普通小麦麦谷蛋白亚基Bx13基因的分子鉴定方法及专用引物的制作方法
【专利摘要】本发明的公开了普通小麦麦谷蛋白亚基Bx13基因的分子鉴定方法及专用引物。本发明提供了鉴定或辅助鉴定麦谷蛋白亚基Bx13基因的引物，由由序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成。所述麦谷蛋白亚基Bx13基因来源于普通小麦Triticum aestivum L.。本发明的实验证明，本发明提供了小麦品质性状分子标记的通量实用检测方法及专用引物，运用该专用引物对中国微核心种质中215份材料进行亚基Bx13基因检测，结果表明该专用引物准确性高，重复性好，特异性强，方法简单，无有毒试剂，分离迅速，分辨率高，检测灵敏度高，可以为小麦品质育种的亲本选择和有利基因的发掘和利用提供可靠信息。
【专利说明】普通小麦麦谷蛋白亚基Bx13基因的分子鉴定方法及专用 引物
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，尤其涉及普通小麦麦谷蛋白亚基BX13基因的分子鉴 定方法及专用引物。
【背景技术】
[0002] 小麦麦谷蛋白的含量决定了小麦的面团强度和面筋弹性，影响着小麦的加工品质 (Figueroa et al. 2009)。研究表明，高分子量麦谷蛋白的含量在面包流变学特性方面的影 响比醇溶蛋白和低分子量麦谷蛋白更为明显。小麦高低分子量麦谷蛋白亚基通过双硫键 形成麦谷蛋白，其含量与小麦品质密切相关，高分子量麦谷蛋白亚基占小麦胚乳蛋白含量 的12%，含有丰富的谷氨酰胺重复序列，大量的氢键对小麦良好的烘焙品质有着决定性影响 (Shewry et al. 1989)，直接决定面包综合品质，其等位变异可以解释欧洲小麦品种在面包 烘倍品质方面变化的 45%_70%(Branlard and Dardevet 1985;Payne et al. 1988)。
[0003] 由于高分子量麦谷蛋白在小麦加工品质方面的卓越贡献，其优质的亚基被广泛 研究应用（Forde et al. 1985; Sugiyama et al. 1985; Thompson et al. 1985; Halford et al.1987;Anderson and Greenel989;Reddy and Appelsl993;De Bustos et al. 2001)〇 研究表明，高分子量麦谷蛋白亚基与小麦烘焙品质关系密切（Payne et al.l979Mengand Cai2008;Pang et al. 2009)。在Glu-1位点上，亚基对小麦加工品质具有上位效应（Rousset et al. 1992;Luo et al. 2001;Zhang et al. 2009)〇
[0004] 在位点内部，Bxl3亚基在Zeleny沉降值、面筋强度（Branlard等，2001)和面包综 合品质（Bronnke等，2000)中表现优异。特别是延展性方面，Bxl3亚基是Glu-Bl位点上贡 献最高的一个亚基，与小麦烘烤品质密切相关。因此，研究普通小麦高分子量麦谷蛋白亚 基的组成和分布，特别是Glu-Bl位点上Bxl3亚基，对小麦品质育种有重要意义。
[0005] 在亚基鉴定检测方面，SDS-PAGE鉴定法局限性大，如亚基迁移率不规则，产品多样 性差等，因此PCR技术被广泛应用到生命科学的各个领域。专用引物的设计是PCR技术的 关键环节，但是到目前为止，可用于检测HMW-GS的专用引物有N、Bxl7+Byl8、Bxl4+Byl5等， 有些麦谷蛋白的专用引物由于特异性弱、灵敏性低、重复性差、缺乏可靠的核苷酸序列等原 因，尚不具备或仍需改善。学者对Bxl3亚基的研究和统计基本是通过Bxl3+By 16亚基组合 开展，对Bxl3亚基进行单独的专用引物设计和研究较少，因此进一步发掘并验证Bxl3亚基 专用引物，尤其是更方便、灵敏、准确的Bxl3亚基专用引物意义重大。通过分析研究小麦优 质亚基的变异和亚基分布情况，有利于了解普通小麦种质资源的性状，为小麦品质育种的 亲本选择和有利基因的发掘和利用提供相关信息。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供鉴定或辅助鉴定麦谷蛋白亚基Bxl3基因的引物。
[0007] 本发明提供的引物，由序列表序列1所不的单链DNA和序列表序列2所不的单链 DNA组成。
[0008] 上述引物中，所述麦谷蛋白亚基Bxl3基因来源于普通小麦Triticum aestivum
[0009] 本发明的第二个目的是提供鉴定或辅助鉴定麦谷蛋白亚基Bxl3基因的PCR试剂。
[0010] 本发明提供的PCR试剂，包括上述的引物。
[0011] 上述PCR试剂由PCR扩增缓冲液、权利要求1或2所述的引物、dNTP、DNA聚合酶 和水组成；
[0012] 所述引物中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度为0. 2uM。
[0013] 上述PCR试剂中，所述麦谷蛋白亚基Bxl3基因来源于普通小麦Triticum aestivum L 〇
[0014] 本发明的第三个目的是提供鉴定或辅助鉴定麦谷蛋白亚基Bxl3基因的试剂盒。
[0015] 本发明提供的试剂盒，包括上述的引物或上述的PCR试剂。
[0016] 上述试剂盒中，所述麦谷蛋白亚基Bxl3基因来源于普通小麦Triticum aestivum
[0017] 上述的引物或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在测鉴定或辅助鉴定麦谷蛋白亚 基Bxl3基因中的应用也是本发明保护的范围。
[0018] 上述应用中，所述麦谷蛋白亚基Bxl3基因来源于普通小麦Triticum aestivum
[0019] 本发明的实验证明，本发明提供了小麦品质性状分子标记的通量实用检测方法及 专用引物，运用该专用引物对中国微核心种质的材料进行亚基Bxl3基因检测，结果表明该 专用引物准确性高，重复性好，特异性强，方法简单，无有毒试剂，分离迅速，分辨率高，检测 灵敏度商，可以为鉴定小麦是否含有Bxl3基因、小麦品质育种的未本选择和有利基因的发 掘和利用提供可靠信息。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为部分小麦品种(系）Bxl3的检测结果
[0021] 1是中优9507, 2是丰抗2号，3是长治6406,4是北京8号，M是分子Marker
[0022] 图2为灵敏度检测
[0023] 图3为常规方法的灵敏度检测
【具体实施方式】
[0024] 中优 9507 记载在如下文献中：Molecular characterization and comparative transcriptional analysis of LMW-m-type genes from wheat(Triticum aestivum L. )and Aegilops species, Theoretical and Applied Genetics (2010), Volumel21, Issue5,pp845_856 ;公众可从安徽农业大学获得。
[0025] 丰抗 2 号记载在如下文献中：Allelopathic Potential of Acacia confusa and Related Species in Taiwan, Journal of Chemical Ecology, Volume24, Issuel2，pp2131-2150 ;公众可从安徽农业大学获得。
[0026] 长治6406记载在如下文献中：山西省农科院谷子研究所小麦品种改良及系谱分 析，山西农业科学（2011)，39 (3) :217-220 ;公众可从安徽农业大学获得。
[0027] 北京8号记载在如下文献中：小麦骨干亲本碧蚂4号的基因组特异位点及其在衍 生后代中的传递，作物学报（2010)，36 (1) :9_16 ;公众可从安徽农业大学获得。
[0028] 乌江卓记载在如下文献中：95个小麦农家品种的抗条锈性鉴定和SSR遗传多样性 分析，河北农业大学，2008,硕士论文；公众可从安徽农业大学获得。
[0029] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0030] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031]实施例1、引物的设计和合成
[0032] 根据小麦高分子量麦谷蛋白亚基Bxl3基因设计并合成专用引物：
[0033]F: CGGGCACGAGACAATACG (序列 1)，
[0034] R:GCCGAGAAGTTGGGAAGTA (序列 2)。
[0035] 实施例2、引物在鉴定小麦高分子量麦谷蛋白亚基Bxl3基因中的应用
[0036] 一、引物鉴定小麦高分子量麦谷蛋白亚基Bxl3基因
[0037] 1、基因组DNA提取
[0038] 小麦品种乌江卓材料取3粒干种子，用单籽粒粉碎机磨碎1-3粒小麦干种子，放入 2ml离心管中，加900 iilSDS提取液，50-60°C水浴45-60min，期间间歇震荡。在12000r/min 转速下离心l〇min，吸取700 ii 1上清液，加入等体积（700 ii 1)酚-氯仿-异戊醇（25:24:1)， 于冰上颠倒混勻15min。在12000r/min转速下离心lOmin，吸取500 y 1上清液，加入0. 6 倍异丙醇（300iil)和1/10倍体积（50iil)NaAc (pH5. 2)，混匀后冰上静置15min，期间间 歇震荡。管内出现絮状DNA沉淀，在10000r/min转速下离心lOmin，弃上清液，沉淀用70% 乙醇漂洗2遍，然后用无水乙醇漂洗1遍，室温晾干，加100 ill的1XTE (或双蒸水）溶解， 过夜，10倍稀释，得到基因组DNA。
[0039] 2、PCR 扩增
[0040] 以上述1获得的基因组DNA为模板，用实施例1合成的特异分子标记Bxl3的上游 引物和下游引物进行PCR扩增，反应体系和反应程序如下所示。
[0041] 10ul的PCR反应体系按照如下方法制备：2ul的基因组DNA(在反应体系中的终浓 度为20ng/ul)、特异分子标记Bxl3的上游引物和下游引物各0. 2ul (每条引物在反应体系 中的终浓度为〇. 2uM)、lul dNTP (在反应体系中的终浓度为0. 25mM)、taq酶(在反应体系中 的终浓度为 〇.〇65U/ul)、luLlx PCR butter，补加 ddH20 到 10uL。
[0042] PCR程序设定：循环前94°C预变性5min，94°C变性35S，62°C退火45S，72°C延伸 905,38个循环，最后721：延伸8111111。
[0043] 得到 1167bp 的 PCR 产物。
[0044] 将上述PCR产物与pUC-T simple载体连接、转化，得到转化子，提取转化子的质 粒，送去测序，结果，该PCR产物具有序列表中序列3所示的核苷酸，与NCBI系统亚基Bxl3 基因序列（FM955452) BLAST比对得分最高(一致性达97%);说明本引物和方法正确，可以用 来鉴定Bxl3基因；且引物扩增条带专一，无杂带，比其它引物效果好。
[0045] 二、灵敏度检测
[0046] 将20ng/ul小麦品种乌江卓的基因组DNA进行倍比稀释作为模板：20ng/ul、2ng/ ul、0. 2ngAil、〇. 〇2ngAil、〇ngAil，按照上述一的方法用实施例1合成的特异分子标记Bxl3 的上游引物和下游引物进行PCR扩增，反应体系和反应程序按照上述一所示。
[0047] 结果如图2所示，1为DNA模板在反应体系中的终浓度为20ng/ul、2为DNA模板在 反应体系中的终浓度为2ng/ul、3为DNA模板在反应体系中的终浓度为0. 2ng/ul、4为DNA 模板在反应体系中的终浓度为0. 02ng/ul、5为DNA模板在反应体系中的终浓度为Ong/ul， 从图中可以看出，DNA模板稀释1000倍则仍可以扩增出目的片段。
[0048] 按照文献：Pang B, and Zhang X. Isolation and molecular characterization of high molecular weight glutenin subunit geneslBxl3andlByl6from hexaploid wheat. Journal of Integrative Plant Biology2008, 50 (3) ,329-337 中常规 Bxl3 基因引 物：F :ATGAGCTAAGCGCGCTGGTCCTCTTTG, R :CTATCACTGCCTGGTCCGACAATGCG，对 20ng/ul、2ng/ ul、0. 2ng/ul、0. 02ng/ul、0ng/ul的小麦品种乌江卓的基因组DNA进行扩增。
[0049] 结果如图3所示，目标片段大小900bp，从图中可以看出，DNA模板稀释100倍则可 以扩增出目的片段，而稀释1000倍则不能扩增出目的片段。
[0050] 因此说明，本发明引物的灵敏度高。
[0051] 因此，采用Bxl3的上游引物和下游引物可以用来检测待测样本是否含有Bxl3基 因，电泳检测PCR扩增产物，若得到1160-1170bp的PCR产物，则待测样本含有或候选含有 小麦高分子量麦谷蛋白亚基Bxl3基因；
[0052] 若未得到1160-1170bp的PCR产物，则待测样本不含有或候选不含有小麦高分子 量麦谷蛋白亚基Bxl3基因。
[0053] 上述检测Bxl3基因的PCR试剂由基因组DNA、终浓度均为0. 2uM的Bxl3的上游引 物和下游引物、终浓度为〇. 25mM的dNTP、终浓度为0. 065U/ul的taq酶、PCR缓冲溶液和水 组成。
[0054] 上述检测Bxl3基因的试剂盒包括上述Bxl3的上游引物和下游引物或者包括检测 Bxl3基因的PCR试剂。
[0055] 实施例3、检测待测样本
[0056] 按照实施例2的一的方法分别提取小麦中优9507、丰抗2号、长治6406、北京8号 基因组DNA，用实施例1合成的特异分子标记Bxl3的上游引物和下游引物进行PCR扩增，反 应体系和反应程序按照实施例2的一的所示。
[0057] 结果如图1所示，小麦中优9507中得到1167bp的PCR产物，证明含有Bxl3基因， 将PCR产物送去测序，得确与NCBI系统亚基Bxl3基因序列（FM955452)同源性达到97%，说 明PCR产物为Bxl3基因，本发明的方法正确；
[0058] 丰抗2号中得到1161bp的PCR产物，证明含有Bxl3基因，将PCR产物送去测序， 得确与NCBI系统亚基Bxl3基因序列（FM955452)同源性达到97%，说明PCR产物为Bxl3基 因，本发明的方法正确；
[0059] 长治6406中得到1169bp的PCR产物，证明含有Bxl3基因，将PCR产物送去测序， 得确与NCBI系统亚基Bxl3基因序列（FM955452)同源性达到97%，说明PCR产物为Bxl3基 因，本发明的方法正确；
[0060] 北京8号中得到1165bp的PCR产物，证明含有Bxl3基因，将PCR产物送去测序， 得确与NCBI系统亚基Bxl3基因序列（FM955452)同源性达到97%，说明PCR产物为Bxl3基 因，本发明的方法正确。
【权利要求】
1. 鉴定或辅助鉴定麦谷蛋白亚基Bxl3基因的引物，由序列表序列1所不的单链DNA和 序列表序列2所示的单链DNA组成。
2. 根据权利要求1所述的引物，其特征在于：所述麦谷蛋白亚基Bxl3基因来源于普通 小麦 Triticum aestivum L. 〇
3. 鉴定或辅助鉴定麦谷蛋白亚基Bxl3基因的PCR试剂，包括权利要求1或2所述的引 物。
4. 根据权利要求3所述的PCR试剂，其特征在于： 所述PCR试剂由PCR扩增缓冲液、权利要求1或2所述的引物、dNTP、DNA聚合酶和水 组成； 所述引物中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度为0. 2uM。
5. 根据权利要求3或4所述的PCR试剂，其特征在于： 所述麦谷蛋白亚基Bxl3基因来源于普通小麦Triticum aestivum L.。
6. 鉴定或辅助鉴定麦谷蛋白亚基Bxl3基因的试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物 或权利要求3-5中任一所述的PCR试剂。
7. 根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述麦谷蛋白亚基Bxl3基因来源 于普通小麦 Triticum aestivum L. 〇
8. 权利要求1或2所述的引物或权利要求3-5中任一所述的PCR试剂或权利要求6或 7所述的试剂盒在测鉴定或辅助鉴定麦谷蛋白亚基Bxl3基因中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述麦谷蛋白亚基Bxl3基因来源于普通 小麦 Triticum aestivum L. 〇
【文档编号】C12Q1/68GK104450875SQ201410149006
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】刘莉, 马传喜, 司红起 申请人:安徽农业大学