一种使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法
【专利摘要】本发明涉及一种使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法，属于核酸纯化【技术领域】。首先向恰当保存的组织材料中加入添加新型指示剂的酚胍盐裂解液，之后用匀浆器将样本粉碎均匀，加入氯仿使液体充分混匀后，离心转移上清至新管中，加入异丙醇沉淀核糖核酸，之后用75%的乙醇洗涤沉淀，最后用无核糖核酸酶的水溶解核糖核酸。本发明方法可用于提取动物、植物组织、细胞、血液、细菌以及病毒的总RNA，提取的RNA纯度高，基因组残留少，完整性好，适用于下游多种分子生物学实验。
【专利说明】—种使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法，属于核酸纯化【技术领域】。
【背景技术】
[0002]纯度高、完整性好的核糖核酸(RNA)的提取是分子生物学研究、临床以及生物技术应用的关键步骤。目前核糖核酸(RNA)提取常用的方法有:吸附法和酚仿抽提法。吸附法多见于硅基质膜吸附、离子交换树脂以及磁珠等材料，该法使得RNA在高盐条件下专一性的与吸附材料结合，蛋白等杂质不能结合而被洗脱，盐类则被乙醇漂洗去除，最后用去核糖核酸酶的水将核糖核酸洗脱下来；酚仿抽提法结合高浓度异硫氰酸胍盐类，可达到充分裂解组织样本并且强烈抑制核糖核酸酶(RNase)的目的，匀浆液分层:上层水相为核糖核酸(RNA)，中间层为脱氧核糖核酸(DNA)，下层有机相为蛋白质，之后经异丙醇将水相总核糖核酸沉淀下来，用75%的乙醇洗涤核糖核酸沉淀去除盐类即可，最后用去核糖核酸酶(RNase)的水溶解核糖核酸，所得核糖核酸完整性好，对于标准化RNA生产十分有用。但是此法经常由于操作原因将中间相脱氧核糖核酸一同转移，导致所得核糖核酸中脱氧核糖核酸残留较多，严重影响后续反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)实验，因此，一种界相分明的新型酚胍盐裂解液(TRIzol)的研发及其应用对于分子生物学实验的改进非常必要。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提出一种使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法，利用含有指示剂的裂解液充分裂解组织样本，有效抑制核糖核酸酶(RNase)的活性，其中的指示剂用于明确分离不同界相，以保证提取过程的酸性环境，从而达到RNA的最大提取得率。
[0004]本发明提出的使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法，包括以下各步骤:
[0005](I)向30-50毫克动物组织或植物组织中加入I毫升含有指示剂的酚胍盐裂解液，用匀浆器匀浆样本，或液氮研磨，得到匀浆液；
[0006](2)将匀衆液在室温下放置5分钟,使得核酸与蛋白充分分尚；
[0007](3)向步骤(2)的匀浆液中加入0.2毫升氯仿，颠倒混匀15秒，使氯仿与匀浆液充分混匀，室温下放置3分钟，进行离心，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为15分钟，使水相与有机相彻底分离；
[0008](4)经步骤(3)离心后的溶液分为三层，上层为含有核糖核酸(RNA)的无色水相，中间层为含有脱氧核糖核酸(DNA)的白色界相，下层为含有蛋白质的红色有机相，将上层含有核糖核酸的无色水相转移至试管中；
[0009](5)在步骤(4)的试管中加入0.5毫升异丙醇沉淀核糖核酸(RNA)，室温下保持10分钟，进行离心，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为10分钟；
[0010](6)将步骤(5)离心后的上清液弃掉，保留核糖核酸(RNA)沉淀，向核糖核酸沉淀中加入I毫升75%乙醇洗涤，进行离心，离心分离的转速为8000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为5分钟；
[0011](7)弃掉步骤(6)的上清液,加入去核糖核酸酶(RNase-free)的水,用移液枪反复吹打几次，溶解核糖核酸(RNA)。
[0012]上述方法中，所述的含有指示剂的酚胍盐裂解液中的各组分为:
[0013]
【权利要求】
1.一种使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法，其特征在于该方法包括以下各步骤: (1)向30-50毫克动物组织或植物组织中加入I毫升含有指示剂的酚胍盐裂解液，用匀浆器匀浆样本，或液氮研磨，得到匀浆液； (2)将匀浆液在室温下放置5分钟，使得核酸与蛋白充分分离； (3)向步骤(2)的匀浆液中加入0.2毫升氯仿，颠倒混匀15秒，使氯仿与匀浆液充分混匀，室温下放置3分钟，进行离心，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为15分钟，使水相与有机相彻底分离； (4)经步骤(3)离心后的溶液分为三层，上层为含有核糖核酸(RNA)的无色水相，中间层为含有脱氧核糖核酸(DNA)的白色界相，下层为含有蛋白质的红色有机相，将上层含有核糖核酸的无色水相转移至试管中； (5)在步骤(4)的试管中加入0.5毫升异丙醇沉淀核糖核酸(RNA)，室温下保持10分钟，进行离心，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为10分钟； (6)将步骤(5)离心后的上清液弃掉，保留核糖核酸(RNA)沉淀，向核糖核酸沉淀中加入I毫升75%乙醇洗涤，进 行离心，离心分离的转速为8000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为5分钟； (7)弃掉步骤(6)的上清液，加入去核糖核酸酶(RNase-free)的水，用移液枪反复吹打几次，溶解核糖核酸(RNA)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的含有指示剂的酚胍盐裂解液中的各组分为:异巯氰酸K90~110克 异硫氰酸鑛3O~40 3?苯酚400-550毫升甘汕50-70毫升 无水KS酸纳8~ IO克指示剂10~20毫克 上述组分按量称重后，用冰醋酸调PH值至4-5，定容至1000毫升，所述的指示剂为中性红、甲基红中的任何一种。
【文档编号】C12N15/10GK103952399SQ201410158138
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】崔黎, 俞萍, 李晓晨, 孙克非 申请人:天根生化科技（北京）有限公司