使ACC-α基因启动子PⅢ失活的物质及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了使ACC-α基因启动子PⅢ失活的物质在生产产低脂奶的奶牛中的应用。本发明首先保护一种蛋白组，由TALE蛋白甲-Ⅰ和TALE蛋白甲-Ⅱ组成；所述TALE蛋白甲-Ⅰ包括序列表的序列14自N末端第180-791位氨基酸残基组成的结合域和序列表的序列14第867-1062位氨基酸残基组成的功能域；所述TALE蛋白甲-Ⅱ包括序列表的序列15自N末端第190-733位氨基酸残基组成的结合域和序列表的序列15自N末端第809-1004位氨基酸残基组成的功能域。本发明发现了可以高效沉默ACC-α基因启动子的靶点，并基于该靶点设计了蛋白组、基因组、质粒组和RNA组，可以成功沉默了ACC-α基因启动子，且敲除效率非常高。
【专利说明】使ACC-α基因启动子P III失活的物质及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及使ACC-α基因启动子P III失活的物质及其应用。
【背景技术】
[0002]基因打靶技术是一种定向改变生物体遗传信息的技术，但对于动物体细胞的打靶效率很低(仅为10_6-10_7)。伴随着分子生物学的不断发展，涌现出很多新的技术和方法来提高基因打靶效率，如采用无启动子筛选的基因打靶策略，动物中干细胞的分离及诱导等，但是这些改进对于生产基因打靶动物并没有显著的推动作用，基因打靶动物的生产一直处于缓慢发展阶段。最近几年，类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)的出现极大地提高了基因打靶的效率，其将成为生产基因敲除动物的一个重要突破口。
[0003]类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)融合了 DNA调控元件特异性结合DNA的特性以及内切核酸酶的催化活性，N末端的TALE蛋白结合域能够特异结合DNA序列，通过C末端内切核酸酶FokI的催化作用，使得DNA双链分子产生断裂(DSB)，紧接着DSB就会启动细胞内自身修复机制。目前主要的修复机制有两种:一种是非同源重组的末端连接修复机制，另一种是同源重组 修复机制。前一种修复机制是一种易错修复常常会产生遗传信息的改变，而利用同源重组修复机制来修复DSB是一种高保真的修复方式，一般以另一条姐妹染色体为模板进行精确修复。在哺乳动物细胞内，前一种修复机制占主导作用，借助TALENs特异性产生DSB，引发细胞非同源重组的末端连接修复，在DSB位点引入小片段删除或插入，造成移码突变，或者引发失活突变等，达到使目的基因失活的目的。该技术的关键在于靶点区域的选择。
[0004]随着人们生活水平的提高，对健康优质奶品的要求也越来越高，人们更加关注牛奶中的优质蛋白质，同时希望牛奶中所含的脂肪更少。对于目前市场上的脱脂牛奶来说，在脱脂的过程中脂溶性的维生素也会被除去，主要是维生素A和维生素D，影响了人体对钙质的吸收，而且如果完全脱掉牛奶中的脂肪，会破坏其营养价值，影响牛奶的口感和风味。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供使ACC- α基因启动子P III失活的物质在生产产低脂奶的奶牛中的应用。
[0006]本发明首先保护一种蛋白组，由TALE蛋白甲-1和TALE蛋白甲_ II组成；所述TALE蛋白甲-1包括序列表的序列14自N末端第180-791位氨基酸残基组成的结合域和序列表的序列14第867-1062位氨基酸残基组成的功能域；所述TALE蛋白甲-1I包括序列表的序列15自N末端第190-733位氨基酸残基组成的结合域和序列表的序列15自N末端第809-1004位氨基酸残基组成的功能域。所述TALE蛋白甲-1具体可如序列表的序列14所示。所述TALE蛋白甲-1I具体可如序列表的序列15所示。所述TALE蛋白甲-1和所述TALE蛋白甲-1I具体可等质量配比。
[0007]本发明还保护一种DNA组，由TALE基因甲-1和TALE基因甲-1I组成；所述TALE基因甲-1编码所述TALE蛋白甲-1 ;所述TALE基因甲-1I编码所述TALE蛋白甲-1I。所述TALE基因甲-1包括序列表的序列10自5’末端第548-2383位核苷酸所示的结合域编码区和序列表的序列10自5’末端第2609-3199位核苷酸所示的功能域编码区。所述TALE基因甲-1I包括序列表的序列11自5’末端第578-2209位核苷酸所示的结合域编码区和序列表的序列11自5’末端，第2435-3025位核苷酸所示的功能域编码区。所述TALE基因甲-1具体可如序列表的序列10所示。所述TALE基因甲-1I具体可如序列表的序列
11所示。所述TALE基因甲-1和所述TALE基因甲-1I具体可等质量配比。
[0008]本发明还保护一种RNA组，由TALE-RNA甲-1和TALE-RNA甲-1I组成；所述TALE-RNA甲-1为所述TALE基因甲-1编码的RNA ;所述TALE-RNA甲-1I为所述TALE基因甲-1I编码的RNA。所述TALE-RNA甲-1和所述TALE-RNA甲-1I具体可等质量配比。
[0009]本发明还保护一种质粒组，由质粒甲和质粒乙组成；所述质粒甲为含有所述TALE基因甲-1的质粒；所述质粒乙为含有所述TALE基因甲-1I的质粒。所述质粒甲和所述质粒乙具体可等质量配比。所述质粒甲具体可为将序列表的序列6所示的TALE基因片段甲-1插入pCS2-Fok I载体(PEAS型)的Nhe I酶切位点得到的重组质粒TALENs_2201L。所述质粒乙具体可为将序列表的序列7所示的TALE基因片段甲-1I插入pCS2-Fok I载体(PERR型)的Nhe I酶切位点得到的重组质粒TALENs_2201R。
[0010]本发明还保护以上任一所述蛋白组、以上任一所述所述DNA组、以上任一所述所述RNA组或以上任一所述所述质粒组的应用，为如下(a)、(b)或(c): Ca)使ACC- α基因启动子P III失活；(b)制备使ACC- α基因启动子P III失活的试剂盒；(C)沉默离体的牛胎儿成纤维细胞中的ACC-α基 因启动子PIII。所述ACC-a基因启动子P III具体可如序列表的序列I所示。
[0011]本发明还保护将所述TALE-RNA甲-1和所述TALE-RNA甲-1I导入离体的牛胎儿成纤维细胞得到的ACC-α基因启动子P III失活的重组细胞。所述ACC-α基因启动子P III具体可如序列表的序列I所示。
[0012]本发明还保护以上任一所述蛋白组、以上任一所述所述DNA组、以上任一所述所述RNA组、以上任一所述所述质粒组或以上任一所述重组细胞在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为生产产低脂奶的奶牛。
[0013]乙酰辅酶A羧化酶a (ACC-a )是脂肪酸从头合成的限速酶。ACC-α基因由三个不同启动子驱动。在乳腺中，由启动子PI驱动的ACC- α表达量始终保持总量的约33%,启动子PII驱动的ACC-a表达量在牛的乳腺中也不受泌乳期的影响，PIII是ACC-α的三个启动子中唯一在泌乳期于乳腺上皮细胞中被强烈诱导的启动子(约28倍)。
[0014]在类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)技术的基础上，本发明中发现了可以高效沉默ACC-α基因启动子的靶点，并基于该靶点设计了蛋白组、基因组、质粒组和RNA组。本发明中将RNA组导入牛成纤维细胞，成功沉默了 ACC-a基因启动子，且敲除效率非常高，为生产基因敲除动物提供了极大的便利。
[0015]常规基因打靶克隆牛的生产流程，包括构建基因打靶载体、载体转染、细胞药物筛选、细胞单克隆的鉴定、体细胞核移植、克隆牛的鉴定。完成上述过程需要的时间为:载体构建3个月，细胞筛选I个月，体细胞核移植、胚胎发育I个月，胚胎移植妊娠到小牛出生10个月。这样，一次克隆至少需要14个月的时间。最后得到的克隆牛含有药物筛选所必须的抗性基因，要得到不含抗性基因的动物个体还要经历一次体细胞克隆。本发明中将RNA组导入牛成纤维细胞，再将重组细胞与吸弃染色体的牛卵母细胞融合，然后将重构胚移入受体母牛的子宫，12个月即可得到基因敲除且不含抗性基因的克隆牛。本发明中通过一次转染即可得到基因敲除的细胞克隆，这在常规基因打靶过程中是难以实现的，省去了药物筛选过程，有利于细胞单克隆的形成，避免了细胞需要对抗药物毒害的过程，对于后续的体细胞核移植和胚胎发育质量起到了关键作用，同时不含有抗性基因，大大简化了生物安全评价过程。本发明中用于转染的遗传物质为mRNA，在细胞内的半衰期约为8小时，不会存在转DNA时随机插入细胞基因组的情况，对于动物遗传稳定性有良好的保证。同时不会有抗性基因的随机整合，符合生物安全方面的要求。
[0016]本发明中得到的克隆牛，由于ACC-α基因启动子失活，理论上能特异性减弱泌乳期ACC-α基因在乳腺上皮细胞中的表达量，使长链脂肪酸的合成量减少，从而降低牛奶中的脂肪含量，无需再进行脱脂(避免损失维生素)，可以大大满足人们日益增长的对健康优质奶品需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为pCS2_Fok I载体的结构示意图。
[0018]图2为实施例2中的部分测序结果。
[0019]图3为实施例3中的部分测序结果。
【具体实施方式】 [0020]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0021]取40日龄荷斯坦奶牛胎儿耳组织，按照常规方法[《细胞实验指南》(上册)，【美】D.L.斯佩克特等著；黄培堂等译。北京:科学出版社，2001.2 ;第一章，第4节，27-32页.]制备得到牛胎儿成纤维细胞系。
[0022]pCS2-Fok I载体(TALENs骨架载体)的结构示意图见图1。pCS2_Fok I载体:CffBIO ;包括一对结构基本相同的质粒，pCS2-Fok I载体(PEAS型)和pCS2_Fok I载体(PERR 型)。pCS2-Fok I 载体(PEAS 型)又称 PEAS 型 pCS2_Fok I 载体，pCS2_Fok I 载体(PERR 型)又称 PERR 型 pCS2-Fok I 载体。pCS2_Fok I 载体(PEAS 型)和 pCS2_Fok I 载体(PERR型)的差异仅在于:pCS2-Fok I载体(PEAS型)具有编码Fok I核酸内切酶(PEAS型)的DNA序列，pCS2-Fok I载体(PERR型)具有编码Fok I核酸内切酶(PERR型)的DNA序列。Fok I核酸内切酶(PEAS型)和Fok I核酸内切酶(PERR型)形成2聚体后发挥内切酶的功倉泛。
[0023]实施例1、TALENs表达载体的构建
[0024]一、筛选靶点区域
[0025]基于大量分析筛选与验证，确认将ACC- α基因的启动子P III (ACC- α基因的启动子P III如序列表的序列I所示)中的两个区域作为靶点:[0026]靶点区域甲如下:
[0027]5’ -tGTGTACTTCTGTTTTGAAGggttttcgtggaatgtTAATAGATTCGCGGCATa-3’ ；
[0028]靶点区域甲中，左侧的下划线为TALE蛋白甲-1的识别域，右侧的下划线为TALE蛋白甲-1I的识别域的反向互补序列，中间为Fok I内切核酸酶切割位点。
[0029]靶点区域乙如下:
[0030]5， -tTTGTGTACTTCTGTTTTGAagggttttcgtggaaTGTTAATAGATTCGCGGCa-3’。
[0031]靶点区域乙中，左侧的下划线为TALE蛋白乙-1的识别域，右侧的下划线为TALE蛋白乙-1I的识别域的反向互补序列，中间为Fok I内切核酸酶切割位点。
[0032]二、设计TALE蛋白
[0033]基于靶点区域甲，设计一对TALE蛋白(由TALE蛋白甲-1和TALE蛋白甲-1I组成XTALE蛋白甲-1的结合域如序列表的序列2所示(识别18个核苷酸)，TALE蛋白甲-1I的结合域如序列表的序列3所示(识别16个核苷酸)。
[0034]基于靶点区域乙，设计一对TALE蛋白(由TALE蛋白乙-1和TALE蛋白乙-1I组成)。TALE蛋白乙-1的结合域如序列表的序列4所示(识别18个核苷酸)，TALE蛋白乙-1I的结合域如序列表的序列5所示(识别17个核苷酸)。
[0035]三、制备DNA分子
[0036]制备用于编码TALE蛋白甲-1的结合域的DNA分子和用于编码TALE蛋白甲-1I的结合域的DNA分子。用于编码TALE蛋白甲-1的结合域的DNA分子为TALE基因片段甲-1 (如序列表的序列6所示)，用于编码TALE蛋白甲-1I的结合域的DNA分子为TALE基因片段甲-1I (如序列表的序列7所示)。
[0037]制备用于编码TALE蛋白乙-1的结合域的DNA分子和用于编码TALE蛋白乙-1I的结合域的DNA分子。用于编码TALE蛋白乙-1的结合域的DNA分子为TALE基因片段乙-1 (如序列表的序列8所示)，用于编码TALE蛋白乙-1I的结合域的DNA分子为TALE基因片段乙-1I (如序列表的序列9所示)。
[0038]四、制备重组质粒
[0039]将TALE基因片段甲-1插入pCS2_Fok I载体(PEAS型)的Nhe I酶切位点，得到重组质粒 TALENs-2201L。
[0040]将TALE基因片段甲-1I插入pCS2_Fok I载体(PERR型)的Nhe I酶切位点，得到重组质粒 TALENs-2201R。
[0041]将TALE基因片段乙-1插入pCS2_Fok I载体(PEAS型)的Nhe I酶切位点，得到重组质粒 TALENs-2199L。
[0042]将TALE基因片段乙-1I插入pCS2_Fok I载体(PERR型)的Nhe I酶切位点，得到重组质粒 TALENs-2199R。
[0043]五、制备mRNA
[0044]取重组质粒TALENs-2201L，采用试剂盒(QiagenRNeasyMini Kit,Cot.N0.74104)进行体外转录，得到TALE-RNA甲-1 (将TALE-RNA甲-1反转录并测序，如序列表的序列10所示；序列表的序列10所示的DNA分子即为TALE基因甲-1，编码序列表的序列14所示的TALE蛋白甲-1 )。
[0045]取重组质粒TALENs-220IR，采用试剂盒(QiagenRNeasyMini Kit, Cot.N0.74104)进行体外转录，得到TALE-RNA甲-1I (将TALE-RNA甲-1I反转录并测序，如序列表的序列11所示；序列表的序列11所示的DNA分子即为TALE基因甲-1I，编码序列表的序列15所示的TALE蛋白甲-1I)。
[0046]取重组质粒TALENs-2199L，采用试剂盒(QiagenRNeasyMini Kit, Cot.N0.74104)进行体外转录，得到TALE-RNA乙-1 (将TALE-RNA乙-1反转录并测序，如序列表的序列12所示；序列表的序列12所示的DNA分子即为TALE基因乙-1，编码序列表的序列16所示的TALE蛋白乙-1 )。
[0047]取重组质粒TALENs-2199R，采用试剂盒(QiagenRNeasyMini Kit, Cot.N0.74104)进行体外转录，得到TALE-RNA乙-1I (将TALE-RNA乙-1I反转录并测序，如序列表的序列13所示；序列表的序列13所示的DNA分子即为TALE基因乙-1I，编码序列表的序列17所示的TALE蛋白乙-1I)。
[0048]序列表的序列10中，自5’末端第548-2383位核苷酸编码结合域，第2609-3199位核苷酸编码Fok I核酸内切酶(PEAS型)。序列表的序列14中，自N末端第180-791位氨基酸残基组成结合域，第867-1062位氨基酸残基组成Fok I核酸内切酶(PEAS型)。[0049]序列表的序列11中，自5’末端第578-2209位核苷酸编码结合域，第2435-3025位核苷酸编码Fok I核酸内切酶(PERR型)。序列表的序列15中，自N末端第190-733位氨基酸残基组成结合域，第809-1004位氨基酸残基组成Fok I核酸内切酶(PERR型)。
[0050]序列表的序列12中，自5’末端第548-2383位核苷酸编码结合域，第2609-3199位核苷酸编码Fok I核酸内切酶(PEAS型)。序列表的序列16中，自N末端第180-791位氨基酸残基组成结合域，第867-1062位氨基酸残基组成Fok I核酸内切酶(PEAS型)。
[0051]序列表的序列13中，自5’末端第578-2311位核苷酸编码结合域，第2537-3127位核苷酸编码Fok I核酸内切酶(PERR型)。序列表的序列17中，自N末端第190-767位氨基酸残基组成结合域，第843-1038位氨基酸残基组成Fok I核酸内切酶(PERR型)。
[0052]实施例2、TALENs敲除效率
[0053]如果TALENs发挥切割作用，细胞会启动自身修复机制，在切割位点会出现小片段的删除或者插入，测序结果峰图为杂合峰图。
[0054]talenjd2f:5，-AGAGATCAAGATAGGAGGATTC-3，；
[0055]talenjd2r:5’ -TTGCCACAGAGCGATAAG-3，。
[0056]一、第一对TALENs (TALE蛋白甲-1和TALE蛋白甲-1I )的敲除效率
[0057]1、将TALE-RNA甲-1和TALE-RNA甲-1I电击转化牛胎儿成纤维细胞系，每IO6个细胞转染 2 μ g TALE-RNA 甲-1 和 2 μ g TALE-RNA 甲-1I。
[0058]2、步骤I中电击72小时后，提取细胞的基因组DNA，采用talenjd2f和talenjd2r组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序，测序结果峰图为杂合峰图。
[0059]3、步骤2中电击72小时后，采用TA克隆测序的方式计算敲除效率(突变类型与有效测序总数的比值即为敲除效率；有效测序总数为野生型克隆与突变型克隆的总和)。第一对TALENs (TALE蛋白甲-1和TALE蛋白甲-1I)的敲除效率为17%。部分测序结果见图2。
[0060]二、第二对TALENs (TALE蛋白乙-1和TALE蛋白乙-1I )的敲除效率
[0061]1、将TALE-RNA乙-1和TALE-RNA乙-1I电击转化牛胎儿成纤维细胞系，每IO6个细胞转染 2 μ g TALE-RNA 乙-1 和 2 μ g TALE-RNA 乙-1I。
[0062]2、步骤I中电击72小时后，提取细胞的基因组DNA，采用talenjd2f和talenjd2r组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序，测序结果峰图为杂合峰图。
[0063]3、步骤2中电击72小时后，采用TA克隆测序的方式计算敲除效率。第二对TALENs(TALE蛋白乙-1和TALE蛋白乙-1I)的敲除效率为4%。
[0064]实施例3、单细胞克隆的获得以及基因敲除克隆的鉴定
[0065]一、制备供体细胞
[0066]1、将TALE-RNA甲-1和TALE-RNA甲-1I电击转染(采用AMAXA电转染仪，参数设置为T-016)牛胎儿成纤维细胞系，每IO6个细胞转染2μ g TALE-RNA甲-1和2 μ gTALE-RNA甲-1I。
[0067]2、将完成步骤I的细胞接种于T25细胞培养瓶中，补加含15%FBS的DMEM培养液，在含5%C02的细胞培养箱中37°C培养6-7天(表面形成分散的单细胞克隆)。
[0068]3、取步骤2得到的各个单细胞克隆，分别转接至48孔细胞培养板的不同培养孔并采用步骤2相同的培养条件培养3-4天(细胞铺满整个孔)，消化细胞，取1/10细胞进行步骤4，剩余细胞接种于6孔板(用于后续阳性克隆的细胞冻存)。
[0069]4、提取细胞的基因组DNA，采用talenjd2f和talenjd2r组成的引物对进行PCR扩
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[0070]5、将步骤4得到的PCR扩增产物进行测序，在靶点区域甲发生了删除\插入\失活性突变的单克隆细胞即为供体细胞。
[0071]随机取如下两个供体细胞进行步骤三:
[0072]第一个供体细胞为Ilbp删除的单克隆细胞(单等位基因敲除的杂合体，即仅一条染色体上发生了 Ilbp删除)，删除区域为如下靶序列中方框标注的区域:
[0073]5，-tGTGTACTTCTGTTTTGAAGggtt [t Icgtggaat^ tTAATAGATTCGCGGCATa-3，；
[0074]第二个供体细胞为13bp删除的单克隆细胞(单等位基因敲除的杂合体，即仅一条染色体上发生了 13bp删除)，删除区域为如下靶序列中方框标注的区域:
[0075]5，-tGTGTACTTCTGTTTTGAAGg ；|gtt^gtTAATAGATTCGCGGCATa-3，。
[0076]二、制备受体细胞
[0077]从屠宰场收集成年荷斯坦奶牛的卵巢，取直径2-8毫米的卵泡，回收形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞复合体，将卵丘-卵母细胞复合体放入含成熟液(液体M199培养基+10%胎牛血清+0.01U/ml牛促卵泡激素+0.0I/ml牛促黄体生成激素+1 μ g/ml雌二醇)的四孔细胞培养板(50-60个/孔)，在含5%0)2培养箱中38.5°C培养18_20h，然后将成熟的卵母细胞放入装有0.1%透明质酸酶的离心管中震荡2-3min，用玻璃管轻轻吹打以使卵丘细胞与卵母细胞完全脱离，选择形态完整、细胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞作为受体细胞。
[0078]三、转基因克隆胚胎制备及胚胎移植
[0079]1、将步骤二得到的带有第一极体的卵母细胞移入操作液(液体M199培养基+10%FBS+7.5 μ g/ml细胞松弛素B)，在200倍显微镜下用一玻璃针于极体上方将透明带切一小口，然后用内径为20 μ m的玻璃管将第一极体以及其下方的卵母细胞内的染色体一并吸出，然后将去除第一极体和染色体的卵母细胞放入含20%FBS的液体M199培养基中洗涤二遍。
[0080]2、取步骤一得到的供体细胞，血清饥饿2-4天后用0.25%胰蛋白酶消化2_4min。
[0081]3、从步骤2中选取直径10-12 μ m的细胞，移入步骤I得到的卵母细胞的透明带内，然后将其放入 Zimmerman 液(含 0.3M 甘露醇、0.1M MgSO4、0.05M CaCl2、0.5mM HEPES,0.05g/100mL BSA的水溶液，ρΗ7.2，用0.22 μ m滤膜过滤)中平衡3_5min，然后放入融合槽内，转动卵母细胞使供体细胞与卵母细胞接触面与电场垂直，同时在直流脉冲的场强为2.5kv/cm、脉冲时间为10 μ S、脉冲次数为2次、脉冲间隔为Is的条件下融合(融合仪为BTX公司的ECM-2001)，然后迅速将重构胚移入含10%FBS的液体M199培养基中30min，然后将重构胚放入5 μ mo I/L离子霉素水溶液中4min，然后移至1.9mmol/L6-DMAP水溶液中4h，然后移入含5%FBS的CRlaa培养液中并置于含5%C02的培养箱在38.5°C培养2天，然后将形态优良的第7天的克隆囊胚移入同期受体母牛的子宫角内，在移植后第60天进行直肠检测，以确定妊娠率。
[0082]3、受体母牛自然生产后，每种供体细胞获得5头子代牛。
[0083]3、取子代牛的耳组织，提取基因组DNA，采用talenjd2f和talenjd2r组成的引物对进行PCR扩增，然后进行测序。
[0084]第一个供体细胞得到的5头牛犊均为Ilbp删除的单等位基因敲除克隆牛(部分测序结果见图3)。
[0085]第二个供体细胞得到的5头牛犊均为Ilbp删除的单等位基因敲除克隆牛。
【权利要求】
1.蛋白组，由TALE蛋白甲-1和TALE蛋白甲-1I组成；所述TALE蛋白甲-1包括序列表的序列14自N末端第180-791位氨基酸残基组成的结合域和序列表的序列14第867-1062位氨基酸残基组成的功能域；所述TALE蛋白甲-1I包括序列表的序列15自N末端第190-733位氨基酸残基组成的结合域和序列表的序列15自N末端第809-1004位氨基酸残基组成的功能域。
2.如权利要求1所述的蛋白组，其特征在于:所述TALE蛋白甲-1如序列表的序列14所示；所述TALE蛋白甲-1I如序列表的序列15所示。
3.DNA组，由TALE基因甲-1和TALE基因甲-1I组成；所述TALE基因甲-1编码权利要求I中所述TALE蛋白甲-1 ;所述TALE基因甲-1I编码权利要求1中所述TALE蛋白甲-1I。
4.如权利要求3所述的DNA组，其特征在于:所述TALE基因甲-1包括序列表的序列10自5’末端第548-2383位核苷酸所示的结合域编码区和序列表的序列10自5’末端第2609-3199位核苷酸所示的功能域编码区；所述TALE基因甲-1I包括序列表的序列11自5’末端第578-2209位核苷酸所示的结合域编码区和序列表的序列11自5’末端，第2435-3025位核苷酸所示的功能域编码区。
5.如权利要求3所述的DNA组，其特征在于:所述TALE基因甲-1如序列表的序列10所示；所述TALE基因甲 -1I如序列表的序列11所示。
6.RNA组，由TALE-RNA甲-1和TALE-RNA甲-1I组成；所述TALE-RNA甲-1为权利要求3至5中任一所述TALE基因甲-1编码的RNA ;所述TALE-RNA甲-1I为权利要求3至5中任一所述TALE基因甲-1I编码的RNA。
7.质粒组，由质粒甲和质粒乙组成；所述质粒甲为含有权利要求3至5中任一所述TALE基因甲-1的质粒；所述质粒乙为含有权利要求3至5中任一所述TALE基因甲-1I的质粒。
8.权利要求1或2所述蛋白组、权利要求3或4或5所述DNA组、权利要求6所述RNA组或权利要求7所述质粒组的应用，为如下(a)、(b)或(c): Ca)使ACC- α基因启动子P III失活；(b)制备使ACC- α基因启动子P III失活的试剂盒；(C)沉默离体的牛胎儿成纤维细胞中的ACC-α基因启动子P III。
9.将权利要求6中所述TALE-RNA甲-1和TALE-RNA甲-1I导入离体的牛胎儿成纤维细胞得到的ACC- α基因启动子P III失活的重组细胞。
10.权利要求1或2所述蛋白组、权利要求3或4或5所述DNA组、权利要求6所述RNA组、权利要求7所述质粒组或权利要求9所述重组细胞在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为生产产低脂奶的奶牛。
【文档编号】C12N5/10GK103923215SQ201410149606
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月15日 优先权日:2014年4月15日
【发明者】戴蕴平, 丁方荣, 王本利, 郑敏, 李松, 王海萍, 李京, 李玲, 王美丽 申请人:中国农业大学