黄瓜叶色突变基因v-1的SSR标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明黄瓜叶色突变基因v-1的SSR标记及其应用，涉及植物育种辅助技术。一种与黄瓜叶色突变基因v-1紧密连锁的SSR标记，其引物的核苷酸序列如下：SSR8v-1-F/SSR8v-1-R：GGCAATGGTAAAGGTTGGAA/AAGGGATGTGTGGTGTGGTT；所述引物扩增的与叶色突变基因v-1连锁的SSR标记特征条带为194bp，核苷酸序列如Seq?ID?No.1所示；所述引物扩增的与叶片绿色基因V-1连锁的SSR标记特征条带为206bp，核苷酸序列如和Seq?ID?No.2所示。采用本发明获得的SSR标记，可以在任何阶段对植物材料进行叶色突变基因v-1的筛选，具有高效、限制少、准确的优点，提高了选育植物高光效黄色叶片材料的选择效率和准确性，也为利用与叶色控制基因共分离的SSR标记辅助选育高光效育种材料提供了简单、便捷、高效的途径。
【专利说明】黄瓜叶色突变基因v-1的SSR标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术辅助育种领域，特别是黄瓜叶色突变基因V-1的SSR标记及其在植物育种材料选择中的应用。
【背景技术】
[0002]黄瓜(Cucumis sativus L.)是一年生攀缘性草本植物，我国是世界上黄瓜栽培面积最广、总产量最高的国家。叶色突变体是开展光合系统结构与功能及其调控机制研究的理想材料，也是遗传和育种研究中具有重要价值的基础材料。目前，黄瓜叶色突变性状的研究仅局限于黄瓜叶色突变体的发生、分类、遗传规律等方面，突变体的转色机理仍不明确。
[0003]叶片颜色直接关系到植物的光合作用效率，与农作物产量密切相关，因此倍受育种家和遗传学家的重视。近年研究表明叶色突变体 是开展植物高光效育种的理想材料。拟南芥中的 GLUl 基因(Karen et al.，1998)、水稻中的 YGLl (Wu et al.，2007)、DETl 基因(黄俊丽等，2010)以及烟草中的常绿突变体(Jordiet al.,2000))都为利用叶色突变体开展高光效育种奠定了基础。此外，由于叶色突变体容易识别，育种家也会将这种突变性状转育到杂交种亲本中，以此为标记性状进行农作物品种和杂种一代纯度鉴定，可节约成本和时间(Mochizuki et al., 2001 ;何冰等，2006)。
[0004]黄瓜从20世纪70年代起就有黄绿叶、芽黄、斑驳芽黄、黄色叶等多种类型的叶色突变体被报道，这些突变体主要包括:vvi> yp (ffehner, 2005)、gc (Whelan et al., 1971)、Is、cd(Whelan et al., 1972)、yc_l、yc_2、p1、albin(Whelan et al., 1973)、v(Lawrenceet al.，1990)、ygl (王家训等，2000)、v-1 (国艳梅等，2003)。但与拟南芥和水稻等植物相t匕，黄瓜叶色突变体的研究则落后许多，研究主要是围绕突变体的发生、分类、遗传规律等方面。近年来才相继有与叶色突变性状连锁的标记被报道。王全等(2010)筛选到I对AFLP显性标记，该标记可在绿叶材料中扩增出大约200bpl条特异条带。王惠哲等(2012)也找到一对与黄瓜子叶颜色相关基因的连锁的AFLP标记遗传距离为3.2cM。本课题组围绕叶色突变体v-Ι开展了一系列的研究工作。将叶色突变基因v-Ι定位在第6染色体上，并获得与其连锁的SSR和CAPS标记(Miao et al.，2011 ;苗晗，2011)。还分析了该叶色突变基因与其它主要性状基因的连锁关系(顾兴芳等，2005);对该突变体光合色素变化及相关基因进行差异表达研究，并对不同黄瓜黄绿叶突变体进行了比较分析(苗晗等，2010a ;苗晗等，2010b)。
[0005]但是上述研究工作仍未实现对黄瓜叶色控制基因的克隆。获得的AFLP标记由于是随机性标记，无法将叶色基因定位在染色体上；而共显性的SSR和CAPS标记虽然与叶色基因连锁较为紧密且遗传距离较近，但是在染色体上的实际物理位置仍然较远，而且未验证这些标记用于不同遗传背景材料分子标记辅助选择的准确性，因此在黄瓜分子标记辅助育种中的实质应用有限，有待开发出与叶色基因遗传距离更近，且确实有实质应用价值的分子标记。
【发明内容】
[0006]本发明基于上述领域的空白，提供了与叶色突变基因v-Ι紧密连锁的SSR标记，并提供了其在选择植物叶片颜色种质资源上的应用。
[0007]本发明的技术方案如下:
[0008]一种与黄瓜叶色突变基因v-Ι紧密连锁的SSR标记，其引物的核苷酸序列如下:
[0009]SSR8V_1-F/SSR8V_1-R:GGCAATGGTAAAGGTTGGAA/AAGGGATGTGTGGTGTGGTT ；
[0010]所述引物扩增的与叶色突变基因v-1连锁的SSR标记特征条带为194bp，核苷酸序列如Seq ID N0.1所示；
[0011]所述引物扩增的与叶片绿色基因V-1连锁的SSR标记特征条带为206bp，核苷酸序列如和Seq ID N0.2所示 。
[0012]上述SSR标记在筛选具有叶色突变基因v-Ι的黄瓜种质资源中的应用，其步骤如下:
[0013](I)采用所述SSR标记的引物对待选黄瓜品种的基因组DNA分别进行PCR扩增；
[0014](2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；
[0015](3)从检测结果中选出与叶色突变基因v-Ι连锁的SSR标记特征条带一致的材料。所述PCR扩增的反应体系为:3yL DNA (2.5ng.μ L-1)，正向和反向引物(50ng.μ L-1)各
Iμ L, 5 μ L Go Taq? Green Master Mix,加双蒸水至 IOul。
[0016]所述PCR扩增的程序为:94°C预变性4min ;94°C变性15s ;55°C退火15s ;72°C延伸30s ；35个循环；72°C保温5min ;4°C保存。
[0017]所述凝胶电泳检测指采用8.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于160V恒功率电泳分离，最后银染显色。
[0018]本发明，在黄瓜全基因组及重测序序列的基础上，以现有已知品种含叶色黄化基因v-Ι的黄瓜材料WlOGt(P1)为母本，以不含叶色黄化基v-1，基因型为V-1V-1的黄瓜材料9930 (P2)为父本构建F1J2群体，利用SSR技术和连锁分析方法获得与v-Ι基因共分离的标记SSR8V S并确定该标记的染色体位置，即位于黄瓜6号染色体上物理位置10094363~10094568处。所述SSR标记的引物扩增的与黄瓜叶色突变基因v_l连锁的特征条带为194bp，核苷酸序列如Seq ID N0.1所示；所述SSR标记引物扩增的与黄瓜叶色突变基因V_1连锁的特征条带为206bp，核苷酸序列如和Seq ID N0.2所示。
[0019]本发明运用所述SSR标记在440株F2群体以及43份具有不同遗传背景的自然群体中进行验证，证明该标记在这些材料上用于分子标记辅助选择的准确性高达100%。
[0020]本发明不仅为叶色控制基因的精确定位和分子克隆奠定了良好的基础，为开展黄瓜高光效生理及品种选育提供理论依据，同时也为利用与黄瓜叶色控制基因共分离的SSR标记辅助选育高光效育种材料提供了简单、便捷、高效的途径，提高了选育黄瓜高光效黄色叶片材料的选择效率和准确性。本发明基于选出SSR标记引物提供用于辅助筛选含有叶色黄化基因v-Ι的黄瓜新品种的方法，该方法中，采用SSRSrt标记引物扩增待测品种的DNA，然后对扩增产物进行电泳检测，扩增产物可能出现三种情况:第一种是仅仅出现一条194bp条带，这种为含叶色黄化基因v-Ι的隐型纯合材料；另一种是194bp条带和206bp条带都出现，这种是含叶色黄化基因v-Ι的隐型杂合材料，第三种是仅仅出现206bp条带，这种是不含叶色黄化基因v-Ι的显性纯和材料。选出第一种条带对应的材料，去掉第二种和第三种情况对应的材料。通过本发明提供的方法，可以在任何阶段对含有叶色突变基因v-1的黄瓜材料进行筛选和剔除，具有高效、限制少、准确的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是标记SSR8V—1对黄瓜亲本材料WlOGtdgSOJ1世代单株及F2群体部分单株的检测结果；其中=P1:91 IOGt (叶片黄色)；?2:9930(叶片绿色)。
[0022]图2是标记SSRSrt对黄瓜亲本材料43份不同遗传背景材料的检测结果；其中:P1:91 IOGt (叶片黄色)；P2:9930(叶片绿色)。
【具体实施方式】
[0023]生物材料的来源和记载出处
[0024]供试黄瓜材料WlOGt(P1)，雌性系，苗期叶色黄化，含叶色黄化基因v-1，基因型为V-1v-10为现有已知品种，国艳梅等在《园艺学报》2003年第30卷4期发表的文章《黄瓜叶色突变体遗传机制的研究》中也有记载，本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
[0025]9930 (P2)，典型的华北保护地类型黄瓜，普通花性，苗期叶色为绿色，不含叶色黄化基v-Ι,基因型为V-1V-1,该材料已 完成全基因组测序。在Huang等在《Nature Genetics))2009 年第 41 期发表的文章《The genome of the cucumber, Cucumissativus L.》中也有记载，本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。以9110Gt为母本,9930为父本杂交,通过单粒传(single-seed descent, SSD)的方法获得F9代RIL群体。
[0026]SSR引物根据国际葫芦科基因组数据库(www.1cug1.0rg)中的黄瓜全基因组及重测序序列设计开发。PCR实验使用Promega公司的GoTaq Green Master Mix ;凝胶电泳使用盈信阳光公司的40%非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至8%后使用。
[0027]实施例1.与黄瓜叶色突变基因v-Ι共分离SSR标记的获得
[0028]步骤1.黄瓜叶色突变基因v-Ι共分离标记获得
[0029](I) DNA 提取:
[0030]取黄瓜植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本及RIL群体各单株的基因组DNA。
[0031](2) SSR 标记分析:
[0032]1)PCR反应体系为:总反应体系IOyL, 3μ L DNA (2.5ng.μ L_l)，正向和反向弓丨物(50ng.μ L-1)各 I μ L, 5 μ L Go Taqd1 Green Master Mix (Promega 公司产品)。在叶色基因v-1定位基础上,根据国际葫芦科基因组数据库(www.1cug1.0rg)中的黄瓜全连锁的分子标记。
[0033]2) PCR扩增程序为:PCR扩增的程序为:94°C预变性4min ;94°C变性15s ;55°C退火15s ;72°C延伸 30s ；35 个循环；72°C保温 5min ；4°C forever?
[0034]3)扩增产物用8.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5 X TBE, 160V恒功率电泳分离1.5h，电泳后银染显色，统计带型。
[0035](3)数据统计及连锁分析方法:
[0036]根据JoinMap4.0软件的数据格式要求，将与母本(9110Gt) —致的带型记为b，与父本(9930) —致的带型记为a，杂合的带型记为h。未扩增出的或模糊不清的记为U。连锁图构建:先筛选在父母本间表现多态的SSR标记；然后获得的多态性引物分析RIL群体各单株基因型；最后利用JoinMap4.0软件进行连锁图的绘制，LOD阈值5.0，获得与v_l基因共分尚的标记SSR8V \该标记位于黄瓜6号染色体上物理位置10094363~10094568处。
[0037]步骤2.PCR扩增所得差异片段的回收及测序
[0038](I)目的片段的回收
[0039]采用煮沸法。具体操作为:先从胶上将目标条带挖下来装入1.5mL的Eppendorf管内，向管内加入100 μ L超纯水，加水量视胶带颜色深浅而定；常温下浸泡24h，转入95°C水浴锅(或PCR仪)中煮30min后,5000rpm离心3min。产物即可取上清3 μ L做模板进行PCR扩增，剩余产物置_20°C保存备用。 [0040](2)目的片段的纯化
[0041]用PCR产物直接纯化方法。在PCR产物中加入2倍体积的无水乙醇，_20°C过夜放置，I, 2000rpm离心5min就可以得到纯化产物。
[0042](3)目的片段与载体的连接
[0043]反应体系为10 μ L:PMD18_T Vectorl.0 μ L ;Ligation buffer I 5.0μL;目的片段4.0 μ L。在超净工作台上加样，混匀反应物，暂短离心，16°c连接约lh，过夜也不影响连
接效率。
[0044](4)连接产物的转化
[0045]I)取出感受态细胞，SolutionA, SolutionB，置于冰上融化；
[0046]2)感受态(50 μ L) +5 μ L SolutionA+4 μ L SolutionB+46 μ L 预冷去离子水；
[0047]3)用冷却的无菌枪头将上述悬浮液分装到1.5mL离心管，每管加入105 μ L，再加入5 μ L的目的DNA，轻旋混匀；
[0048]4) 42°C水浴热激90s，注意不要晃动离心管；
[0049]5)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却3~5min ；
[0050]6)加入500 μ L LB液体培养基。在37°C，150rpm摇床上预培养Ih ；
[0051]7)将菌液涂布到含有 IOOyg* mL-lAmp、25 μ g.mL-lIPTG 和 40 μ g.mL-lX-GAL的LB固体培养基上，用一无菌的弯头玻棒轻轻的将菌液均匀涂开，置于室温直至液体被吸收；
[0052]8)倒置平板，37°C培养12~16h。
[0053](5)重组质粒的蓝白斑筛选
[0054]经37°C培养后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出现少量蓝色菌落和较多的白色菌落，其中白色菌落为重组克隆子。挑取白色单菌落涂抹在划好方格的LB液体培养基中，37°C,150rpm过夜培养。
[0055](6)菌落PCR的检测
[0056]吸取I μ L菌液作为模板进行PCR扩增。取4 μ L PCR产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，与PCR Marker标准分子量相比较检测插入片段的大小，与插入目的片段大小一致的克隆即为阳性克隆。
[0057](7)克隆后载体的测序与分析
[0058]取3个阳性克隆菌液在甘油(330 μ L甘油中加入1000 μ L菌液)中各保存两份，一份-20°C保藏，一份送去测序。
[0059]实施例1.v-Ι基因共分离标记的验证
[0060]用实施例1获得的与v-Ι基因共分离的SSR标记SSRSv-1在以9110GtX9930构建的440份F2群体以及43份不同遗传背景材料(表1)上进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性。验证采用实施例1中步骤(1)中的PCR扩增和检测方法。
[0061]表143份不同遗传背景材料
[0062]
【权利要求】
1.一种与黄瓜叶色突变基因V-1紧密连锁的SSR标记，其引物的核苷酸序列如下:
SSR8V_1-F/SSR8V_1-R:GGCAATGGTAAAGGTTGGAA/AAGGGATGTGTGGTGTGGTT ； 所述引物扩增的与叶色突变基因v-1连锁的SSR标记特征条带为194bp，核苷酸序列如Seq ID N0.1 所示； 所述引物扩增的与叶片绿色基因V-1连锁的SSR标记特征条带为206bp，核苷酸序列如Seq ID N0.2 所示。
2.权利要求1所述SSR标记在筛选具有叶色突变基因v-1的黄瓜种质资源中的应用，其步骤如下: (1)采用所述SSR标记的引物对待选黄瓜品种的基因组DNA分别进行PCR扩增； (2)对扩增结果进行凝胶电泳检测； (3)从检测结果中选出与叶色突变基因v-1连锁的SSR标记特征条带一致的材料。
3.根据权利要求2或3所述的应用，所述PCR扩增的反应体系为:3μLDNA (2.5ng.μ L-1)，正向和反向引物(50ng.μ L-1)各 I μ L, 5 μ L Go Taq? Green MasterMix，加双蒸水至10 μ L0
4.根据权利要求2或3所述的应用，所述PCR扩增的程序为:94°C预变性4min;94°C变性15s ;55°C退火15s ;72°C延伸30s ；35个循环；72°C保温5min ;4°C保存。
5.根据权利要求2~4任一所述的应用，所述凝胶电泳检测指采用8.0 %的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于160V恒功率电泳分离，最后银染显色。
【文档编号】C12N15/11GK103937788SQ201410168519
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】苗晗, 顾兴芳, 张圣平, 王烨 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所