一种野生早熟禾aflp指纹图谱的建立方法及用途
【专利摘要】本发明公开了一种野生早熟禾AFLP指纹图谱的建立方法及用途，包括提取基因组DNA、酶切、连接、预扩增、选择性扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳6个步骤，得到高低不同的大量DNA条带，具有相同大小DNA条带的早熟禾种质被认为拥有同样的遗传位点，具有不同大小DNA条带的早熟禾种质被认为拥有不同的遗传位点，据此建立不同野生早熟禾种质的指纹图谱，用于早熟禾种质的鉴定、品种鉴别与种质保护。本发明的优点在于直接对早熟禾属植物基因组DNA进行检测，不受田间环境等因素对其表型性状的影响，另外，使用该方法可在幼苗期对其进行检测鉴定，缩短检测周期。
【专利说明】—种野生早熟禾AFLP指纹图谱的建立方法及用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种草坪草指纹图谱的建立方法及用途，具体地说，涉及一种野生早熟禾AFLP指纹图谱的建立方法及用途。
【背景技术】
[0002]DNA分子标记是20世纪80年代以后逐渐发展起来的，该技术用各种处理方法(限制性酶切、PCR扩增、分子杂交、电泳检测)对不同群体或个体之间的基因组DNA进行处理之后使DNA片段的多态性表现出来，对于这些多态性片段的标记、统计和分析可被用于各方面的研究，如遗传多样性、种质资源的分离和鉴定等，在DNA的水平上反应个体或种群间的遗传差异，使得分析的准确性大大提高。分子标记具有其他标记所不能替代的优点，第一，分子标记稳定性高，由于直接在DNA水平上表现其多样性，不受植物组织器官部位和发育时期，以及环境和季节的限制，使其应用更加广泛；第二，由于DNA于整个基因组，所以检测容易；第三，由于分子标记检测的是等位基因的变异，自然存在于种质资源体内，所以其多态性较高；第四，共显性的分子标记可检测出杂合基因型与纯合基因型，而且不影响目标性状的表达。当前应用最为广泛的分子标记技术有AFLP、RAPD, SSR、ISSR、RFLP, SNP和SRAP
[0003]AFLP,即扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthpolymorphism),是一种检测基因组DNA多态性的有效方法，其原理是基于对植物基因组总DNA进行酶切和连接后，进行PCR扩增，得到的限制片段进行选择。AFLP技术仅需要少量的DNA，无需预先知道DNA序列信息和Southern杂交便可完成对扩增片段的检测，实验结果较稳定，重复性好，而且获得信息量大，可以确定亲本之间的遗传差异和亲缘关系，从而确定其遗传距离，进而划分杂交优势，提高杂种优势潜力。因此，AFLP技术非常适用于构建遗传连锁图、绘制指纹图谱以及遗传多样性的研究。
[0004]DNA指纹可以同时在多个位点上提供可靠的遗传标记，其稳定性、可靠性和高度个体特异性均提高了遗传分析的效率。AFLP分子标记技术既可用于检测品种的质量和纯度，也可检测植物种间、种内的遗传差异，为引种及濒危植物的考察和保护工作提供理论基础。高质量的指纹图谱可作为新品种登记、注册和产权保护的重要依据。AFLP技术所检测的位点数多，使鉴定具有高度的准确性，高效性。
[0005]Che等用4个AFLP引物组合得到15条谱带的指纹图谱，可区分30份西瓜种质。Aranzana等对210个桃品种做AFLP分析，47个AFLP标记可区分196个品种，利用3对AFLP引物组合可区分187个桃品种。房经贵等采用AFLP技术，利用16对引物构建了 2个芒果育种亲本的指纹图谱，获得了 2个品种间分子水平上的多态性信息。鲁凤娟建立了梨树44个品种的AFLP指纹图谱。此外，AFLP分子标记还广泛应用于大豆、小麦、玉米和水稻等多种农作物以及蔬菜、果树、林木、花卉、微生物和动物的进化分类以及遗传育种等方面的研究。关于野生早熟禾AFLP指纹图谱方面的研究尚未发现相关报导。
【发明内容】
[0006]为了弥补现有技术中的空白，本发明提供一种野生早熟禾AFLP指纹图谱的建立方法及用途，直接对早熟禾属植物基因组DNA进行检测，不受田间环境等因素对其表型性状的影响，另外使用该方法可在幼苗期对其进行检测鉴定，缩短检测周期。
[0007]其技术方案如下:
[0008]一种野生早熟禾AFLP指纹图谱的建立方法，包括基因组DNA提取、酶切、连接、预扩增、选择性扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳6个步骤，具体为:用改良的CTAB法提取野生早熟禾基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，然后对其进行双酶切(PCR)和酶切产物的检测(琼脂糖凝胶电泳)，用连接酶连接过夜后用预扩增引物进行预扩增(PCR)，经过扩增产物的筛选和电泳条件(电压、电流、功率和电泳时间)的调整，选出最优的引物和电泳条件，对预扩增产物进行扩增(PCR)，最后，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染程序可观察条带。
[0009]进一步优选，用改良的CTAB法提取野生早熟禾基因组DNA时，取0.5g新鲜的幼嫩叶片，以保证DNA的质量，提取过程中，氯仿:异戊醇体积比为24:1，且需要轻缓翻转离心管使其混匀，用75%乙醇洗涤沉淀两次，最后，将DNA保存于70 μ LTE中，放置在_20°C冰箱中备用，检测时使用0.8%琼脂糖凝胶。
[0010]酶切时，选用限制性内切酶EcoR I和Mse I，最佳酶切时间为3.5h ;连接所使用的连接酶为T4DNA连接酶，保持22°C 16h以上。
[0011]预扩增产物稀释倍数以10为宜；扩增时引物浓度为EcoR I primer50ng/μ L和Mse I primer50ng/yL分别取l.0yL，可达到最佳扩增效果。在对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时，最佳的功率为45w，电流为80mA，电压为1200v，进行电泳约2小时10分钟。
[0012]本发明所述野生早熟禾AFLP指纹图谱在早熟禾属植物种质资源的鉴定、品种鉴别与保护中应用。
[0013]与现有技术相比，本发明的有益效果:
[0014]本发明直接对早熟禾属植物基因组DNA进行检测，不受田间环境等因素对其表型性状的影响，另外使用该方法可在幼苗期对其进行检测鉴定，缩短检测周期。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是不同野生早熟禾种质材料AFLP指纹图谱，每一泳道为一个野生早熟禾材料，从左至右分别为
[0016]1.DNAMarker (GM335)
[0017]2.草地早熟禾(兴隆山)
[0018]3.草地早熟禾(天祝)
[0019]4.草地早熟禾(渭源)
[0020]5.草地早熟禾(肃南) [0021]6.草地早熟禾(清水)
[0022]7.草地早熟禾(夏河)
[0023]8.草地早熟禾(陇西)
[0024]9.草地早熟禾(安定)[0025]10.草地早熟禾(临洮)
[0026]11.草地早熟禾(康乐)
[0027]12.草地早熟禾(西和)
[0028]13.草地早熟禾(成县)
[0029]14.草地早熟禾(秦州区)
[0030]15.草地早熟禾(海晏)
[0031]16.硬质早熟禾(陇西)
[0032]17.硬质早熟禾(兰州)
[0033]18.硬质早熟禾(清水)
[0034]19.硬质早熟禾(渭源)
[0035]20.硬质早熟禾(兴隆山)
[0036]21.硬质早熟禾(肃南)
[0037]22.硬质早熟禾(临洮)
[0038]23.硬质早熟禾(天祝)
[0039]24.硬质早熟禾(安定)
[0040]25.硬质早熟禾(康乐)
[0041]26.硬质早熟禾(海晏)
[0042]27.小药早熟禾(渭源)
[0043]28.小药早熟禾(夏河)
[0044]29.小药早熟禾(清水)
[0045]30.小药早熟禾(康乐)
[0046]31.小药早熟禾(天祝)
[0047]32.波伐早熟禾(夏河)
[0048]33.波伐早熟禾(肃南)
[0049]34.波伐早熟禾(天祝)
[0050]35.波伐早熟禾(海晏)
[0051]36.一年生早熟禾(天祝)
[0052]37.一年生早熟禾(兰州)
[0053]38.一年生早熟禾(清水)
[0054]39.冷地早熟禾(天祝)
[0055]40.一年生早熟禾(夏河)
[0056]41.高原早熟禾(天祝)
[0057]42.西藏早熟禾(天祝)
[0058]43.华灰早熟禾(夏河)
[0059]44.细叶早熟禾(海晏)。
【具体实施方式】 [0060]下面结合具体实例进一步说明本发明的技术方案。
[0061]本发明将来自甘肃境内的39份、青海省的4份野生早熟禾材料用沙培的方法种植，幼苗期剪取叶片，提取基因组DNA，经过酶切、连接、预扩增、选择性扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到高低不同的大量DNA条带，具有相同条带的早熟禾种质被认为拥有同样的遗传位点，具有不同大小的DNA条带的早熟禾种质被认为拥有不同的遗传位点，据此建立不同野生早熟禾种质的指纹图谱，用于早熟禾种质的鉴定、品种鉴别与种质保护。
[0062]1、野生早熟禾基因组DNA提取
[0063](I)取0.5g野生早熟禾种质幼嫩叶片放入小研钵中，加入液氮研磨成粉末。
[0064](2)在离心管中加入600 μ LCTAB于65°C水浴预热，然后将研磨的冻粉装入其中，轻缓拌混均匀后，放入65°C恒温水浴锅中水浴30~50min，其间小心轻缓上下颠倒2~3次。
[0065](3)加入等体积氯仿:异戊醇(v/v，24:1)，反复缓慢翻转混匀，静置IOmin后10000r/min 离心 10 ~15min。
[0066](4)将上清液转移至另一离心管中，加入2/3倍体积的异丙醇，轻缓颠倒混匀，室温静置15min后10000r/min离心10min,去上清液。
[0067](5)用2ml70%的乙醇洗涤沉淀2次，室温下微干，溶于500 μ LTE缓冲液。
[0068](6)加入终浓度 50 μ g/ml 的 RNase，37°C保温 Ih。
[0069](7)用等体积的氯仿/异戊醇抽提I~3次。
[0070](8)上清液中加入终浓度为0.2~0.4mol/L的NaCl，2倍体积的无水乙醇，放置Ih左右，12000r/min离心10min,去除上清液。
[0071](9)用70%乙醇洗涤沉淀2~3次，自然干燥后溶于50~100 μ LTE中，保存于-20°C冰箱中备用。
[0072]2、DNA浓度和纯度检测
[0073](1)0.8%琼脂糖电泳检测
[0074]取43个材料的DNA4 μ L，稳压80V，在I X TBE中，于0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，用已知浓度的λ DNA为对照，估计各材料DNA的分子量大小和浓度，用浓度为0.5mg/mL的EB染色液染色，在凝胶成像系统中观察、拍照并记录。植物总DNA样品呈现一条相对分子质量较大、迁移率很小的整齐清晰的条带，表明所提的样品较纯，且没有降解现象；若点样孔处较亮，表明样品中含有蛋白质；样品前沿若有弥散物出现，表明样品中含有RNA。
[0075](2) DNA纯度及浓度检测
[0076]纯度:用紫外分光光度计对所提材料的DNA进行纯度检测。取10 μ LDNA,稀释100倍，测其OD值。纯DNA溶液其OD260/OD280比值应为1.8，OD260/OD230比值应大于2.0。
[0077]浓度:对于双链DNA的浓度为=C=OD26tlX稀释倍数X 1000 (ng/uL)。
[0078]3、AFLP反应体系的建立和优化
[0079](1)限制性酶切
[0080]选用限制性内切酶EcoR I和Mse I，反应体系为20 μ L:
[0081]
【权利要求】
1.一种野生早熟禾AFLP指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括基因组DNA提取、酶切、连接、预扩增、选择性扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳6个步骤，具体为:用改良的CTAB法提取野生早熟禾基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，然后对其进行双酶切和酶切产物的检测，用连接酶连接过夜后用预扩增引物进行预扩增，经过扩增产物的筛选和电泳条件的调整，选出引物和电泳条件，对预扩增产物进行扩增，最后，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染程序可观察条带。
2.根据权利要求1所述的野生早熟禾AFLP指纹图谱的建立方法，其特征在于，进一步优选，用改良的CTAB法提取野生早熟禾基因组DNA时，取0.5g新鲜的幼嫩叶片，提取过程中，氯仿:异戊醇体积比为24:1，翻转离心管使其混匀，用75%乙醇洗涤沉淀两次，最后，将DNA保存于70 μ LTE中，放置在_20°C冰箱中备用，检测时使用0.8%琼脂糖凝胶； 酶切时，选用限制性内切酶EcoR I和Mse I，酶切时间为3.5h ;连接所使用的连接酶为T4DNA连接酶，保持22°C 16h以上； 预扩增产物稀释倍数为10 ;扩增时引物浓度为EcoR I primer50ng/μ L和Mse Iprimer50ng/ μ L分别取1.0 μ L，在对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时，功率为45w，电流为80mA，电压为1200v，进行电泳约2小时10分钟。
3.权利要求1所述野生早熟禾AFLP指纹图谱在早熟禾属植物种质资源的鉴定、品种鉴别与保护中 应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103898220SQ201410131779
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】董沁, 白小明, 孙吉雄, 方强恩, 吕优伟, 雷娅伟, 王婷, 赵春旭, 贺佳圆 申请人:甘肃农业大学