自絮凝酵母发酵木糖渣酶解液制备乙醇的方法
【专利摘要】自絮凝酵母发酵木糖渣酶解液制备乙醇的方法属于生物化工【技术领域】，尤其涉及到一种新型的用于乙醇发酵的自絮凝酵母菌株以及利用该菌株发酵木糖渣酶解液生产乙醇的工艺路线。本发明以木糖生产过程中剩余的木糖渣作为纤维素原料，通过碱预处理酶解或直接酶解得到富含葡萄糖的酶解液，再利用从自然界中筛选得到的自絮凝酵母发酵酶解液制备乙醇。该酵母在发酵过程中可以自絮凝成毫米级颗粒，起到无载体固定化的效果，而且发酵后无需离心，通过自沉降即可分离菌体。与传统的纤维素乙醇生产工艺相比，本工艺能够有效简化生产环节，减少生产成本，缩短生产周期，具有极高的应用价值和工业化潜质。
【专利说明】自絮凝酵母发酵木糖渣酶解液制备乙醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化工【技术领域】，尤其涉及到一种新型的用于乙醇发酵的自絮凝酵母菌株以及利用该菌株发酵木糖渣酶解液生产乙醇的工艺路线。
【背景技术】
[0002]现代社会和工业发展对能源和资源的需求日益增加，开发可再生生物能源是维持社会可持续发展的必要条件。在新兴能源领域，燃料乙醇作为唯一可大规模替代车用运输燃料的生物能源，已成为世界各国竞相开展研究的热点。一代的燃料乙醇生产采用淀粉糖化发酵工艺。采用该工艺，每生产I吨淀粉，大约要消耗3吨谷物。中国是人口大国，以谷物作为原料进行乙醇生产势必会造成粮食资源短缺问题。因此，采用富含纤维素的生物质资源作为原料生产二代燃料乙醇技术正在悄然兴起。生物质资源除了纤维素外，还含有半纤维素和木质素等干扰纤维素水解的物质，需要将其去除才能被微生物利用。传统的生物质到乙醇的生产包括预处理，纤维素分离，酶解糖化，生物发酵等步骤。这些复杂的过程增加了纤维素乙醇的生产成本，使二代燃料乙醇的生产仍停留在研发阶段。
[0003]木糖渣是木糖生产过程中的副产物，而木糖通常是由生物质(玉米芯、甘蔗渣)中的半纤维素降解得到的。由于木糖生产中，90%以上半纤维素已经得到去除，因此木糖渣中的纤维素含量非常高(65%左右)，是理想的二代燃料乙醇的原料。目前，大规模应用于木糖生产的方法主要有酸水解法(ZL200480016169.0，ZL200710112975.3)和蒸汽爆破方法(ZL20131047000.3)。其中酸水解主要是用1.4-2.0 %的硫酸在0.11-0.15Mpa下水解90-150min ;蒸汽爆破则是先用0.1-0.2%的硫酸浸泡，再在0.4-1.8Mpa压力下进行瞬时喷爆。上述两种方法得到 的木糖渣在结构上有所差异，酸水解对于木质素和纤维素的交联结构破坏程度较低，因此酸水解后的木糖渣较难直接被纤维素酶水解，通常需要碱液处理后才能糖化(ZL200910090186.3，ZL201210332435.7);而蒸汽爆破对于木质素的破坏程度较高，同时压力差形成的剪切力能够增加纤维素的比表面积和表面孔隙率，使蒸汽爆破后的木糖渣能够直接被纤维素酶糖化。
[0004]目前用于燃料乙醇的发酵菌株集中在运动发酵单胞菌(ZL200880119451.X)以及酿酒酵母(201010111324.4)。然而上述菌株均为游离细胞，在连续发酵过程中易随发酵液流出，从而降低了发酵罐中的细胞浓度，延长了平均发酵时间。采用吸附、包埋或交联技术可以实现发酵菌株的固定化，从而解决游离细胞连续发酵的问题，但固定化材料的使用增加了乙醇发酵的成本，且操作复杂。自絮凝酵母是指在发酵过程中能够自发形成毫米级松散颗粒的特殊菌株，利用自絮凝酵母可以实现燃料乙醇的无载体固定化发酵，从而有效提高乙醇生产效率，同时降低菌体分离成本。目前报道过的自絮凝酵母均是以具有自絮凝能力的粟酒裂殖酵母和乙醇发酵性能优良的酿酒酵母通过常规酵母细胞原生质体融合技术得到的融合株(ZL01138778.5)。本课题组经过长期的研究，从自然界中筛选到了一株天然的发酵生产乙醇的自絮凝酵母，经过ISSrDNA序列信息比对该酵母与Lachanceafermentati 具有 100 % 的同源性，故将其命名为 Lachancea fermentati Y309 (GenBankAccession N0.KJ451620)。该菌株目前已经保藏在国家知识产权局指定的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，登记号8844，保藏时间为2014年2月24日，保藏地址为中国科学研究院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于能够提供一种具有自絮凝特征的乙醇发酵菌株，同时提供一种利用木糖渣酶解液发酵生产乙醇的方法。
[0006]一种发酵生产乙醇的自絮凝酵母,其拉丁文名为Lachancea fermentati Y309,保藏号为 CGMCC N0.8844。
[0007]一种利用木糖渣酶解液发酵生产乙醇的方法，包括以下步骤:
[0008](I)根据来源不同 本专利使用的木糖渣分为两种，其中木糖渣A为玉米芯酸解残渣，木糖渣B为玉米芯蒸汽爆破残渣。对于木糖渣A，需要先将木糖渣在碱性溶液中进行预处理，然后再将预处理后的木糖渣A进行酶解糖化；对于木糖渣B，则直接将其进行酶解糖化。
[0009](2)步骤I中所述的碱性溶液为亚硫酸钠和双氧水的混合溶液，其中亚硫酸钠的质量分数为1% _8%，双氧水的质量分数为0.5% -2.5%。向IL碱性溶液中加入150-200g的木糖渣A。预处理温度为80-150°C，预处理搅拌转速为100-300rpm，预处理时间为l_3h。
[0010](3)步骤I中所述的预处理后的木糖渣A和木糖渣B的酶解糖化方法相同。使用PH4.8的醋酸或柠檬酸缓冲溶液作为酶解缓冲液，向IL缓冲液中加入100-150g木糖渣，再加入15-30FPU/g木糖渣用量的纤维素酶，酶解温度为45-55 °C，酶解搅拌转速为100-300rpm，酶解时间 66_72h。
[0011](4)酶解结束后，通过固液分离得到富含葡萄糖的木糖渣酶解液。利用高效液相色谱法测定酶解液中葡萄糖含量，计算葡萄糖收率。然后将木糖渣酶解液浓缩至葡萄糖浓度为 100-200g/L。
[0012](5)将甘油管保藏的自絮凝酵母接种到种子培养基中，摇床温度30_35°C，摇床转速100-200rpm下培养18_24h。取上述种子液，按照5% -10% (v/v)的接种量接入到含有木糖渣酶解液的发酵培养基中进行厌氧发酵产生乙醇，发酵温度30-35°C，发酵pH值控制在6.0-6.5，发酵周期为40-50h。
[0013](6)步骤5中所述的自絮凝酵母为实验室自主筛选得到的Lachancea fermentatiY309。该自絮凝酵母菌落呈白色，圆形，表面有褶皱。液体培养过程中细胞会自发絮凝形成毫米级大小的颗粒，如附图1所示。每升种子培养基组成为葡萄糖20g，酵母膏4g，蛋白胨3g，硫酸镁lg。向IL步骤4的木糖渣酶解液中加入磷酸二氢钾l_2g，硫酸铵2-4g，硫酸镁0.1-1g配制成发酵培养基。
[0014](7)发酵结束后，将发酵液静置5秒钟，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，与发酵液分离。利用高效液相色谱分析发酵液中残糖和乙醇含量，计算乙醇收率。
[0015]步骤(4)和步骤(7)中的葡萄糖收率和乙醇收率的计算公式为:
[0016]葡萄糖收率=酶解液中葡萄糖浓度(g/L) X酶解液体积(L)/木糖渣中纤维素的质量(g) χιοο% ；
[0017]乙醇收率=发酵液中乙醇浓度(g/L) X发酵液体积(L)/发酵培养基中葡萄糖浓度(g)/乙醇理论收率(0.51) X 100%
[0018]与现有技术相比，本专利具有以下优势:
[0019](I)本发明使用的纤维素原料为木糖生产过程中的副产物木糖渣，由于其半纤维素已经大部分被去除，纤维素含量高，因此通过简单处理即可酶解糖化。特别是玉米芯蒸汽爆破残渣，可以直接被纤维素酶高效降解，从而进一步降低了酶解成本和设备投资。
[0020](2)本发明使用的自絮凝酵母在发酵过程中能自发形成毫米级大小的颗粒，从而在发酵罐中能够实现无载体固定化，增加细胞密度，缩短发酵周期，尤其适用于大规模连续发酵过程。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为自絮凝酵母Lachancea fermentati Y309的扫描电镜图
【具体实施方式】
[0022]实施例1
[0023]向IL碱性溶液中加入150g的木糖渣A。其中碱性溶液中亚硫酸钠的质量分数为2%，双氧水的质量分数为1%。在80°C，150rpm下预处理3h后进行固液分离得到预处理后的木糖渣A。向lLpH4.8的醋酸缓冲溶液中加入100g预处理后的木糖渣A，再加入2000FPU的纤维素酶，在50°C，150rpm下酶解65h得到富含葡萄糖的酶解液，其葡萄糖收率为86.8 %。将IL酶解液浓缩至葡萄糖浓度为150g/L，再向其中加入磷酸二氢钾1.5g，硫酸铵3g，硫酸镁0.5g配制成 发酵培养基。将甘油管保藏的自絮凝酵母接种到种子培养基中，摇床温度30°C，摇床转速150rpm下培养22h。取上述种子液，按照8% (v/v)的接种量接入到发酵培养基中进行厌氧发酵产生乙醇，发酵温度35°C，发酵pH值控制在6.5，发酵周期为45h。发酵结束后，将发酵液静置5秒钟，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，与发酵液分离。此时发酵液中残糖浓度为4.8g/L,乙醇浓度为64.6g/L，乙醇收率为理论转化率的84.5%。
[0024]实施例2
[0025]向IL碱性溶液中加入180g的木糖渣A。其中碱性溶液中亚硫酸钠的质量分数为4%，双氧水的质量分数为1.5%。在120°C，150rpm下预处理1.5h后进行固液分离得到预处理后的木糖渣A。向lLpH4.8的醋酸缓冲溶液中加入120g预处理后的木糖渣A，再加入3000FPU的纤维素酶，在50°C，200rpm下酶解70h得到富含葡萄糖的酶解液，其葡萄糖收率为89.3 %。将IL酶解液浓缩至葡萄糖浓度为180g/L，再向其中加入磷酸二氢钾1.Sg，硫酸铵3.6g，硫酸镁Ig配制成发酵培养基。将甘油管保藏的自絮凝酵母接种到种子培养基中，摇床温度35°C，摇床转速200rpm下培养20h。取上述种子液，按照10% (v/v)的接种量接入到发酵培养基中进行厌氧发酵产生乙醇，发酵温度35°C，发酵pH值控制在6.5，发酵周期为50h。发酵结束后，将发酵液静置5秒钟，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，与发酵液分离。此时发酵液中残糖浓度为7.3g/L,乙醇浓度为81.3g/L，乙醇收率为理论转化率的88.6%。
[0026]实施例3
[0027]向IL碱性溶液中加入200g的木糖渣A。其中碱性溶液中亚硫酸钠的质量分数为6%，双氧水的质量分数为2%。在150°C，150rpm下预处理Ih后进行固液分离得到预处理后的木糖渣A。向lLpH4.8的柠檬酸缓冲溶液中加入150g预处理后的木糖渣A，再加入4500FPU的纤维素酶，在50°C，250rpm下酶解72h得到富含葡萄糖的酶解液，其葡萄糖收率为81.5%。将IL酶解液浓缩至葡萄糖浓度为120g/L，再向其中加入磷酸二氢钾1.2g，硫酸铵2.6g，硫酸镁0.2g配制成发酵培养基。将甘油管保藏的自絮凝酵母接种到种子培养基中，摇床温度35°C，摇床转速120rpm下培养24h。取上述种子液，按照5% (v/v)的接种量接入到发酵培养基中进行厌氧发酵产生乙醇，发酵温度35°C，发酵pH值控制在6.0,发酵周期为40h。发酵结束后，将发酵液静置5秒钟，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，与发酵液分离。此时发酵液中残糖浓度为2.6g/L,乙醇浓度为55.2g/L，乙醇收率为理论转化率的90.2%。
[0028]实施例4
[0029]向lLpH4.8的醋酸缓冲溶液中加入100g的木糖渣B，再加入2000FPU的纤维素酶，在50°C，150rpm下酶解65h得到富含葡萄糖的酶解液，其葡萄糖收率为85.4%。将IL酶解液浓缩至葡萄糖浓度为150g/L，再向其中加入磷酸二氢钾1.58，硫酸铵38，硫酸镁0.5g配制成发酵培养基。将甘油管保藏的自絮凝酵母接种到种子培养基中，摇床温度30°C，摇床转速150rpm下培养22h。取上述种子液，按照8% (v/v)的接种量接入到发酵培养基中进行厌氧发酵产生乙醇，发酵温度35°C，发酵pH值控制在6.5，发酵周期为45h。发酵结束后，将发酵液静置5秒钟，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，与发酵液分离。此时发酵液中残糖浓度为4.4g/L,乙醇浓度为66.3g/L，乙醇收率为理论转化率的86.7%。
[0030]实施例5
[0031]向lLpH4.8的柠檬酸缓冲溶液中加入120g的木糖渣B，再加入3000FPU的纤维素酶，在50°C，200rpm下酶解70h得到富含葡萄糖的酶解液，其葡萄糖收率为88.7%。将IL酶解液浓缩至葡萄糖浓 度为180g/L，再向其中加入磷酸二氢钾1.Sg，硫酸铵3.6g，硫酸镁Ig配制成发酵培养基。将甘油管保藏的自絮凝酵母接种到种子培养基中，摇床温度35°C，摇床转速200rpm下培养20h。取上述种子液，按照10% (v/v)的接种量接入到发酵培养基中进行厌氧发酵产生乙醇，发酵温度35°C，发酵pH值控制在6.5，发酵周期为50h。发酵结束后，将发酵液静置5秒钟，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，与发酵液分离。此时发酵液中残糖浓度为6.9g/L,乙醇浓度为82.4g/L，乙醇收率为理论转化率的89.8%。
[0032]本发明中上述实施例中的温度及时间等参数均为较优的选择，经实验证明在超出上述实施例范围外也能实现本发明的目的，因不能穷尽所有的数值，在此不再赘述。
[0033]以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域的技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种发酵生产乙醇的自絮凝酵母，其拉丁文名为Lachancea fermentati Y309,保藏号为 CGMCC8844。
2.应用权利要求1所述的一种发酵生产乙醇的自絮凝酵母发酵生产乙醇的方法，包括以下步骤: 木糖渣分为两种，其中木糖渣A为玉米芯酸解残渣，木糖渣B为玉米芯蒸汽爆破残渣；对于木糖渣A，需要先将木糖渣在碱性溶液中进行预处理，然后再将预处理后的木糖渣A进行酶解糖化；对于木糖渣B，则直接将其进行酶解糖化； 所述的碱性溶液为亚硫酸钠和双氧水的混合溶液，其中亚硫酸钠的质量分数为1% _8%，双氧水的质量分数为0.5% -2.5%;向IL碱性溶液中加入150-200g的木糖渣A;预处理温度为80-150°C，预处理搅拌转速为100-300rpm，预处理时间为l_3h ； 所述的预处理后的木糖渣A和木糖渣B的酶解糖化方法相同；使用pH4.8的醋酸或柠檬酸缓冲溶液作为酶解缓冲液，向IL缓冲液中加入100-150g木糖渣，再加入15-30FPU/g木糖渣用量的纤维素酶，酶解温度为45-55°C，酶解搅拌转速为100-300rpm，酶解时间66-72h ； 酶解结束后，通过固液分离得到富含葡萄糖的木糖渣酶解液；然后将木糖渣酶解液浓缩至葡萄糖浓度为100-200g/L ;向IL木糖渣酶解液中加入磷酸二氢钾l_2g，硫酸铵2_4g，硫酸镁0.1-1g配制成发酵培养基； 将自絮凝酵母接种到种子培养基中，摇床温度30-35°C，摇床转速100-200rpm下培养18_24h得到种子液；所 述的自絮凝酵母为Lachancea fermentati Y309 ;每升种子培养基组成为葡萄糖20g,酵母膏4g,蛋白胨3g,硫酸镁Ig ； 取上述种子液，按照5% -10%的接种量接入到含有木糖渣酶解液的发酵培养基中进行厌氧发酵产生乙醇，发酵温度30-35°C，发酵pH值控制在6.0-6.5，发酵周期为40_50h。
【文档编号】C12P7/10GK104004669SQ201410168809
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】袁其朋, 范晓光, 霍辰青, 王世曾, 谭旭 申请人:北京化工大学