一种鉴定水稻粒长基因qGL3等位基因变异的PCR分子标记方法

一种鉴定水稻粒长基因qGL3等位基因变异的PCR分子标记方法
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定水稻粒长基因qGL3等位基因变异的PCR分子标记方法，属农业生物工程【技术领域】。根据长、大粒品系TD70和短、小粒品种Kasalath在粒长基因qGL3核苷酸碱基序列上的差异，设计合成了四条特异性分子标记引物对不同水稻DNA进行PCR扩增，扩增产物在2.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，DuRed核酸显色后不同大小的DNA条带即代表qGL3不同的等位基因型。通过本发明的分子标记方法，不仅能快速、准确的鉴定水稻种质资源或育种群体中粒长基因qGL3的不同等位基因差异，而且能显著提高对长粒纯合基因型qGL3-TqGL3-T的选择效率，有利于水稻外观品质和产量性状的协同改良。
【专利说明】—种鉴定水稻粒长基因qGL3等位基因变异的PCR分子标记方法
一、【技术领域】
[0001]本发明公开了一种鉴定水稻粒长基因qGL3等位基因变异的PCR分子标记方法，属于农业生物工程【技术领域】，专用于含qGL3-TqGL3-T基因型长粒优质、高产水稻资源的筛选、鉴定和品种选育。
二、【背景技术】
[0002]水稻是我国重要的粮食作物，常年种植面积约3000万公顷，约占全国谷物种植面积的30%，稻谷总产量超过20000万吨，占全国粮食总产的40%以上，因此，水稻生产对保证我国粮食安全，促进国民经济发展具有举足轻重的地位(卢景波，中国稻米，2002，6:17-20)。
[0003]近年来，随着人口增长和人民生活水平的提高，国内市场对优质稻米的需求不断增大。水稻育种在关注品种产量提高的同时，更加注重稻米品质的提升(罗玉坤等，中国水稻科学，2004，18(2): 135-139)。粒型是衡量稻谷形态特征的重要指标，它由粒长、粒宽和粒厚三个基本要素组成，其中粒长性状与水稻产量及外观品质的关系最为密切，因而在水稻产量和品质改良中一直倍受育种家的关注。在保证粒宽不变的前提下，适当增加谷粒长度，稻米的千粒重、产量增加、垩白粒率降低、外观品质变优。遗传研究表明，粒长是一个复杂的数量性状，在不同的遗传群体或环境条件下表现为不同的遗传方式，它既可能受I个或几个主效基因的作用，也可能受多个微效基因的控制，表现出正态分布的遗传特征。由于粒长基因复杂的加性、显性以上位性效应，通过传统育种的方法很难对其进行性状改良，因此只有利用与粒长基因紧 密连锁或共分离的分子标记进行辅助育种才能对粒长性状进行准确、有效选择(杨悌丰等，分子植物育种，2010,8(1): 59-66)。
[0004]粒长基因的遗传解析是开展标记辅助选择的前提，近年来随着水稻高密度遗传图谱的构建以及基因组测序的完成，粒长数量性状位点的(Quantitative Trait Loci, QTL)定位工作取得了重要进展(王忠华等，生命科学，2009，21(3):444-451)。据Gramene网站的统计，截止到2014年3月通过20多个不同类型的遗传群体共定位到控制粒长性状的QTL76个，它们广泛分布于水稻12条染色体上，其中第3染色体检测的QTL数目最多且效应相对稳定，因而被认为是水稻粒长基因分布的热点区域(高志强等，遗传，2011，33(4):314-321)。
[0005]目前，水稻中已克隆的粒长基因有GS3和qGL3，它们位分别于第3染色体的不同区域。其中，位于着丝粒附近的粒长主效基因GS3不仅影响籽粒的长度，同时也影响稻谷的千粒重。与短、小粒水稻相比，长、大粒品种GS3基因在第2外显子上存在一个单核苷酸变异，导致原来编码半胱氨酸的TGC密码子突变成终止密码子TGA，使蛋白翻译提前终止，造成类PEBP结构域等4个保守区域的序列丢失，进而丧失基因功能，使籽粒长度和重量增大，这说明GS3基因编码的蛋白具有负向调控的作用(Fan C C, et al., Theoreticaland Applied Genetics, 2006，112(6):1164-1171;Mao H L, et al., Proc Natl Acad SciUSA, 2010，107(45): 19579-19584)。与GS3不同，粒长基因qGL3位于水稻第3染色体长臂中部，它编码含Kelch结构域的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。与9311相比，长、大粒品系N411在第10外显子中存在一个C到A单核苷酸碱基变异，造成第364个氨基酸由天冬氨酸替换为谷氨酸，导致颖壳细胞纵向分裂加速，进而引起籽粒变长、变大。通过对qGL3不同等位基因的遗传效应分析发现，qGL3对粒长的加性效应为0.33~1.17mm，可解释表型变异的19.20%~70.70%，对千粒重的加性效应为2.49~5.43g，可解释表型变异的23.09%~58.50% (Zhang X J,et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(52):21534-21539;Hu Zet al., Journal of Integrative Plant Biology, 2012，54(12):979-990)。由此可见，作为水稻中粒长效应较大的新基因，qGL3在稻米产量和品质育种中具有广泛的应用前景。
[0006]基因的测序研究表明，qGL3的粒长增效基因型在普通水稻中的分布非常稀少，仅存在一些特异的长粒种质资源中如N411、DT108和CW23等，缺乏等位基因变异是qGL3在育种中尚未得到有效利用的主要因素(Zhang X J, et al., Proc Natl AcadSci USA, 2012, 109(52):21534-21539;Hu Z et al., Journal of Integrative PlantBiology, 2012, 54(12):979-990)。同时，由于qGL3粒长增效等位基因的遗传效应与GS3基因非常类似，很难通过对谷粒长度的测量来有效区分这两种不同的基因。因此获得能鉴定qGL3不同基因型的分子标记对长粒水稻种质资源的鉴定和育种利用具有重要意义。然而，已报道的能用于qGL3基因型筛选的连锁标记全都来自于遗传差异较大的籼、粳交定位群体，在育种选择中不仅缺乏多态性，而且难已保证对后代单株基因型鉴定的准确性(ZhangX J，et al.,Proc Natl Acad Sci USA, 2012，109 (52): 21534-21539)。因此，建立一种基于PCR技术的分子标记方法来快速、准确的区分qGL3不同的等位基因，将有助于长、大粒水稻种质新资源筛选、鉴定和育种利用。
三、
【发明内容】

[0007]技术问题:本发 明针对现有连锁标记难以快速、准确鉴定粒长基因qGL3不同等位基因型的情况，根据长、大粒品种与短、小粒品种在qGL3第10外显子中存在C到A的单核苷酸碱基差异，设计基因特异性PCR引物对水稻DNA进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳和DuRed核酸显色来快速、准确的鉴定qGL3的不同等位基因，以提高对长粒纯合基因型qGL3-TqGL3-T的选择效率，加速长粒优质、高产水稻资源的筛选、鉴定和品种选育。
[0008]技术方案:
[0009]本发明“一种鉴定水稻粒长基因qGL3等位基因变异的PCR分子标记方法”，其特征在于:利用qGL3基因特异性引物
[0010]正向外引物qGL3-0-F 序列:5’ -GGCCACTCATGCACCATAACTACACTTG-3’
[0011]反向外引物qGL3-0-R 序列:5’ -CAGGTTTTCTTACCTCCTCGTAGACCTCCA-3’
[0012]正向内引物qGL3-1-F 序列:5’ -TGCACGATTCTATCTGGTTCAGTGCTAAAC-3’
[0013]反向内引物qGL3-1-R 序列:5’ -TGTCGCACCAGACTCCAGCAGCTATT-3’
[0014]快速、准确区分水稻粒长基因qGL3不同等位基因变异的PCR分子标记方法为:
[0015](I)水稻植株基因组DNA 的提取(SDS法)，参照Dellaporta S L, et al., Plant MolBiol Rep, 1983，1 (1):19221 ；
[0016](2)将上述的特异分子标记引物qGL3-0-F、qGL3-0-R、qGL3-1_F和qGL3_I_R加入同一 PCR反应体系，并对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增；20 μ L PCR反应体系包括:20ng/y L 的 DNA2.0 μ L, 4nmol/L 的引物 2.0 μ L，其中引物 qGL3-0_F、qGL3_0-R、qGL3-1-F 和 qGL3_I_R 各 0.5 μ L，含 25mmol/L MgCl2 的 10 X PCR Buffer2.0 μ L，2.5mmol/L 的 dNTP0.4 μ L, 2U/ μ L 的 Taq0.5 μ L 和 ddH2013.1 μ L ；
[0017]PCR反应程序包括:94°C预变性5min ;然后94°C变性30s、55°C复性30s、72°C延伸lmin，循环33次；然后72°C延伸IOmin后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。
[0018](3)反应产物在质量比浓度为2.0%的琼脂糖凝胶上100V电泳50min，经DuRed核酸染色并于凝胶成像系统下观察，记载。如果同时含有448bp和288bp两条特征条带，则为含粒长基因型qGL3」qGL3-T的纯合体；如果同时含有448bp和216bp两条特征条带，则为含粒长基因型qGL3-KqGL3-K的纯合体，如果同时存在448bp、288bp和216bp的三条特征条带，则为含粒长基因型qGL3」qGL3-K的杂合体。
[0019]有益效果
[0020]本发明提供的“一种鉴定水稻粒长基因qGL3等位基因变异的PCR分子标记方法”，具有以下优点:
[0021](I)本发明提供的分子标记是根据qGL3等位基因的差异设计的功能性标记，其喊基变异能直接反映植株的表型，不存在标记和基因之间的遗传交换造成基因型的错误鉴定，有效解决了分子检测过程中标记多态性差、准确性不高的弊端；
[0022](2)本发明提供的分子标记方法能够通过简单的PCR扩增实现对qGL3不同基因型水稻种质的快速鉴定。由于水稻粒长性状是由多基因控制的数量性状，且qGL3基因的遗传效应与GS3非常相似，仅根据其粒长表型很难确定水稻中是否具有其目标基因型，而通过本发明的分子标记方法 则能克服这一缺陷；
[0023](3)本发明提供的分子标记方法能有效用于长粒优质、高产水稻品种的标记辅助育种。由于传统育种对粒长性状的选择主要依靠肉眼观察和长度测量，这样的选育方法不仅受植株生长发育阶段的影响，而且耗时、耗力。利用本发明的分子标记方法，在苗期就可通过引物扩增的特异条带，判断qGL3不同的等位基因差异，以此预测水稻籽粒长度的表型，这在很大程度上提高了水稻品种的选择效率，缩短了育种周期和减少育种成本，加快了水稻外观品质和产量的改良进程。
四、【专利附图】

【附图说明】
[0024]图1长、大粒品系TD70与短、小粒品种Kasalath籽粒长度的比较
[0025](A:含qGL3」qGL3-T纯合基因型长、大粒水稻品系_TD70 ；B:含qGL3-KqGL—K纯合基因型短、小粒水稻品种-Kasalath)
[0026]图2利用TD70/Kasalath重组自交系群体定位粒长QTL — qGL3
[0027]图3用于检测粒长基因qGL3等位基因变异的PCR分子标记设计策略
[0028](注:序列比较图中方框代表qGL3基因在长、大粒品系TD70和短、小粒品种Kasalath中的碱基差异位点；箭头表示引物位置和长度，qGL3_0_F表示正向外引物，qGL3-0-R表示反向外引物，qGL3-1-F表示正向内引物，qGL3_I_R表示反向内引物)
[0029]图4特异PCR分子标记对不同水稻品种qGL3等位基因的检测
[0030](M:DNA 分子量标准，100-2，OOObp ；1:TD70 ；2 =Kasalath ；3 ~17:武粳 13、日本晴、苏御糯、桂朝糯、南粳44、武运粳23、9311、明恢63、珍汕97、桂朝2号、龙特甫、蜀恢527、蜀恢158、华占和南京11)
[0031]图5特异PCR分子标记对TD70/Kasalath重组自交系群体不同株系qGL3等位基因的检测(M:DNA 分子量标准，100-2，OOObp ；1:TD70 ；2 =Kasalath ；3 =TDTOAasalathF1 ；4 ~7:部分重组自交系植株)
[0032]图6本发明分子标记方法用于水稻品种Kasalath粒长性状的改良过程
[0033]图7Kasalath和Kasalath-qGL3^改良系粒长性状的比较
[0034](A:含qGL3-KqGL3-K纯合基因型短、小粒水稻Kasalath ；B:含qGL3-TqGL3-T纯合基因型长、大粒水稻Kasalath_qGL3i)
五、【具体实施方式】
[0035]通过对江苏省农业种质资源中期库低温保藏的3000余份水稻种质资源进行粒型性状的鉴定、分析，从中筛选到1份来源于天鹅谷///9520// (72-496/御糯)杂交后代的长、大粒粳稻稳定品系TD70。利用TD70与短、小粒印度籼稻品种Kasalath杂交，经单粒传法构建了含240个株系的重组自交系群体，通过分子连锁图谱的绘制和2010-2011连续两年的QTL定位分析，在水稻染色体上定位到多个与粒型相关的QTL，其中在第3染色体上定位到I个粒长QTL-qGL3_2。通过对TD70和Kasalath DNA的测序分析，确定了 qGL3_2就是已报道的qGL3基因，一个位于水稻第3染色体长臂控制粒长性状新的主效QTL (图2)。与短、小粒水稻品种Kasalath相比，长、大粒品系TD70在该基因第10外显子1092位核苷酸处存在一个单碱基C-A的变异，造成第364个氨基酸由天冬氨酸替换为谷氨酸，导致颖壳细胞纵向分裂加速，进而引起籽粒变长、变大的表型。根据这一单核苷酸差异设计了特异PCR分子标记，利用该方法可以有效鉴定水稻种质资源或育种群体中粒长基因qGL3的不同等位基因，提高对粒长增效基因型qGL3-TqGL3_T的选择效率，缩短育种周期、减少育种成本，加速长粒优质、高产水稻资源的筛选、鉴定和品种选育。
[0036]为充分公开本发明“一种鉴定水稻粒长基因qGL3等位基因变异的PCR分子标记方法”，以下结合方法验证和实施实例加以说明。其具体实施步骤如下:
[0037](一)试验材料
[0038]来源于天鹅谷///9520// (72-496/御糯)杂交后代，长、大粒粳稻品系TD70(粒长13.70 ±0.1Omm,千粒重80.75 ±2.35g)；短、小粒印度籼稻品种Kasalath，粒长
8.09±0.06mm,千 粒重 20.25±0.12g)以及来源于 TD70/Kasalath240 个株系(F8 世代)构成的重组自交系群体。
[0039]6个常规粳稻品种:武粳13 (江苏常州武进稻麦育种场)、日本晴(日本爱知县农试场)、苏御糯(江苏太湖地区农家品种)、桂朝糯(扬州大学农学院)、南粳44 (江苏省农业科学院粮食作物研究所)和武运粳23 (江苏常州武进水稻研究所)；
[0040]9个常规籼稻材料:扬稻6号(江苏里下河地区农业科学研究所)、明恢63 (福建三明农业科学研究所)、珍汕97 (浙江温州农业科学研究所)、桂朝2号(广西农业科学院)、龙特甫(福建漳州农业科学研究所)、蜀恢527 (四川农业大学水稻研究所)、蜀恢158 (四川农业大学水稻研究所)、华占(中国水稻所)和南京11 (江苏省农业科学院粮食作物研究所)。
[0041]以上材料均为公知公用材料，江苏省农业种质资源中期库可免费提供。具体参考文献为:张亚东等，中国水稻科学，2013，27(2):122-128;钱金敖等，江苏农业科学，2005，4:305;蒋云洪等，山东农业科学，1981,2:28-29;吴竞伦等，江苏农业科学，1992,3:6-8;王飞华，扬州大学硕士论文，2009，23;王才林等，中国稻米，2007，13⑵:33-34;王志明等，中国种业，2011，5:75;戴正元等，江苏农业科学，1997,4:13-14;吴方喜等，福建农业学报，2011，26 (6): 1101-1112;陈建明等，种子，2002，3:50-51;林世成，闵绍楷，中国水稻品种及其系谱.上海:上海科学技术出版社.1991:312;高明亮等，杂交水稻，2001，16⑵:5_6;王玉平等，杂交水稻，2004，19(4):12-14;吴先军等，中国种业，2007，10:70;禹盛苗等，杂交水稻，2009, 24(6):42-44;林世成，闵绍楷，中国水稻品种及其系谱.上海:上海科学技术出版社.1991:318。
[0042](二)粒长基因qGL3分子标记的开发
[0043](1)长、大粒水稻种质资源的筛选
[0044]通过对江苏省农业种质资源中期库低温保藏的3000余份水稻种质资源进行粒型性状的鉴定、分析，从中筛选到1份来源于天鹅谷///9520// (72-496/御糯)杂交后代，长、大粒粳稻稳定品系TD70。通过连续多年粒型表型测定，TD70粒长13.70±0.10mm，千粒重80.75±2.35g，短、小粒印度籼稻品种 Kasalath 粒长 8.09±0.06mm，千粒重 20.25±0.12g,
两者差异非常显著(图1)。
[0045](2) TD70/Kasalath重组自交系粒长基因的QTL定位研究
[0046]利用长、大粒水稻品系TD70与短、小粒籼稻品种Kasalath杂交，经单粒传法构建了含240个株系的重组自交系群体，利用141个在亲本间存在多态性差异的微卫星标记绘制了该群体的分子连锁图谱，以粒长测定值为原数据，利用QTL IciMapping3.1软件，以LOD值2.5作为阈值，采用完备区间作图法在全基因组范围内进行扫描，检测粒长性状QTL位点，在水稻第3染色体长臂上定位到I个主效粒长QTL-qGL3_2。分析TD70和Kasalath的qGL3-2基因序列，发现它们之间存在多处碱基差异。其中TD70在该基因第10外显子1092位核苷酸处存在C到A单核苷酸碱基变异，造成第364位氨基酸由天冬氨酸替换为谷氨酸，导致颖壳细胞纵向分裂的速度加快，进而引起籽粒变长、变大的表型，因此确定qGL3_2就是已报道的粒长基因qGL3。
[0047](3)标记的引物设计
[0048]根据TD70和Kasalath在qGL3位点第10外显子1092位核苷酸处存在C到A的单碱基变异，从NCBI网站下载已经公布的qGL3基因组BAC克隆序列(序列号为:AK288069)，设计了特异PCR分子标记(图3)，其引物序列为:
[0049]正向外引物qGL3-0_F 序列:5’ -GGCCACTCATGCACCATAACTACACTTG-3’
[0050]反向外引物qGL3-0-R 序列:5’ -CAGGTTTTCTTACCTCCTCGTAGACCTCCA-3’
[0051]正向内引物qGL3-1-F 序列:5’ -TGCACGATTCTATCTGGTTCAGTGCTAAAC-3’
[0052]反向内引物qGL3-1_R 序列:5’ -TGTCGCACCAGACTCCAGCAGCTATT-3’
[0053](二)分子标记分析
[0054]( I)水稻品种基因组DNA的提取
[0055]水稻品种基因组DNA 的提取(SDS 法)，参照 Dellaporta S L, et al., Plant MolBiol Rep, 1983，1 (1): 19221。具体步骤为:取水稻苗期叶片，在_20°C预冷的研钵中用液氮研磨并装入 1.5mL 离心管；加入 600uL 提取液(20%SDS，IM Tris-HCl，0.5M EDTA, 5M NaCl，65°C预热)，摇匀，65°C温浴30min，中间振荡3~4次；加入1/4体积5MKAC，摇匀后置冰上30min ;加入氯仿-异戊醇(24:1)300~400uL，在摇床上充分振荡，120rpm，30min ；8000~1000Orpm离心15分钟，液面分层，下层颜色较深，上层微带黄绿色，取上清(400uL左右)至另一离心管；加入等体积氯仿-异戍醇(24:1),摇床上充分振荡,80~90rpm,30min ；8000rpm离心15分钟，转移上清(400uL左右)至新的离心管；加入2倍体积_20°C预冷的无水乙醇，轻轻摇匀直到有絮状物产生，12000rpm离心6min ;弃无水乙醇，加入4°C 70%乙醇，放置lOmin，弃上清，超净工作台上风干Ih ;加入100~200uLTE，-20°C保存。
[0056]( 2 )分子标记的扩增和电泳检测
[0057]qGL3基因特异分子标记引物序列为:
[0058]正向外引物qGL3-0-F 序列:5’ -GGCCACTCATGCACCATAACTACACTTG-3’
[0059]反向外引物qGL3-0-R 序列:5’ -CAGGTTTTCTTACCTCCTCGTAGACCTCCA-3’
[0060]正向内引物qGL3-1-F 序列:5’ -TGCACGATTCTATCTGGTTCAGTGCTAAAC-3’
[0061]反向内引物qGL3-1-R 序列:5’ -TGTCGCACCAGACTCCAGCAGCTATT-3’
[0062]将所述分子标记引物qGL3-0-F、qGL3-0-R、qGL3-1_F 和 qGL3_I_R 加入同一 PCR 反应体系，对不同水稻品种和TD70/Kasalath重组自交系群体各株系的DNA进行PCR扩增；
[0063]20 μ L PCR 反应体系包括:20ng/ μ L 的 DNA2.0 μ L，4nmol/L 的引物 2.0 μ L，其中引物 qGL3-0_F、 qGL3_0_R、qGL3_I_F 和 qGL3_I_R 各 0.5 μ L，含 25mmol/L MgCl2 的10XPCRBuffer2.0 μ L，2.5mmol/L 的 dNTP0.4 μ L, 2U/ μ L 的 Taq0.5 μ L 和 ddH2013.1 μ L ；
[0064]PCR反应程序包括:94°C预变性5min ;然后94°C变性30s、55°C复性30s、72°C延伸lmin，循环33次；然后72°C延伸IOmin后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应；反应产物在质量比浓度为2.0%的琼脂糖凝胶上100V电泳50min，经DuRed核酸染色并于凝胶成像系统下观察，记载。
[0065](四)本发明特异PCR分子标记对不同水稻品种qGL3等位基因的检测
[0066]以长、大粒品系TD70和短、小粒品种Kasalath为对照，对6个粳稻品种武粳13、日本晴、苏御糯、桂朝糯、南粳44、武运粳23以及9个籼稻品种9311、明恢63、珍汕97、桂朝2号、龙特甫、蜀恢527、蜀恢158、华占、南京11的DNA进行qGL3基因型的检测。PCR扩增产物经2.0%的琼脂糖凝胶电泳可显示两种类型的条带。其中被正、反向外引物qGL3-0_F和qGL3-0-R扩增的448bp的条带在每个DNA样品中均出现，它不仅起阳性对照的作用(检测DNA能否得到有效扩增)，同时也可以有效降低非特异PCR产物的扩增以及引物二聚体的形成。除448bp的共有条带外,仅有长、大粒品系TD70能扩增出一条约288bp的特征条带,该条带是由正向外引物qGL3-0_F和反向内引物qGL3_I_R扩增产生的，它扩增的是qGL3位点第10外显子1092位核苷酸为A的等位位点(即长、大粒品系TD70基因型，qGL3_TqGL3_T)；而其它所有籼、粳稻品种均只能扩增出除448bp以外的一条约216bp的特征条带，该条带是由正向内引物qGL3-1_F和反向外引物qGL3_0_R扩增产生的，它扩增的是qGL3位点第10外显子1092位核苷酸为C的等位位点(即短、小粒品种Kasalath基因型，qGL3_KqGL3_K)(图4)。这也证实了 qGL3的粒长增效基因qGL3_TqGL3_T在普通水稻中的分布的确非常稀少，仅存在于极少数特异的长粒种质资源中。通过对具有qGL3_KqGL3_K相同基因型的15个籼、粳稻品种进行粒长性状的分析，结果表明导致这些品种存在粒长差异的原因只在于它们具有不同的GS3等位基因型(表1)。
[0067]表1籼、粳稻品种GS3和qGL3不同基因型和粒长表型值
[0068]
【权利要求】
1.一种鉴定水稻粒长基因qGL3等位基因变异的PCR分子标记方法，其特征在于: 用基因特异性引物 正向外引物序列:5’-GGCCACTCATGCACCATAACTACACTTG-3’ 反向外引物序列:5’-CAGGTTTTCTTACCTCCTCGTAGACCTCCA-3’ 正向内引物 qGL3-1 -F 序列:5’-TGCACGATTCTATCTGGTTCAGTGCTAAAC-3’ 反向内引物 qGL3-1 -R 序列:5’-TGTCGCACCAGACTCCAGCAGCTATT-3’ 扩增水稻品种的基因组DNA，如果同时含有448 bp和288 bp两条特征条带，则为含粒长基因型的纯合体；如果同时含有448 bp和216 bp两条特征条带，则为含粒长基因型沐的纯合体，如果同时存在448 bp,288 bp和216 bp的三条特征条带，则为含粒长基因型qGL3JqGL3-K的杂合体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于: (1)水稻植株基因组DNA的提取； (2)将权利要求1所述的分子标记引物qGL3-Q_Y、qGL3~0-R,qGL3-l~￥和於ZJ-1-R加入同一PCR反应体系，并对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增；20 μ L PCR反应体系包括:20 ng/yL的DNA 2.0 yL,4 nmol/ L的引物2.0 μ L，其中引物qGL3-Q-Y、^XJ-O-R、和各 0.5 μ L，含 25 mmol/L MgCl2 的 10XPCR Buffer 2.0μ L，2.5 mmol/L 的 dNTP 0.4 μ L，2 U/ μ L 的 Taq0.5 μ L 和 ddH20 13.1 μ L ； PCR反应程序包括:94 °C预变性5 min ;然后94°C变性30s、55°C复性30s、72°C延伸lmin，循环33次；然后72°C延伸10 min后，将扩增产物加入上样缓冲液终止反应； (3)反应产物在质量比浓度为2.0%的琼脂糖凝胶上100V电泳50 min,经DuRed核酸染色并于凝胶成像系统下观察，记载。
【文档编号】C12Q1/68GK103882145SQ201410151509
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月15日 优先权日:2014年4月15日
【发明者】张亚东, 周丽慧, 郑佳, 丁丹, 王才林, 陈涛, 姚姝, 朱镇, 赵庆勇, 赵凌, 于新, 赵春芳 申请人:江苏省农业科学院