备的特性，无需抗体制备且易于精确定量，可能克服抗原抗体类生物标志物的制备瓶颈。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够用于原发性胆汁性肝硬化的早期发现以及进行快速的无创性检测的血清miRNA标志物及标志物组合及应用。
[0005]本发明的用于检测原发性胆汁性肝硬化的血清miRNA标志物为下列三种has-miRNA 中的一种:has_miR-122、has_miR-34a、has-miR-141。
[0006]本发明的一种用于检测原发性胆汁性肝硬化的血清miRNA标志物组合包括上述三种 has-miRNA。
[0007]本发 明的用于检测原发性胆汁性肝硬化的miRNA探针，具有以下序列中的一种:SEQ ID N0.USEQ ID N0.2, SEQ ID N0.3。
[0008]本发明的用于检测原发性胆汁性肝硬化的miRNA探针组合，包括以下序列:SEQ IDN0.USEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3。[0009]上述用于检测原发性胆汁性肝硬化的miRNA探针或探针组合在制备检测原发性胆汁性肝硬化的试剂中的应用。
[0010]本发明的用于检测原发性胆汁性肝硬化的试剂盒，包括上述用于检测原发性胆汁性肝硬化的miRNA探针或探针组合，还包括Taq酶、氯化镁和PCR缓冲液。
[0011]本发明能够实现原发性胆汁性肝硬化的早期发现以及迅速的无创性检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是本发明实施例的两组mappable reads数据进行长度分析图；
[0013]图2是本发明实施例的22个在两组表达差异的miRNA聚类分析图；
[0014]图3是本发明实施例的健康对照组和原发性胆汁性肝硬化组分别验证miR-122、miR-141和miR-34a表达水平图；
[0015]图4是本发明实施例标志物miRNA-122的ROC曲线图；
[0016]图5是本发明实施例标志物miRNA_34a的ROC曲线图；
[0017]图6是本发明实施例标志物miRNA-141的ROC曲线图；
[0018]图7是本发明实施例标志物组合的ROC曲线图。
【具体实施方式】
[0019]研究对象
[0020]对照组为在本院体检的健康志愿者；实验组为PBC患者，基本情况见表1，根据美国肝病研究学会(American Association for the Study of Liver Diseases, AASLD) 2009年制定的原发性胆汁性肝硬化指南:以下3条中符合2条或以上者即可诊断为PBC:ALP等反映胆汁游积的生化指标升高；抗线粒体抗体(AMA)阳性；病理上出现非化脓性破坏性胆管炎及小叶间胆管的损害。排除标准:肝内局部胆管梗阻或肝外胆管梗阻；病毒性肝炎、酒精性肝病、药物性肝损伤、妊娠期肝内胆汁游积症；自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎；合并其他自身免疫性疾病，或其他自身免疫性疾病肝损伤；系统性疾病伴有肝损伤。[0021 ] 表1筛选差异miRNA血清标本基本情况
[0022]
【权利要求】
1.一种用于检测原发性胆汁性肝硬化的血清miRNA标志物，为下列三种has_miRNA中的一种:has_miR-122、has_miR-34a、has-miR-141。
2.一种用于检测原发性胆汁性肝硬化的血清miRNA标志物组合，包括以下三种has-miRNA:has_miR-122、has_miR-34a、has-miR-141。
3.一种用于检测原发性胆汁性肝硬化的miRNA探针，具有以下序列中的一种:SEQ IDN0.USEQ ID N0.2, SEQ ID N0.3。
4.一种用于检测原发性胆汁性肝硬化的miRNA探针组合，包括以下序列:SEQ IDN0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3。
5.权利要求3或4的检测原发性胆汁性肝硬化的miRNA探针或探针组合在制备检测原发性胆汁性肝硬化的试剂中的应用。
6.一种用于检测原发性胆汁性肝硬化的试剂盒，包括权利要求3的用于检测原发性胆汁性肝硬化的miRNA探针或权利要求4的用于检测原发性胆汁性肝硬化的miRNA探针组合；还包括Taq酶、氯化镁和PCR缓冲液。
【文档编号】C12Q1/68GK103898219SQ201410129734
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月1日 优先权日:2014年4月1日
【发明者】谭友文 申请人:镇江市第三人民医院