一种用于检测小麦条锈菌细胞周期依赖性蛋白激酶2基因（Cdc2）SNP位点的方法
【专利摘要】一种用于检测小麦条锈菌细胞周期依赖性蛋白激酶2基因（Cdc2）SNP位点的方法，使用引物对条锈菌DNA在本发明规定的反应体系和反应条件下进行PCR扩增，然后测序，经过与标准序列比对，从而检测到所测序列的SNP位点，引物对：正向引物Cdc28S：5'AAATCATCCACATCTGCTCCAC3'，反向引物Cdc352A：5'TCCTACAAACCCCTCCAA3'。PCR反应体系：为30μl，其中，样品DNA，20ng/μl，1.5μl；PrimerS和A（10μM）各1.5μl；2×TaqPCRMasterMix，15μl；ddH2O，10.5μl。2×TaqPCRMasterMix成分：0.1UTaqPolymerase/μl，500μMdNTPeach，20mMTris-HCl(PH8.3)，100mMKCl，3mMMgCl2，其它稳定剂和增强剂。PCR反应条件：（96℃，5min）1cycle；（96℃，25s，62℃，25s，72℃，45s）34cycles；72℃延伸5min。
【专利说明】—种用于检测小麦条锈菌细胞周期依赖性蛋白激酶2基因(Cdc2)SNP位点的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于检测小麦条锈菌细胞周期依赖性蛋白激酶2基因(Cdc2)SNP位点的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism),即SNP,是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。SNP在植物病原真菌基因组中的发生频率较高，大约平均每1,000个碱基中就有一个多态位点(可变位点)，是继微卫星之后的第三代遗传标记。有些SNP位点还会影响基因的功能，从而导致生物性状改变甚至致病。基于SNP的这些特点，它被广泛用于植物病原真菌的起源、进化及基因漂移和致病相关基因的研究，在突变体检测、病原真菌鉴定和致病基因克隆等研究中起重要作用。SNP在小麦条锈菌的研究上处于起步阶段，在目前提交到GeneBank中的条锈菌的SNP位点目前尚无报道，检测条锈菌相关基因的引物及方法也未有发明专利的申请。基于这样的前提，本发明首次发明了检测条锈菌细胞周期依赖性蛋白激酶2基因(Cdc2) SNP位点的引物及检测方法。为研究者利用SNP研究条锈菌的起源、进化、传播及性状的改变等开创了新的方法。
[0003]目前对小麦条锈菌起源、进化、传播等分子群体遗传学研究主要是基于DNA指纹技术，如RAPD、SSR及AFLP等标记技术。这些指纹技术对研究条锈菌的起源及进化等研究，一是精确度不够，而是不能用于复杂的种群模型推断，且费工费时。而SNP技术是基于DNA序列，即通过测序而获得核算序列，相对于指纹技术更加精确，能够用于复杂的数学统计模型，且通过测序仪完成，操作简单，省工省时。该技术由于其本身的精确性，能在分子水平上揭示更多的细节，从而使我们发现以前的技术不能发现的问题，更深入地揭示条锈菌的起源、进化等一系列科学问题。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测小麦条锈菌细胞周期依赖性蛋白激酶2基因(Cdc2)SNP位点的方法。为研究人员通过测序来进行小麦条锈菌群体结构的研究发明了一种新的方法，操作简单，省工省时，且相对于现行的DNA指纹技术，更加精确和先进，更能揭示更多更深入的科学问题。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的方案是:使用本发明的专用引物对条锈菌进行PCR扩增，然后测序，经过与标准序列比对，从而检测到所测序列的SNP位点。
[0006]专用引物对:(正向引物Cdc28S:5’ AAATCATCCACATCTGCTCCAC3’，反向引物Cdc352A:5’ TCCTACAAACCCCTCCAA3’)。
[0007]PCR 反应体系:为 30 μ 1，其中，样品 DNA，20ng/ μ 1，1.5 μ I ；PrimerCdc28S 和Cdc352A (10μΜ)各 1.5μ I ；2 X TaqPCRMasterMix, 15 μ I ；ddH20,10.5 μ I。
[0008]2 X TaqPCRMasterMix 成分:0.1UTaqPolymerase/μ 1, 500 μ MdNTPeach,20mMTris-HCl (PH8.3)，IOOmMKCl，3mMMgCl2，其它稳定剂和增强剂。
[0009]PCR 反应程序:(96°C,5min) Icycle ; (96。。，25s，62。。，25s，72。。，45s) 34cycles ；72°C 延伸 5min。
[0010]对PCR产物进行测序，经过与标准序列比对，可检测到条锈菌Cdc2基因4个可变位点，分别位于模板5’端的第174位点由A变为T，突变频率为22% ;第303位点，由A变为G，频率为15% ;第316位点，由G变成T，或者缺失，突变频率为6%，缺失频率为18% ;第317位点，由T变为G，频率为13%。
[0011]说明书附图
[0012]图1为Cdc2基因的图象
[0013]编码区cds 为蓝色片段:cds (121..147，240..249，351..507，619..742，826..996，1065..1123，1195..1229，1320..1389，1506..1647，1732..1797，1896..1919)。[0014]图2为本发明引物相关信息
[0015]图3为条锈菌Cdc2基因可变位点分布
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明不限于这些实施例:
[0017]实施例1
[0018]专用引物对:(正向引物Cdc28S:5’ AAATCATCCACATCTGCTCCAC3’，反向引物Cdc352A:5’ TCCTACAAACCCCTCCAA3’)。
[0019]PCR 反应体系:为 30 μ 1，其中，样品 DNA, 20ng/ μ 1，1.5μ I ;PrimerS 和 A (10 μ Μ)各 1.5μ I ；2 X TaqPCRMasterMix, 15 μ I ；ddH20,10.5 μ L.[0020]2 X TaqPCRMasterMix 成分:0.IUTaqPolymerase/μ 1, 500 μ MdNTPeach,20mMTris-HCl (ΡΗ8.3)，IOOmMKCl，3mMMgCl2，其它稳定剂和增强剂。
[0021]PCR 反应条件:(96°C,5min) Icycle ; (96。。，25s，62。。，25s，72。。，45s) 34cycles ；72°C 延伸 5min。
[0022]利用小麦条锈菌夏孢子提取基因组DNA，浓度调整到20ng/ μ I作为工作液。按照发明的专用引物序列合成引物，并稀释到PCR所需10 μ M浓度。
[0023]扩增:按照反应体系把相应浓度的各组分相应的量加到PCR管中，配成总量为30μ I的反应液，然后置于PCR仪中，按本发明规定的反应条件设置程序，进行PCR反应。
[0024]测序:PCR反应结束后，取出反应液，送华大或上海生工等基因公司进行测序。
[0025]比对:以设计引物的小麦条锈菌Cdc2基因序列(GeneBank登录号GQ911579.1，全长2279bp)，作为标准序列，用所测序列与标准序列比对，采用BioEdit软件进行比对，即可检测到小麦条锈菌Cdc2基因的SNP可变位点及所在位置。
【权利要求】
1.一种用于检测小麦条锈菌细胞周期依赖性蛋白激酶2基因(Cdc2)SNP位点的方法，使用引物对条锈菌DNA在特定的反应体系和条件下进行PCR扩增，然后测序，经过与标准序列比对，从而检测到所测序列的SNP位点，引物对: 正向引物 Cdc28S:5’AAATCATCCACATCTGCTCCAC3’，
反向引物 Cdc352A:5’ TCCTACAAACCCCTCCAA3’。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:PCR反应体系:为30μ1，其中，样品DNA，.20ng/μ I，1.5 μ I ；PrimerCdc28S 和 Cdc352A (10 μ M)各 1.5 μ I ;2 X TaqPCRMasterMix,.15 μ I ；ddH20, 10.5 μ I, 2XTaqPCRMasterMix 成分:0.IUTaqPolymerase / μ I,.500 μ MdNTPeach, 20mMTris-HCl (ΡΗ8.3)，IOOmMKCl，3mMMgCl2，其它稳定剂和增强剂，PCR 反应条件:(96°C,5min) Icycle ； (96°C, 25s,62°C, 25s, 72°C,45s) 34cycles ;72°C延伸 5min。
【文档编号】C12Q1/68GK103882141SQ201410137952
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月8日 优先权日:2014年4月8日
【发明者】李明菊, 陈万权, 刘太国, 段霞瑜, 张庆, 程加省, 毕云青, 徐志 申请人:云南省农业科学院农业环境资源研究所