一种纯化制备赭曲霉毒素a和赭曲霉毒素b的方法
【专利摘要】本发明提供了一种纯化制备赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法。该方法包括产毒培养基的制备、毒素的提取浓缩、分离及重结晶等步骤。此工艺简单有效，可应用于大规模工业化生产。同时制备得到的赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B纯度达到98％以上，可将其作为标准参考物质应用于粮食及食品中赭曲霉毒素的安全监控及相关科学研究。
【专利说明】一种纯化制备赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从人工接种的培养基中提取、分离纯化真菌产生的次级代谢产物的方法，属于天然产物提取领域。
【背景技术】
[0002]赭曲霉毒素(ochratoxins)是由曲霉菌属和青霉菌属的某些菌株所产生的一类具有致癌、致畸、免疫抑制和肝肾毒性的有毒代谢产物。赭曲霉毒素主要包括赭曲霉毒素A(OTA)及甲酯化合物、赭曲霉毒素B(OTB)、赭曲霉毒素C(OTC)和赭曲霉毒素D(OTD)。其中，OTA和OTB是自然界中污染水平最为严重的两种赭曲霉毒素，可广泛存在于粮食、大豆、花生、饲料、咖啡、白酒、葡萄及葡萄酒、动物肾脏及牛奶等不同农产品中。
[0003]研究表明，OTA主要对肾脏产生危害，可造成肾肿大。它也可破坏免疫系统，引起肝脏的急性功能性障碍、脂肪变性和肠炎等。人和动物长期摄入被OTA污染的食物或饲料可引起致癌、致畸、致突变等作用。因此，在1993年国际癌症中心已经将OTA列为可能的致癌物(2B类)。另外，在欧洲巴尔干地区，它被怀疑与地方流行性肾病有关。OTB是OTA的非氯同系物。在自然界中它的生物量约为OTA的1/5。OTB具有较小的毒性。但是在体外试验表明它和OTA具有相同的细胞毒性。
[0004]鉴于赭曲霉毒素在食品中的广泛污染及毒性,世界各国对赭曲霉毒素已经建立了不同的限量标准及法律法规。欧盟颁布的《食品中真菌毒素限量标准(EC)N0.466/2001》规定谷物中的最大限量为5 μ g/kg,谷物制品中为3 μ g/kg,葡萄干中为10 μ g/kg ;我国于2011颁布了新修订的真菌毒素限量标准即标准《GB 2761-2011食品安全国家标准-食品中真菌毒素限量》中规定了谷物及谷物制品(玉米、大麦、小麦、玉米面、小麦粉、麦片)、豆类及其制品(干豆及以干豆磨成的粉)中OTA最大限量标准为5 μ g/kg。目前国际上还没有制定OTB的限量标准。
[0005]食品安全监控及赭曲霉毒素毒理学的研究仍然需要大量的纯品。目前国内使用的赭曲霉毒素标准物质均为美国、奥地利、新加坡等国外进口产品，价格昂贵OTA约为800元Mg, OTB价格约为3200元/mL(10 μ g/mL)。鉴于此，如果单纯依靠购买国外标准物来进行国内食品安全监控及科学研究，可造成巨大的花费且易受到国外的条件限制。经检索我国至今尚未有赭曲霉毒素标准物质制备方面的报道。因此，迫切需要开发赭曲霉毒素纯化制备方法来填补国内空白，从而促进相关领域的监控及研究。
[0006]目前赭曲霉毒素的纯化制备方法主要包括两大类:化学合成法及天然提取法。(I)Sibi等通过结合O-芳香基氨基甲酸酯和苯甲酰胺介导的金属化反应合成出了 OTA及0ΤΒ。此制备方法需要多步的合成及纯化，整个过程OTA产率约为14%，0TB产率约为6%。此制备工艺的低产率极大地限制了其应用于工业化生产；(2)从人工接种的培养基中提取纯化目标化合物是另一种制备真菌毒素标准物质的方法。目前从不同培养基中提取纯化OTA的方法已经有报道。Davis等通过人工接种曲霉菌孢子液至液体培养基中，然后通过反复的萃取及重结晶最终获得OTA。Bunge等将侵染曲霉菌的谷物接种至小麦培养基中，然后经过提取、萃取及多步柱色谱净化，最后重结晶获得目标毒素。另外，Peterson等从人工接种的小麦培养基中提取0TA，经过反复萃取，然后通过制备液相及重结晶获得0TA。大多数的这些方法样品前处理需要经过复杂萃取及多步柱层析，生产周期长且消耗大量的有机溶剂，同时获得的产物纯度不高。最重要的是这些方法仅能够纯化制备0TA，不能够同时制备OTA和OTB两种毒素。
[0007]随着液相色谱技术的发展，现有的色谱柱具有更加优异的分离效率及柱效，可以在较短时间内从复杂基质中分离纯化目标化合物。本发明利用此技术开发出一种可同时纯化制备赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种纯化制备赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法。该方法操作简单、生产成本低，可用于大规模工业化生产。制备得到的OTA和OTB纯度高，可作为标准物质应用于食品安全监控及毒理学实验。
[0009]本发明提供的一种制备赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法，具体包括如下步骤:
[0010](I)孢子液的制备曲霉菌或青霉菌的菌株接种在马铃薯培养基(PDA)上黑暗条件下28°C培养3d。将5mL灭菌水加入至PDA，使用灭菌后的接种环轻轻刮取培养基表面孢子。然后再用灭菌水反复冲洗PDA，合并洗液且在-20°C条件下保存。
[0011](2)产毒培养基的制备称取适量小麦于锥形瓶中，加入适量去离子水浸泡lh，然后高温高压灭菌。待冷却至室温后，将步骤(1)所制备的孢子液接种至培养基。在28°C条件下避光培养30d。
[0012](3)毒素的提取培养结束后小麦培养基在50°C干燥箱中干燥24h，然后使用高速粉碎机粉碎。称取适量粉碎后的样品置于锥形瓶中加入80%甲醇/水超声提取，提取液于4°C条件下放置12h以沉淀颗粒性物质。双层纱布过滤后在40°C下旋转蒸发至原体积的1/5，然后使用酸化的二氯甲烷进行萃取，萃取液40°C条件下浓缩至干，得到固体残渣。用30%乙腈/水溶液复溶后，正己烷进行脱脂处理，过0.22 μ m尼龙滤膜待进样。
[0013](4)制备液相分离纯化流动相为甲醇(A)和水(B);流速为3.5mL/min ;色谱柱为Pursuit XRs C18柱(250_X 10mm, 10 μ m);检测波长为337nm ;进样体积为3mL ;线性梯度洗脱程序:0min30% A, lmin30% A,20min90% A,21min90% A,22min30% A，此梯度持续3min,总运行时间为25min ;含OTA的馏分收集时间为17.7min至20.6min，含OTB的馏分收集时间为11.1至13.7min。各自馏分液50°C条件下旋蒸后在真空冷冻干燥机下干燥，获得淡黄色固体粉末。
[0014](5)将(4)获得的固体残留物用加热后的苯溶解(温度不高于40°C)，置于4°C冰箱中有固体结晶状物体出现，去除母液后，使用4°C苯冲洗两次获得白色的固体物质。
[0015](6)将制备得到的OTA及OTB通过超高压液相色谱进行纯度分析，确定:0ΤΑ纯度为 98.25 %，OTB 纯度为 98.43 %。
[0016](7)通过液相串联质谱技术，在正离子模式下全扫描分析(m/z200~600)得到OTA为[M+H]+ = 404.04，OTB为[M+H]+ = 370.07，确定其分子量分别为403和369。质谱全扫图与sigma公司相应的参考标准物质比较几乎完全一致，间接证明得到的化合物具有高纯度；化合物的结构通过产物离子扫描来确证。OTA和OTB产生的产物离子与先前文献中的报道完全一致，确证了获得的化合物为OTA和0ΤΒ。
[0017]与现有技术相比，本发明有以下有益的技术效果:
(1)此技术可以同时制备OTA和OTB两种赭曲霉毒素，通过检索发现这是首次报道。此方法可以极大的提高生产效率和节约生产成本。
(2)优化产毒培养基此方法通过比较优化不同的培养基及培养时间下OTA和OTB的产量，最终确定小麦为曲霉菌或青霉菌的最佳产毒培养基质，可以获得高量的赭曲霉毒素。
(3)优化样品净化过程为了获得高纯度的OTA和OTB及减少有机溶剂的使用量，不同的萃取溶剂及萃取条件进行比较和优化，最终选择酸化的二氯甲烷做为最佳萃取溶剂。此萃取溶剂减少了萃取过程中有机溶剂的使用量。
(4)通过制备液相的分离纯化最终从10g小麦培养基中得到69mgOTA和6mg OTBjife度均达到98%以上，优于先前文献中报道的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明
[0019]图1为赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B纯化制备流程图。
[0020]图2 (a)为赭曲霉毒素粗提液的制备液相图谱；(b)为上样体积为5mL时收集懼分液的超高压液相色谱图；(C)为上样体积为3mL时收集馏分液的超高压液相色谱图。
[0021]图3为超高压液相色谱图(a)萃取前粗提液；(b)萃取后粗提液；(c) OTA和OTB标准物质；(d)纯化后OTA ； (e)纯化后OTB。
[0022]图4为质谱图(a)OTA全扫描图谱；(b)OTB全扫描图谱；(c)OTA产物离子扫描图谱；(d)OTB产物离子扫描图谱。
【具体实施方式】
[0023]下面给出的实施例对本发明作进一步的说明，特别需要指出的是所有类似的替换或更改，均被视为包括在本发明。
[0024]实施例1:
(1)曲霉菌接种至PDA培养基，在28°C条件下培养3d后加入5mL灭菌水，用灭菌后的接种环轻轻刮取培养基表面的孢子。用灭菌水反复冲洗，合并洗液。通过血球计数板计数调节浓度至1.0X 15个/mL，-20°C条件下保存。
(2)称取75g小麦于500mL锥形瓶中，加入35mL去离子水，在121°C下高温灭菌30min。冷却至室温后，孢子液接种至灭菌的小麦培养基，在28°C条件下培养30d。培养结束后，小麦培养基在50°C干燥箱中干燥24h，然后使用高速粉碎机粉碎成均匀的粉末。
(3)称取10g干燥粉末置于锥形瓶中加入400mL不同提取溶剂(80/20乙腈/水，79/20/1乙腈/水/乙酸，80/20甲醇/水，79/20/1甲醇/水/乙酸，乙酸乙酯，甲苯、含I %碳酸氢钠水溶液)进行超声提取。提取液于4°C条件下放置12h以沉淀颗粒性物质，定性滤纸过滤。在40°C下旋转蒸发至提取液减少约4/5后，用含1%乙酸的二氯甲烷萃取，然后40°C下浓缩至干，得到黄色固体物质。
(4)固体物质用30%乙腈/水溶液复溶后，正己烷进行脱脂处理，过0.22 μ m尼龙滤膜后通过制备液相进行分离纯化。流动相为甲醇㈧和水⑶；流速为3.5mL/min ;色谱柱为Pursuit XRs C18柱(250_X 1mm, 10 μ m);检测波长为337nm ;进样体积为3mL ;线性梯度洗脱程序:0min30% A, lmin30% A,20min90% A,21min90% A,22min30% A，此梯度持续3min，总运行时间为25min ;含OTA的馏分收集时间为17.7-20.6min，含OTB的馏分收集时间为11.1-13.7min。馏分液在50°C条件下旋蒸后于真空冷冻干燥机下干燥，获得淡黄色固体粉末。
(5)淡黄色的固体粉末用加热后的苯溶解(温度不高于40°C )，置于4°C冰箱中有固体结晶状物体出现，去除母液后，使用4°C苯冲洗两次获得白色的固体物质。
[0025]实施例2:
曲霉菌孢子液制备同实施例1。称取75g燕麦于500mL锥形瓶中，加入35mL去离子水，在121 °C高温灭菌30min ;其余步骤同实施例1。
[0026]实施例3:
曲霉菌孢子液制备同实施例1。称取75g玉米于500mL锥形瓶中，加入35mL去离子水，在121 °C高温灭菌30min ;其余步骤同实施例1。
[0027]实施例4:
曲霉菌孢子液制备同实施例1。称取75g大米于500mL锥形瓶中，加入35mL去离子水，在121 °C高温灭菌30 min ;其余步骤同实施例1。
【权利要求】
1.一种纯化制备赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法,其特征在于: 该方法包括如下步骤: (1)将曲霉菌、青霉菌或其孢子液接种至灭菌后的培养基进行产毒培养； (2)培养基经过提取、过滤及浓缩后使用有机溶剂进行萃取； (3)萃取后的溶液通过制备液相进行分离，分别收集馏分液蒸干复溶后重结晶获得目标毒素； (4)获得的毒素通过超高压液相色谱及液相串联质谱等进行纯度分析、结构确证。
2.如权利要求1所述一种纯化制备赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法，其特征在于所述步骤(1)中的曲霉囷、青霉囷或其抱子液为可广生赫曲霉毒素A和赫曲霉毒素B的囷株。
3.如权利要求1所述一种纯化制备赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法，其特征在于所述步骤(1)中的培养基为:包括小麦、燕麦、荞麦、大米、玉米及高梁等粮食类，及有利于步骤(1)中菌株生长产毒的培养基。
4.如权利要求1所述一种纯化制备赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法,其特征性为:步骤(2)中提取所用溶剂为甲醇、乙腈及其不同比例水溶液。萃取溶剂为可以从水溶液中萃取赭曲霉毒素的有机试剂，如二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯及乙酸乙酯等。
5.如权利要求1所述一种纯化制备赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法，其特征性为:步骤(3)中制备液相色谱柱为:反相色谱柱，例如C8、C18柱等。
6.如权利要求1所述一种纯化制备赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的方法,其特征性为:步骤(3)中重结晶中所用的溶剂为加热后的苯，同时加热温度不能超过40°C。
【文档编号】C12P17/06GK104178535SQ201410155926
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】武爱波, 赵志勇, 宋素泉, 王建华, 刘娜, 聂冬霞, 杨宪立, 林善海 申请人:上海市农业科学院, 上海科立特农产品检测技术服务有限公司