一种微生物分步固态发酵制备茶多糖的方法
【专利摘要】本发明公开了一种微生物分步固态发酵制备茶多糖的方法，包括以下步骤：茶叶粉或茶粕粉接入菌种分步固态发酵、恒温水浸提、离心；超滤膜分离、浓缩、乙醇沉淀、离心、冷冻干燥得到茶多糖。本发明的方法与现有的水提法区别在于本发明利用微生物生长繁殖中产生的多种酶系（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、植酸酶等）将茶叶细胞中多种大分子物质水解，有利于茶多糖的浸出，制备条件温和、工艺简单、绿色环保，茶多糖的得率大、纯度高、活性强。本发明以低档茶、粗老茶、茶粕为原料，实现了资源的高值化利用。本发明制得的茶多糖具有抗氧化、抗辐射、降血糖的功能活性，适合工业化生产。
【专利说明】一种微生物分步固态发酵制备茶多糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物分步固态发酵制备茶多糖的方法，属于食品营养活性物质加工领域。
【背景技术】
[0002]茶叶为山茶科茶属植物，具有丰富的营养价值和药用价值，其活性物质茶氨酸、多酚类和黄酮类等的提取及保健功能已进行了深入研究，但对于茶多糖的研究却缺乏应有的重视。茶多糖具有降血糖、降血脂、抗凝血、预防心脑血管疾病、增强机体免疫、抗辐射等功能。我国民间一直流传泡饮粗老茶治疗糖尿病的说法。茶多糖存在于茶叶细胞内，由于茶叶细胞的表面被脂质包围，通常使用脱脂溶剂如甲醇、乙醇或乙醇与乙醚混合液等先将茶叶的脂质除去，再用提取溶剂稀酸、稀碱或水提取茶多糖。但是，大量研究表明酸性或碱性条件下提取的茶多糖活性较低，所以提取茶多糖最好的溶剂是水。
[0003]茶多糖是一种白色、略带绿茶香气的粉末状固体。该产品是由单糖和蛋白组成的蛋白复合多糖，不同的提取方法其单糖组成不同，通常由阿拉伯糖、木糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、果糖、鼠李糖和半乳糖醛酸中的几种组成。茶多糖的降血糖效果非常显著，其降血糖机理为调节糖代谢酶的活性和清除自由基作用，对糖代谢的影响与胰岛素类似。高纯度的茶多糖可以制成饮片或胶囊剂直接供糖尿病患者长期服用；也可加到燕麦粥等糖尿病人专用食品中，用于康复治疗产品及日常营养补充品。
[0004]目前，茶多糖的提取工艺多采用水提法，在提取之前要用有机溶剂脱脂，不仅增加了生产成本，还易污染环境。此外，水提法的提取率低，虽然有的工艺增加了超声波或微波辅助浸提，但提取效果还是不理想。因此，需要一种操作简单、成本低、提取率高、环境友好、茶多糖产品活性高，且工业化生产前景和市场前景广阔的提取茶多糖的方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于为解决上述技术中存在的技术难题，提供一种微生物分步固态发酵制备茶多糖的方法。本发明利用微生物生长繁殖中产生的多种酶系(蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、植酸酶等)将茶叶细胞中多种大分子物质水解，有利于茶多糖的浸出，制备条件温和、工艺简单、绿色环保，茶多糖的提取率大、纯度高、活性强。
[0006]为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是:一种微生物分步固态发酵制备茶多糖的方法，其步骤包括:
一、发酵和提取:茶叶粉或茶柏粉加入营养盐溶液，灭菌，接入菌种分步固态发酵，加入水恒温水浸提，离心，保留上清液；
二、分离纯化:上清液经二级超滤膜分离，真空浓缩，乙醇沉淀，离心，沉淀经冷冻干燥得到茶多糖。
[0007]优选地，步骤一所述的茶叶粉或茶柏粉为低档茶、粗老茶、提取茶油后的茶柏粉碎过200目筛下物，营养盐溶液(IL体积)所含的成分包括0.52%的(NH4) 2S04、0.48%的KH2P04、0.8%的尿素、1.2%的葡萄糖，茶叶粉或茶柏粉与营养盐溶液的质量与体积比为1:1.0-2.0 (g/ml)，灭菌的条件为121°C灭菌15min，接入的第一种菌种为菌龄为60_84h的米曲霉或菌龄为30-40h的啤酒酵母，茶叶粉或茶柏粉与菌种的接入体积比为1:0.2-0.4(g/ml，108个菌种/ml)，第一步发酵条件为30°C下静置发酵36h，接入的第二种菌种为菌龄为16-24h的枯草芽孢杆菌或菌龄为9-15h的乳酸菌，茶叶粉或茶柏粉与菌种的接入体积比为1:0.1-0.2(g/ml, 108个菌种/ml)，第二步发酵条件为40°C下静置发酵42h，加入水的质量是茶叶粉或茶柏粉的质量的4.5倍，恒温水浸提条件为45-55°C恒温水浴中浸提3-6h，离心条件为6000r/min转速下离心25min。
[0008]优选地，步骤二所述的微生物分步固态发酵制备茶多糖的方法，其特征在于:步骤(2)所述的一级超滤膜分离条件为截留分子量为IOOkDa的聚砜中空纤维超滤膜，以0.2-0.3MPa压力，25°C下超滤，二级超滤膜分离条件为截留分子量为40kDa的聚砜中空纤维超滤膜，以0.5-0.6MPa压力，25°C下超滤，真空浓缩条件为真空度0.1MPa，60°C恒温水浴中浓缩，加入4倍于浓缩液体积的无水乙醇，离心条件为6500r/min离心25min，冷冻干燥条件为_55°C、真空度0.1MPa，干燥24h。
[0009]本发明的有益效果是:根据本发明，能够提供提取率大，纯度高，具有清除自由基、降血糖功能活性的茶多糖。
【具体实施方式】
[0010]采用蒽酮-硫酸法测定茶多糖中多糖含量；采用微量凯氏定氮法测定茶多糖的蛋白含量。
[0011]实施例1
低档绿茶粉碎过200目筛，取筛下物作为原料，以1:1.25 (g/ml)的比例向低档绿茶粉中加入营养盐溶液(IL体积含有0.52%的(NH4) 2S04、0.48%的KH2P04、0.8%的尿素、1.2%的葡萄糖)，121°C灭菌15min,以低档绿茶粉:米曲霉(108个米曲霉/ml)=l:0.3 (g/ml)的比例接入菌龄为72h的米曲霉，在30°C下进行第一步静置发酵36h，发酵结束后，以低档绿茶粉:乳酸菌(108个乳酸菌/ml)=1:0.2 (g/ml)的比例接入菌龄为12h的乳酸菌，在40°C下进行第二步静置发酵42h，发酵结束后，加入4.5倍于低档绿茶粉的水，在48°C恒温水浴中浸提4.5h,6000r/min转速下离心25min,保留上清液；上清液经截留分子量为IOOkDa的聚砜中空纤维超滤膜，在0.2MPa压力，25°C下进行一级超滤处理，保留透过液，透过液经截留分子量为40kDa的聚砜中空纤维超滤膜，在0.5MPa压力，25°C下进行二级超滤处理，保留浓缩液1，浓缩液I在真空度0.lMPa，60°C恒温水浴中真空旋转蒸发浓缩得到浓缩液2，加入4倍于浓缩液2体积的无水乙醇，冰箱中静置12h，6500r/min离心25min，沉淀在真空度
0.1MPa, -55°C下干燥24h，得到茶多糖。茶多糖的提取率为4.51%，纯度为72.54%，蛋白含量为2.15% ;茶多糖的中性单糖约占87.6%，由阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖组成，己糖醛酸约占4.3%，戊糖约占14.6%，氨基糖约占0.8% ； 10mg/ml的茶多糖对DPPH自由基清除率为35.48%，对羟自由基的清除率为27.92%，对超氧阴离子自由基的清除率为67.88% ；10mg/ml的茶多糖对葡萄糖激酶和己糖激酶的相对活性分别提高了 189.34%和194.23% ;四氧嘧啶高血糖模型小鼠腹腔注射400mg/kg体重茶多糖21d后，血糖下降78%，肝糖原大量增加。
[0012]实施例2粗老绿茶粉碎过200目筛，取筛下物作为原料，以1:1.50 (g/ml)的比例向粗老绿茶粉中加入营养盐溶液(IL体积含有0.52%的(NH4)2S04、0.48%的KH2P04、0.8%的尿素、1.2%的葡萄糖)，121°C灭菌15min，以粗老绿茶粉:啤酒酵母(108个啤酒酵母/ml) =1:0.4 (g/ml)的比例接入菌龄为36h的啤酒酵母，在30°C下进行第一步静置发酵36h，发酵结束后，以粗老绿茶粉:枯草芽孢杆菌(108个枯草芽孢杆菌/ml)=1:0.1 (g/ml)的比例接入菌龄为24h的枯草芽孢杆菌，在40°C下进行第二步静置发酵42h，发酵结束后，加入4.5倍于粗老绿茶粉的水，在55?恒温水浴中浸提6h,6000r/min转速下离心25min,保留上清液；上清液经截留分子量为IOOkDa的聚砜中空纤维超滤膜，在0.3MPa压力，25°C下进行一级超滤处理，保留透过液，透过液经截留分子量为40kDa的聚砜中空纤维超滤膜，在0.6MPa压力，25°C下进行二级超滤处理，保留浓缩液1，浓缩液I在真空度0.lMPa，60°C恒温水浴中真空旋转蒸发浓缩得到浓缩液2，加入4倍于浓缩液2体积的无水乙醇，冰箱中静置12h，6500r/min离心25min，沉淀在真空度0.1MPa，_55°C下干燥24h，得到茶多糖。茶多糖的提取率为5.25%，纯度为78.66%，蛋白含量为2.37% ;茶多糖的中性单糖约占89.3%，由阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、岩藻糖、半乳糖、甘露糖组成，己糖醛酸约占5.2%，戊糖约占12.5%，氨基糖约占0.9% ；10mg/ml的茶多糖对DPPH自由基清除率为37.94%，对羟自由基的清除率为29.26%，对超氧阴离子自由基的清除率为79.01% ；10mg/ml的茶多糖对葡萄糖激酶和己糖激酶的相对活性分别提高了 192.03%和205.64% ;四氧嘧啶高血糖模型小鼠腹腔注射400mg/kg体重茶多糖21d后，血糖下降83%，肝糖原大量增加。
[0013]实施例3
茶柏粉碎过200目筛，取筛下物作为原料，以1:1.80 (g/ml)的比例向茶柏粉中加入营养盐溶液(IL体积含有0.52%的(NH4) 2S04、0.48%的KH2P04、0.8%的尿素、1.2%的葡萄糖)，121°C灭菌15min，以茶柏粉:米曲霉(108个米曲霉/ml) =1:0.2 (g/ml)的比例接入菌龄为84h的米曲霉，在30°C下进行第一步静置发酵36h，发酵结束后，以茶柏粉:乳酸菌(108个乳酸菌/ml) =1:0.1 (g/ml)的比例接入菌龄为15h的乳酸菌，在40°C下进行第二步静置发酵42h，发酵结束后，加入4.5倍于茶柏粉的水，在45°C恒温水浴中浸提3h，6000r/min转速下离心25min，保留上清液；上清液经截留分子量为IOOkDa的聚砜中空纤维超滤膜，在
0.3MPa压力，25°C下进行一级超滤处理，保留透过液，透过液经截留分子量为40kDa的聚砜中空纤维超滤膜，在0.6MPa压力，25 °C下进行二级超滤处理，保留浓缩液1，浓缩液I在真空度0.1MPa, 60°C恒温水浴中真空旋转蒸发浓缩得到浓缩液2，加入4倍于浓缩液2体积的无水乙醇，冰箱中静置12h，6500r/min离心25min，沉淀在真空度0.1MPa, -55°C下干燥24h，得到茶多糖。茶多糖的提取率为5.06%，纯度为71.13%，蛋白含量为2.42% ;茶多糖的中性单糖约占84.5%，由阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、鼠李糖组成，己糖醛酸约占4.6%，戊糖约占13.4%，氨基糖约占0.7% ； 10mg/ml的茶多糖对DPPH自由基清除率为36.03%,对羟自由基的清除率为24.15%，对超氧阴离子自由基的清除率为70.23% ；10mg/ml的茶多糖对葡萄糖激酶和己糖激酶的相对活性分别提高了 190.95%和200.37% ;四氧嘧啶高血糖模型小鼠腹腔注射400mg/kg体重茶多糖21d后，血糖下降80%，肝糖原大量增加。
[0014]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，并不局限于此，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种微生物分步固态发酵制备茶多糖的方法，包括以下步骤: (1)茶叶粉或茶柏粉加入营养盐溶液，灭菌，接入菌种分步固态发酵，加入水恒温水浸提，离心； (2)二级超滤膜分离，真空浓缩，乙醇沉淀，离心，冷冻干燥得到茶多糖。
2.根据权利要求1所述的微生物分步固态发酵制备茶多糖的方法，其特征在于:步骤(I)所述的茶叶粉或茶柏粉为低档茶、粗老茶、提取茶油后的茶柏粉碎过200目筛下物，营养盐溶液(IL体积)所含的成分包括0.52%的(NH4) 2S04、0.48%的KH2P04、0.8%的尿素、1.2%的葡萄糖，茶叶粉或茶柏粉与营养盐溶液的质量与体积比为1:1.0-2.0 (g/ml)，灭菌的条件为121°C灭菌15min，接入的第一种菌种为菌龄为60_84h的米曲霉或菌龄为30_40h的啤酒酵母，茶叶粉或茶柏粉与菌种的接入体积比为1:0.2-0.4(g/ml, 108个菌种/ml)，第一步发酵条件为30°C下静置发酵36h，接入的第二种菌种为菌龄为16-24h的枯草芽孢杆菌或菌龄为9-15h的乳酸菌，茶叶粉或茶柏粉与菌种的接入体积比为1:0.1-0.2 (g/ml, 108个菌种/ml)，第二步发酵条件为40°C下静置发酵42h，加入水的质量是茶叶粉或茶柏粉的质量的4.5倍，恒温水浸提条件为45-55°C恒温水浴中浸提3-6h，离心条件为6000r/min转速下离心25min。
3.根据权利要求1所述的微生物分步固态发酵制备茶多糖的方法，其特征在于:步骤(2)所述的一级超滤膜分离条件为截留分子量为IOOkDa的聚砜中空纤维超滤膜，以.0.2-0.3MPa压力，25°C下超滤，二级超滤膜分离条件为截留分子量为40kDa的聚砜中空纤维超滤膜，以0.5-0.6MPa压力，25°C下超滤，真空浓缩条件为真空度0.1MPa，60°C恒温水浴中浓缩，加入4倍于浓缩液体积的无水乙醇，离心条件为6500r/min离心25min，冷冻干燥条件为_55°C、真空度0.1MPa，干燥24h。
【文档编号】C12R1/69GK103865966SQ201410138882
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】齐宏涛 申请人:青岛博之源生物技术有限公司