鸭源多种致病菌的多重pcr检测引物组及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物检测【技术领域】，具体公开了鸭源多种致病菌的多重PCR检测引物组及其试剂盒。所述引物组包含4对引物：RArpoB-P1和RArpoB-P2；E.coliphoA-P1和E.coliphoA-P2；SalminvA-P1和SalminvA-P2；和Strep16srRNA-P1和Strep16srRNA-P2。用上述四对引物进行多重PCR扩增，能同时快速、方便、特异、灵敏地检测鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和链球菌四种细菌，可用于细菌鉴定、疾病诊断和流行病学调查，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。
【专利说明】鸭源多种致病菌的多重PCR检测引物组及其试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测【技术领域】，具体涉及鸭源多种致病菌的多重PCR检测引物组及其试剂盒。
【背景技术】
[0002]鸭疫里氏杆菌{RiemerellaAnatipestifer，RA)是雏鸭、雏火鸡以及雏鹅等多种禽类感染发病的致病菌，对I~8周龄的鸭危害最大，临床上呈急性或慢性败血症，病变以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎为主，部分病例出现干酪性输卵管炎、结膜炎、关节炎等特征，俗称鸭传染性浆膜炎。
[0003]鸭大肠杆菌病是致病性大肠杆菌coli, E.coli)感染所引起，由于感染鸭的年龄、抵抗力以及大肠杆菌的致病力、感染途径的不同，可以产生许多不同的病理变化和临床症状。在雏鸭以引起大肠杆菌肝炎和脑炎为特征，在产蛋鸭以发生大肠杆菌性生殖器官病为特性。大肠杆菌是一种条件性致病菌，当各种应激刺激造成鸭的免疫功能降低时，就会发生感染。因此，在临床上常常成为鸭疫里氏杆菌病的并发症。
[0004]鸭链球菌病是由链球菌(SirepiococciAs，Strep)引起的鸭的急性或慢性传染病，雏鸭感染主要表现为急性死亡，一旦发病，可引起大量死亡。成年鸭和种鸭感染主要表现为跛行与瘫痪，死亡率较低，对生产性能的影响较大，造成较大的经济损失。
[0005]鸭沙门氏菌病是由鼠伤寒沙门氏菌、鸭沙门氏菌和肠炎沙门氏菌等引起的疾病的总称。各种日龄的鸭都能感染，主要发生在雏鸭，可造成大批死亡。这一类细菌可引起人的食物中毒，在公共卫生上有重要意义。
[0006]鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌Salm)是造成鸭纤维性心包炎、浆膜炎及肝周炎的主要致病菌，给世界各国养禽业带来严重危害。同时，鸭疫里氏杆菌与链球菌混合感染也较为常见。主要表现为浆膜炎，容易导致误诊，若仅按浆膜炎治疗，虽症状会减轻，死亡率有所下降，但停药后又复发。
[0007]以上4种细菌性传染病都易发生于雏鸭，且容易混合感染，均可引起浆膜炎，其临床症状和剖检病变相似，难以区分。目前对这些致病菌的检验仍主要沿用传统的细菌培养、生化鉴定的方法以及针对单个病原建立的PCR检测方法等。细菌的分离与鉴定是诊断的金标准，但这种方法检测周期长、操作繁琐，灵敏度低且不能大批量检测。
[0008]覃宗华等研究的“鸭疫里默氏菌病和大肠杆菌病鉴别诊断双重PCR方法的建立和应用”公开了一种能快速准确鉴别诊断鸭疫里默氏菌和大肠杆菌病的双重PCR方法，但该方法也仅能同时检测2种鸭子的细菌病，为了节约成本，提高检测效率，寻求一种同时检测多种细菌病的方法是必要的。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中鸭源致病菌检测技术的不足，提供一组用于鸭源多种致病菌的检测引物组，所述致病菌包括鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、链球菌及沙门氏菌。
[0010]本发明的另一个目的是提供含有上述检测引物组的试剂盒。
[0011]本发明的另一个目的是提供上述检测试剂盒在检测鸭疫多种致病菌中的应用。
[0012]本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的:
本发明提供了一种用于检测4种鸭源致病菌的多重PCR检测引物组，所述引物组包含
4对引物:RA rpoB-Pl 和 RA rpoB-P2 ;Ε.coli phoA-Pl 和 E.coli phoA_P2 ；Salm invA-Pl和 Salm invA-P2 ；Strep 16srRNA_Pl 和 Str印 16srRNA_P2 ;引物序列如 SEQ ID NO:1 ~8所示；所述4种鸭源致病菌为鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌和链球菌。
[0013]其中所述RA rpoB-Pl的核酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述RA rpoB_P2的核酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述E.coli phoA-Pl的核酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述E.coliphoA-P2的核酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述Str印16srRNA_Pl的核酸序列如SEQ ID NO:5所不，所述Strep 16SrRNA_P2的核酸序列如SEQ ID NO:6所不,所述Salm invA-Pl的核酸序列如SEQ I D NO:7所示，所述Salm invA-P2的核酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0014]本发明利用 申请人:测定并提交到GenBank上鸭疫里氏杆菌不同血清型基因的序列(GenBank accession numbers),与在GenBank上发表的其他细菌如大肠杆菌、链球菌、沙门氏菌等的基因进行比对，选择序列差异大的区域设计引物，用于鸭疫里氏杆菌的检测。
[0015]本发明选择大肠杆菌的持家基因基因作为靶基因，用于鸭大肠杆菌的检测。对已发表的不同细菌的/AM基因序列比对重新设计引物。
[0016]本发明选择链球菌的16SrRNA基因作为靶基因，16SrRNA素有“细菌化石”之称，该基因序列几乎可以对所有的细菌进行种属水平上的鉴定，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。本发明对已发表链球菌的16SrRNA基因序列进行比对重新设计引物。
[0017]本发明选择沙门氏菌基因作为靶基因，用于鸭沙门氏菌的检测。对已发表沙门氏菌基因序列进行比对重新设计引物。
[0018]本发明还提供了一种用于检测4种鸭源致病菌的多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒含有上述引物组，所述4种鸭源致病菌为鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌和链球菌。
[0019]优选地，所述多重PCR检测试剂盒中各引物对的上游引物和下游引物的浓度分别为10 μ Μ，所述试剂盒还含有10XPCR反应缓冲液、DNA聚合酶和dNTP。所述10XPCR反应缓冲液含有IOOmM Tris-HCl (pH8.3)，500mM KCl和15mM MgCl2 ;所述DNA聚合酶浓度为5units/ μ L、dNTP 浓度为 2.5mM。
[0020]优选地，所述多重PCR检测试剂盒的多重PCR反应体系为:10XPCR反应缓冲液
5μ L、DNA 聚合酶 0.3 μ L、dNTP 4 μ L、rpoB-Pl 0.5 μ L、rpoB-P2 0.5 μ L、phoA-Pl
0.5 μ L,phoA-P2 0.5 μ L、16SrRNA_Pl 0.5 μ L、16SrRNA_P2 0.5 μ L.1nvA-Pl 0.5 μ L、invA-P2 0.5 μ L，DNA模板I μ L，用无菌的超纯水补齐到25 μ L。
[0021]优选地，所述多重PCR检测试剂盒的多重PCR的反应条件为:95°C预变性5min，94°C 35s, 56°C 35s，72°C 45s 共运行 35 个循环，最后 72°C延伸 lOmin。
[0022]本发明还提供了上述多重PCR检测试剂盒在检测鸭疫致病菌中的应用。
[0023]本发明还提供了上述多重PCR检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤:
S1.提取待测样品DNA;52.利用上述试剂盒进行多重PCR；
53.将PCR后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，进行结果判定，所述结果判定为:若出现139bp，256bp，327bp，和482bp条带，则表明样本含鸭疫里氏杆菌和大肠杆菌和链球菌和沙门氏菌；若出现139bp，256bp和327bp，则表明样本含鸭疫里氏杆菌和大肠杆菌和链球菌；若出现139bp，256bp和482bp条带，则表明样本含鸭疫里氏杆菌和大肠杆菌和沙门氏菌；若出现256bp，327bp和482bp条带，则表明样本含大肠杆菌和链球菌和沙门氏菌；若出现139bp，327bp和482bp条带，则表明样本含鸭疫里氏杆菌和链球菌和沙门氏菌；若出现139bp和256bp条带，则表明样本含鸭疫里氏杆菌和大肠杆菌；若出现139bp，327bp条带，则表明样本含鸭疫里氏杆菌和链球菌；若出现139bp和482bp条带，则表明样本含鸭疫里氏杆菌和沙门氏菌；若出现256bp和327bp条带，则表明样本含和大肠杆菌和链球菌；若出现256bp和482bp条带，则表明样本大肠杆和沙门氏菌；若出现327bp和482bp条带，则表明样本含链球菌和沙门氏菌；若出现139bp条带，则表明样本含鸭疫里氏杆菌；若出现256bp条带，贝1J表明样本含大肠杆菌；若出现327bp条带，则表明样本含链球菌；若出现482bp条带，则表明样本含沙门氏菌。 [0024]与现有技术相比，本发明的有益效果:
本发明提供了一种多重PCR检测引物组及含有所述引物组的多重PCR检测试剂盒，所述引物组或试剂盒用于检测鸭源多种致病菌，不仅大大缩短检测时间，还能批量对样品进行检测，即能同时快速、方便、特异、灵敏地检测鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和链球菌四种细菌。
[0025]本发明还提供了上述引物组或试剂盒在检测鸭疫致病菌中的应用。所述引物组或试剂盒快速、简便、反应灵敏，可用于细菌鉴定、疾病诊断和流行病学调查，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1多重PCR特异性检测；M =Takara DL500 marker ;泳道a:鸭疫里氏杆菌；泳道b:大肠杆菌；泳道c:链球菌；泳道d:沙门氏菌；泳道e:鸭疫里氏杆菌+大肠杆菌；泳道f:鸭疫里氏杆菌+链球菌；泳道g:鸭疫里氏杆菌+沙门氏菌；泳道h:大肠杆菌+链球菌；泳道1:大肠杆菌+沙门氏菌；泳道j:链球菌+沙门氏菌；泳道k:鸭疫里氏杆菌+大肠杆菌+链球菌；泳道1:大肠杆菌+链球菌+沙门氏菌；泳道m:鸭疫里氏杆菌+大肠杆菌+沙门氏菌；泳道η:鸭疫里氏杆菌+链球菌+沙门氏菌；泳道ο:鸭疫里氏杆菌+大肠杆菌+链球菌+沙门氏菌；泳道P:阴性对照(去离子水);
图2多重PCR灵敏性检测；M =Takara DL500 marker ;泳道a:4X IO4拷贝；泳道b:4X103拷贝j}dtC:4X102拷贝AIdtdMXlO1拷贝；泳道6:阴性对照(去离子水)；
图3鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、链球菌和沙门氏菌实验室感染临床样品检测；泳道M:Takara DL2000marker ;泳道a:鸭疫里氏杆菌(血清型I型)感染鸭的肝组织；泳道b:鸭疫里氏杆菌(血清型I型)感染鸭的脑组织；泳道c:大肠杆ATCC8099株感染鸭的肝组织；泳道d:大肠杆菌ATCC8099株感染鸭的脑组织；泳道e:链球菌CVCC556株感染鸭的肝组织；泳道f:链球菌CVCC556株感染鸭的脑组织；泳道g:鼠伤寒沙门氏菌感染鸭的肝组织；泳道h:鼠伤寒沙门氏菌感染鸭的脑组织；泳道1:鸭疫里氏杆菌+大肠杆菌+链球菌+沙门氏菌；泳道j:阴性对照(去离子水)。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。
[0028]实施例1引物设计及引物特异性检测
本实施例利用 申请人:测定并提交到GenBank上鸭疫里氏杆菌不同血清型基因的序列(GenBank accession numbers),与在GenBank上发表的其他细菌如大肠杆菌、链球菌、沙门氏菌等的基因进行比对，选择序列差异大的区域设计引物，用于鸭疫里氏杆菌的检测，所述引物对为 RA rpoB-Pl (SEQ ID NO:1)和 RArpoB_P2 (SEQ ID NO:2)。
[0029]本实施例选择大肠杆菌的持家基因基因作为靶基因，用于鸭大肠杆菌的检测。对已发表的不同细菌的/AM基因序列比对重新设计引物，所述引物对为E.coliphoA-Pl (SEQ ID NO:3)和 E.coli phoA_P2 (SEQ ID NO:4)。
[0030]本实施例选择链球菌的16SrRNA基因作为靶基因，对已发表链球菌的16SrRNA基因序列重新设计引物，所述引物对为Str印16srRNA-Pl(SEQ ID NO:5)和Str印16srRNA_P2(SEQ ID NO:6)。
[0031]本实施例选择沙门氏菌基因作为靶基因，用于鸭沙门氏菌的检测。对已发表沙门氏菌基因序列重新设计引物，所述引物对为Salm invA-Pl (SEQ ID NO:7)和Salm invA-P2 (SEQ ID NO:8)。
[0032]上述4对引物序列如下:
SEQ ID NO:1:5’ -TGCCCAAGCGAATGTGGAGC-3’ ；
SEQ ID NO:2:5’ -ACCGGAAATCTGGTTTGGCG-3’ ；
SEQ ID NO:3:5’ -CGATAAGCCCGCAGTCACCT-3’ ；
SEQ ID NO:4:5’ -GACCAGCGTGTTACCCTCCT-3’ ；
SEQ ID NO:5:5’ -TACCAGAAAGGGACGGCTAA-3’ ；
SEQ ID NO:6:5’ -CGTTTACGGCGGCGTGGACTACC-3’ ；
SEQ ID NO:7:5’ -TGGGTAACGCATGAAGAGGG-3’ ；
SEQ ID NO:8:5’ -GGGTCAAGGCTGAGGAAGGT-3’。
[0033]根据所设计的4对特异性PCR引物对26株常见致病菌进行PCR检测阴性、阳性结果，其中10株鸭疫里氏杆菌均检测到rpoB基因，所有非鸭疫里氏杆菌均未见上述特异性扩增带；5株大肠杆菌均检测到PhoA基因，所有非大肠杆菌均未见上述特异性扩增带；2株链球菌均检测到16SrRNA基因，所有非链球菌均未见上述特异性扩增带；5株沙门氏菌均检测到invA基因，所有非沙门氏菌未见上述特异性扩增带。即表明4对引物具有较好的特异性。
[0034]实施例2鸭源多种致病菌多重PCR检测试剂盒的建立 按下列组成配制鸭源致病菌多重PCR检测试剂盒:
含有 10 XPCR 反应缓冲液(IOOmM Tris-HCl (pH8.3), 500mM KCl, 15mM MgCl2)、DNA 聚合酶(5units/y L)、dNTP (2.5mM)、4 对引物(IOuM)的序列如下:SEQ ID NO:1:5’ -TGCCCAAGCGAATGTGGAGC-3’ ；
SEQ ID NO:2:5’ -ACCGGAAATCTGGTTTGGCG-3’ ；
SEQ ID NO:3:5’ -CGATAAGCCCGCAGTCACCT-3’ ；
SEQ ID NO:4:5’ -GACCAGCGTGTTACCCTCCT-3’ ；
SEQ ID NO:5:5’ -TACCAGAAAGGGACGGCTAA-3’ ；
SEQ ID NO:6:5’ -CGTTTACGGCGGCGTGGACTACC-3’ ；
SEQ ID NO:7:5’ -TGGGTAACGCATGAAGAGGG-3’ ；
SEQ ID NO:8:5’ -GGGTCAAGGCTGAGGAAGGT-3’。
[0035]本发明对上述条件进行了优化，最终确定该试剂盒的反应体系为=IOXPCR反应缓冲液 5 μ L、DNA 聚合酶 0.3 μ L、dNTP 4 μ L、rpoB-Pl 0.5 μ L、rpoB-P2 0.5 μ L、phoA-Pl 0.5 μ L, phoA-P2 0.5 μ L、16SrRNA_Pl 0.5 μ L、16SrRNA_P2 0.5 μ L、invA-Pl
0.5 μ L、invA-P2 0.5 μ L，DNA模板I μ L，用无菌的超纯水补齐到25 μ L。
[0036]上述DNA模板由大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌和鸭疫里氏杆菌这4种细菌的DNA组成，上述细菌DNA的提取过程为:挑取单个大肠杆菌和沙门氏菌菌落分别于3mL LB肉汤培养基中于37°C 200 rpm摇床内培养过夜；挑取单个链球菌和鸭疫里氏杆菌菌落分别于3mL加5%血清的TSB培养基中37°C 200 rpm摇床内培养过夜。所得上述4种细菌的菌液于12000 rpm离心5min,弃上清,用200 μ L I X TE溶液重悬后，煮沸10 min,冰浴5 min,12000 rpm离心5min,取上清，_20°C保存。
[0037]上述多重PCR的反应条件为:95°C预变性5 min，在94°C 35 s，56°C 35 s，72°C45 s共运行35个循环，最后72°C延伸10 min。
[0038]上述多重PCR扩增产物的鉴定:取5 μ L PCR产物与6 X loading Buffer混合后加到2.5%的琼脂糖凝胶中，电泳条件为120V, 30min ;以Takara DL 500 marker为标准参照，在紫外成像仪下观察检测结果。检测表明鸭疫里氏杆菌rpoB、大肠杆菌phoA、链球菌16SrRNA和沙门氏菌invA这4种靶基因的长度分别为139bp，256bp，327bp，482bp。
[0039]实施例3所述多重PCR检测试剂盒的特异性
分别配制107 cfu/mL鸭疫里氏杆菌(血清型I型)、大肠杆菌(ATCC8099)、链球菌(CVCC556)、鼠伤寒沙门氏菌、禽巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和支原体等18株菌，用水煮法提取18株菌的DNA模板。将鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、链球菌和沙门氏菌4株菌提取的单一菌株DNA、两两混合菌株DNA、三三混合菌株DNA和四株混合菌株DNA为模板，禽巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和支原体4株菌提取的单一菌株DNA为模板，在实施例2所述优化的PCR条件下进行PCR反应，以确定多重PCR反应的特异性。对PCR反应产物进行电泳后观察，结果如图1所示，图1结果表明除了本发明所述鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、链球菌和沙门氏菌之外，其他细菌条带均未检出，说明本发明可以特异性地检测出鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、链球菌和沙门氏菌。
[0040]实施例4所述多重PCR检测试剂盒的灵敏性
将单个PCR产物使用PMD18-T Vector试剂盒进行胶回收，胶回收产物与18-T载体16°C连接过夜，然后使用DH5a感受态细胞进行转化，200 rpm 37°C下培养I h，吸取100μ L涂在SOC培养基上过夜。挑取白色菌落于5mL LB肉汤培养过夜，使用omega试剂盒提取质粒进行测序，并检测质粒浓度。通过公式进行质粒拷贝数的估算，统一每种质粒的拷贝数，并配制四个菌的混合模板。所得到的混合模板用ddH20进行10倍稀释。在PCR反应中分别加入I μ L混合模板，使每个稀释度下的每种质粒模板终浓度为4Χ IO4拷贝、4Χ IO3拷贝、4Χ IO2拷贝、4Χ IO1拷贝。以实施例2所述优化的PCR条件进行扩增，从而确定多重PCR的敏感性，结果如图2所示，图2结果为鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌均为4Χ IO2拷贝，链球菌为4X IO3拷贝。
[0041 ] 实施例5所述多重P CR检测试剂盒对实验室样品的检测
运用实施例2建立的多重PCR检测试剂盒对实验室保存的80株鸭疫里氏杆菌、96株大肠杆菌、12株链球菌和142株沙门氏菌临床分离株进行了检测。
[0042](I)细菌DNA模板制备
将鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、链球菌和沙门氏菌的单个菌落分别接种到TSB+5%血清或LB液体培养基，37°C摇菌。大肠杆菌和沙门氏菌摇菌4 h，鸭疫里氏杆菌和链球菌摇菌8 h。各取3mL菌液于EP管中用水煮法提取DNA，-20°C保存。并设已知的鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、链球菌和沙门氏菌4种菌混合菌液用水煮法提取DNA，作为阳性对照；另外以去离子水代替DNA模板作为阴性对照。
[0043](2) PCR反应体系
采用优化后的多重PCR体系进行检测:10XBuffer 5 μ L、DNA聚合酶0.3 μ L、dNTP4 μ L、rpoB_Pl 0.5 μ L、rpoB_P2 0.5 μ L、phoA-Pl 0.5 μ L、phoA_P2 0.5 μ L>16SrRNA-Pl 0.5 μ L、16SrRNA -P2 0.5 μ L、invA -Pl 0.5 μ L、invA -P2 0.5 μ L, DNA 模板 Iμ L，用无菌的超纯水补齐到25 μ L0
[0044](3)多重PCR 反应条件:95°C预变性 5 min，在 94°C 35 s，56°C 35 s,72°C 45 s 共运行35个循环，最后72°C延伸10 min。
[0045](4)多重PCR检测结果:检测结果显示鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、链球菌和沙门氏菌4种细菌的阳性位置出现了对应的条带，即呈现特异性的反应。即表明本发明对上述4种细菌的临床分离株都可进行特异性检测。
[0046]实施例6所述多重PCR检测试剂盒对临床样品的检测
8份样品来自实验室分别感染了鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、链球菌或沙门氏菌的鸭的脑组织和肝脏组织。24份病死鸭的肝脏、脑组织均来自发病鸭场收集到的，且怀疑是细菌感染的病死鸭。
[0047](I) DNA模板的制备
无菌操作用接种环挑取少量鸭的肝脏、脑组织，接种于TSB+5%血清液体培养基中，37°C摇菌培养过夜。取3mL菌液于EP管中用水煮法提取DNA，-20°C保存。并设已知的鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、链球菌和沙门氏菌4种菌混合菌液用水煮法提取DNA，作为阳性对照；另外以去离子水代替DNA模板作为阴性对照。
[0048](2) PCR反应体系
采用优化后的多重PCR体系进行检测=IOXBuffer 5 μ L、DNA聚合酶0.3 μ L,dNTP 4μ L> rpoB-Pl 0.5 μ L> rpoB~P2 0.5 μ L、phoA-Pl 0.5 μ L> pho A-P2 0.5 μ L>16SrRNA-P10.5 μ LU6SrRNA -P2 0.5 μ L.1nvA -Pl 0.5 μ L.1nvA -P2 0.5 yL，DNA模板 I μ L，用无菌的超纯水补齐到25 UL0
[0049](3)多重PCR 反应条件:95°C预变性 5 min，在 94°C 35 s，56°C 35 s,72°C 45 s 共运行35个循环，最后72°C延伸10 min。
[0050] (4)多重PCR检测结果
用实施例2所述试剂盒进行多重PCR检测后结果见图3，8份来自实验室分别感染鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、链球菌或沙门氏菌鸭的肝和脑组织样品，用多重PCR检测全部为阳性。在24只鸭子(检测肝和脑组织)，有2只鸭子同时检测出鸭疫里氏杆菌和大肠杆菌，有3只鸭子同时检测出大肠杆菌和链球菌，有2只鸭子只检测出鸭疫里氏杆菌，有4只鸭子检测出大肠杆菌，有11只鸭子只检测出链球菌，有2只鸭子只检测出沙门氏菌。细菌分离和鉴定的结果 也证实了多重PCR结果的正确性。
【权利要求】
1.一种用于检测4种鸭源致病菌的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述引物组包含4 对引物:RA rpoB-Pl 和 RA rpoB-P2 ;Ε.coli phoA-Pl 和 E.coli phoA_P2 ；Salm invA-Pl和 Salm invA-P2 ；Strep 16srRNA_Pl 和 Str印 16srRNA_P2 ;引物序列如 SEQ ID NO:1 ~8所示；所述4种鸭源致病菌为鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌和链球菌。
2.一种用于检测4种鸭源致病菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述引物组，所述4种鸭源致病菌为鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌和链球菌。
3.根据权利要求2所述多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各引物对的上游引物和下游引物的浓度分别为?ο μ Μ，所述试剂盒还含有10 XPCR反应缓冲液、DNA聚合酶和dNTP。
4.根据权利要求2所述多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的多重PCR反应体系为:10 X PCR 反应缓冲液 5 yL、DNA 聚合酶 0.3 μ L.dNTP 4 μ L、rpoB_Pl 0.5 μ L、rpoB-P2 0.5 μ L.phoA-Pl 0.5 μ L, phoA-P2 0.5 μ L、16SrRNA_Pl 0.5 μ L、16SrRNA_P20.5 μ L、invA-Pl 0.5 μ L、invA_P2 0.5 μ L, DNA 模板 I μ L，用无菌的超纯水补齐到25 μ L0
5.根据权利要求2所述多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的多重PCR的反应条件为:951:预变性51^11，941: 35s, 56°C 35s，72°C 45s共运行35个循环，最后72°C延伸IOmin0
6.权利要求2至5任一项所述多重PCR检测试剂盒在检测鸭疫致病菌中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103937892SQ201410161746
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月21日 优先权日:2014年4月21日
【发明者】曾振灵, 仇珍珍, 蒋红霞, 瞿颖, 李亚菲, 曹长福 申请人:华南农业大学