单核细胞增生性李斯特菌免疫pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测单核细胞增生性李斯特菌的经过特异性抗体包被的PCR反应管及免疫PCR检测试剂盒。所述的PCR反应管上预包被了能特异性富集样品中单核细胞增生性李斯特菌的单克隆抗体。本发明的检测试剂盒能够快速、准确、灵敏地从食品等样品中检测出单核细胞增生性李斯特菌，其灵敏度可达到103～104cfu/ml，比常规PCR灵敏度提高10～100倍。本发明将免疫学和分子生物学方法有机结合于一体，可在一个PCR管中实现样品中单核细胞增生性李斯特菌的富集和检测，操作简便，成本低廉，检测快速，结果准确。
【专利说明】单核细胞增生性李斯特菌免疫PCR检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和免疫学领域，具体涉及一种检测单核细胞增生性李斯特菌的免疫PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种短小的革兰氏阳性无芽胞兼性厌氧杆菌，是李斯特菌属中致病力最强的细菌，也是唯一对人致病的、典型的胞内寄生菌，可以导致严重的人畜共患传染病，如脑膜炎、败血症、流产和单核细胞增多等症状。1988年，世界卫生组织(World Health Organization, WHO)发表“食源性李斯特菌病劝告书”，指导全世界各国如何预防李斯特菌污染和中毒。自此，LM成为新的重要的食源性疾病病原菌，WHO将其与E.coli 0157、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌并列为20世纪90年代四大食源性致病菌。该菌主要污染牛奶及乳制品、乳酪制品、肉制品香肠、加工禽类、生肉、鱼、虾、烟熏鱼、生蔬菜。目前单核细胞增生李斯特菌的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定，其缺点是操作繁琐、检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。
[0003]免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定的快速检测手段，但是检测产品全部依赖进口，我国目前尚无拥有完全自主知识产权，且可运用于检测实践的快速检测产品，该专利以单核细胞增生李斯特菌为检测靶标，所要求保护的技术涉及单核细胞增生性李斯特菌快速检测产品。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种用于检测单核细胞增生性李斯特菌的PCR反应管。
[0005]本发明的另一个目的是提供一种用于检测单核细胞增生性李斯特菌的免疫PCR检测试剂盒。
[0006]本发明的第一方面是提供了一种用于检测单核细胞增生性李斯特菌的PCR反应管，所述的PCR反应管包括:
[0007]免疫PCR管；和
[0008]包被于所述的免疫PCR管管体内壁的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体，所述的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系6D4H7C8B6，CGMCCN0.8002 或 1B4E7A6C9, CGMCC N0.8765 产生。
[0009]本发明的第二方面是提供了一种检测试剂盒，所述的试剂盒含有所述的PCR反应管。
[0010]在一优选例中，所述的试剂盒还含有容器a，所述的容器a中装有所述的PCR反应管。
[0011 ] 在另一优选例中，所述的试剂盒还含有缓冲液、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20、引物、阳性对照和阴性对照。
[0012]在另一优选例中，所述的引物包括正向引物和反向引物。[0013]在另一优选例中，所述的阳性对照为灭活的单核细胞增生性李斯特菌菌液，所述的阴性对照为灭菌的李氏增菌肉汤。
[0014]本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是本发明的试剂盒的使用流程和原理图。
[0016]图2是单核细胞增生性李斯特菌直接PCR梯度稀释检测限研究结果。
[0017]其中，M:1OOObp DNA ladder ；N:阴性对照；1-8号泳道对应的细菌浓度为:I, 17 X IO8 ~1，17 X 10cfu/mL。 [0018]图3是单核细胞增生性李斯特菌免疫PCR检测试剂盒检测单核细胞增生性李斯特菌梯度稀释检测限研究结果。
[0019]其中，M:1OOObp DNA ladder ；N:阴性对照；1-8号泳道对应的细菌浓度为:
I,17 X IO8 ~1，17 X 10cfu/mL。
[0020]图4是检测试剂盒特异性的结果。
[0021]其中，M =1000bp DNA ladder ;N:阴性对照；1_12号泳道为:单核细胞增生性李斯特菌ATCC43251，单核细胞增生性李斯特菌ATCC82346，金黄色葡萄球菌ATCC27660，鼠氏伤寒沙门氏菌ATCC22956，肠炎沙门氏菌ATCC13076，副溶血弧菌ATCC17802，小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC23715，福氏志贺氏菌ATCC12022，宋内氏志贺氏菌ATCC25931，痢疾志贺氏菌ATCC51329,乙型溶血性链球菌ATCC10373，阪崎肠杆菌ATCC29004。
[0022]图5是模拟带菌牛奶样品免疫PCR试剂盒检测限研究结果。
[0023]A(I)模拟带菌牛奶样品直接PCR检测限研究结果；
[0024]A(2)模拟带菌牛奶样品免疫捕获PCR检测试剂盒检测限研究结果；
[0025]其中，M:1OOObp DNA ladder ；N:阴性对照；I号泳道为牛奶样品(不加菌液)；2_8号泳道对应的细菌浓度为:1，17 X IO2~I, 17X 108cfu/mL。
[0026]图6是模拟带菌酸奶样品免疫PCR试剂盒检测限研究结果。
[0027]B⑴模拟带菌酸奶样品直接PCR检测限研究结果；
[0028]B (2)模拟带菌酸奶样品免疫捕获PCR检测试剂盒检测限研究结果；
[0029]其中，M:1OOObp DNA ladder ；N:阴性对照；I号泳道为酸奶样品(不加菌液)；2_8号泳道对应的细菌浓度为:1，17 X IO2~I, 17X 108cfu/mL。
[0030]图7是模拟带菌香肠样品免疫PCR试剂盒检测限研究结果；
[0031]C⑴模拟带菌香肠样品直接PCR检测限研究结果；
[0032]C(2)模拟带菌香肠样品免疫捕获PCR检测试剂盒检测限研究结果；
[0033]其中，M:1OOObp DNA ladder ；N:阴性对照；I号泳道为香肠样品(不加菌液)；2_8号泳道对应的细菌浓度为:1，17 X IO2~I, 17X 108cfu/mL。
[0034]图8是模拟带菌蛋糕样品免疫PCR试剂盒检测限研究结果。
[0035]D(I)模拟带菌蛋糕样品直接PCR检测限研究结果；
[0036]D (2)模拟带菌蛋糕样品免疫捕获PCR检测试剂盒检测限研究结果；
[0037]其中，M:1OOObp DNA ladder ；N:阴性对照；I号泳道为蛋糕样品(不加菌液)；2_8号泳道对应的细菌浓度为:1，17 X IO2~I, 17X 108cfu/mL。
[0038]图9是模拟带菌果汁样品免疫PCR试剂盒检测限研究结果。
[0039]E⑴模拟带菌果汁样品直接PCR检测限研究结果；
[0040]E (2)模拟带菌果汁样品免疫捕获PCR检测试剂盒检测限研究结果；
[0041]其中，M:1OOObp DNA ladder ；N:阴性对照；I号泳道为果汁样品(不加菌液);2_8号泳道对应的细菌浓度为:1，17 X IO2~I, 17X 108cfu/mL。
[0042]图10是模拟带菌鸡蛋样品免疫PCR试剂盒检测限研究结果。
[0043]F(I)模拟带菌鸡蛋样品直接PCR检测限研究结果；
[0044]F(2)模拟带菌鸡蛋样品免疫捕获PCR检测试剂盒检测限研究结果；
[0045]其中，M:1000bp DNA ladder ；N:阴性对照；I号泳道为鸡蛋样品(不加菌液)；2_8号泳道对应的细菌浓度为:1，17 X IO2~I, 17X 108cfu/mL。
【具体实施方式】
[0046]本发明人的研究表明，以单核细胞增生性李斯特菌作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，分离纯化得到抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体6D4H7C8B6和1B4E7A6C9，其抗体效价可达到1:100000，其能够特异性、高效地与单核细胞增生性李斯特菌结合，检测灵敏度达到105cfu/ml。与出血性大肠杆菌0157:H7、猪霍乱沙门、鼠伤寒沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、副溶血弧菌、阪崎肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌等共计68种病原细菌均无交叉反应。
[0047]在此基础上，本发明人进而将致病菌免疫富集技术和基因水平检测技术有效结合，即先用本发明的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体将待测样品中的病原菌特异性免疫富集，然后再进行PCR扩增，从而提供了一种可快速、高效检测食源性单核细胞增生性李斯特菌的检测试剂盒。
[0048]抗体
[0049]本发明的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体可以利用小鼠杂交瘤细胞系6D4H7C8B6 (CGMCC N0.8002)或 1B4E7A6C9 (CGMCC N0.8765)分泌产生。本发明包括具有抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体6D4H7C8B6或1B4E7A6C9的相应氨基酸序列的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90%同源性，较佳地至少95%同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括:药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
[0050]对于本发明的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测定。抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体V链的超变区或互补决定区(complementarity determining region, Q)R)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其⑶R与抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体⑶R具有90%以上(较佳地95%以上)的同源性。本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab ‘)2片段；抗体重链；抗体轻链。
[0051]本发明还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以用常规技术，利用杂交瘤细胞系 6D4H7C8B6(CGMCC N0.8002)或 1B4E7A6C9 (CGMCC N0.8765)获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
[0052]一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0053]此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0054]目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中己知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。[0055]本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0056]宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。
[0057]用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如出血性大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaClJi处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可运用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
[0058]获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0059]在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0060]本发明的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体6D4H7C8B6和1B4E7A6C9，其效价高(可以达到1:100000)，能够特异性地、高效地检测单核细胞增生性李斯特菌，与出血性大肠杆菌015 7: H 7、猪霍乱沙门、鼠伤寒沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、副溶血弧菌、阪崎肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌等共计68种病原细菌均无交叉反应，此为本发明的最大创新点。
[0061]检测试剂盒
[0062]本发明人根据免疫PCR的原理，制备了一种可用于检测样品中单核细胞增生性李斯特菌的试剂盒，即先用本发明的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体6D4H7C8B6或1B4E7A6C9将待测样品中的病原菌特异性地免疫富集，然后再进行PCR扩增，以提高检测的灵敏度和特异性。
[0063] 具体而言，本发明首先是提供了一种用于检测单核细胞增生性李斯特菌的PCR反应管，它包括免疫PCR管和包被于所述免疫PCR管管体内壁的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体6D4H7C8B6或1B4E7A6C9，所述的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体6D4H7C8B6和1B4E7A6C9分别由小鼠杂交瘤细胞系6D4H7C8B6，CGMCC N0.8002或1B4E7A6C9, CGMCC N0.8765 分泌产生。
[0064]在此基础上，本发明进而提供了一种单核细胞增生性李斯特菌免疫PCR检测试剂盒，它含有上述用于检测单核细胞增生性李斯特菌的PCR反应管；
[0065]作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还装载有容器a，所述的容器a可以是自封袋或者其他形式的容器，其中装有本发明的包被有抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体 6D4H7C8B6 或 1B4E7A6C9 的 PCR 反应管。
[0066]此外，为了使本发明的试剂盒在检测时更方便，所述的本发明的试剂盒中优选地还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是免疫PCR检测试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如(但不限于):缓冲液(10XPCR Buffer)、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20(灭菌双蒸水)、引物等常规PCR反应试剂。10XPCR Buffer、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20与常规的免疫PCR检测试剂盒中的所用的试剂相同。同时，为了消除假阳性和假阴性，还可在PCR检测过程中设置质控(对照)，即在本发明的试剂盒中还包含有阴性对照和阳性对照等。较佳地，所述的阳性对照溶液为灭活的单核细胞增生性李斯特菌菌液，阴性对照溶液为灭菌的李氏增菌肉汤。如本领域技术人员所熟知，上述试剂和溶液可分别装载于EP管或试剂瓶中。
[0067]此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。
[0068]本发明的有益效果:本发明的单核细胞增生性李斯特菌免疫PCR检测试剂盒集病原菌浓缩、特异性抗体识别以及PCR扩增为一体，具有检测结果准确性高、特异性强、灵敏度高以及检测快速、使用方便等优点，弥补了现有食源性致病菌检测技术费时耗力、灵敏度低的不足。
[0069]本发明的单核细胞增生性李斯特菌免疫PCR检测试剂盒适用于菌株快速鉴定、食品中食源性致病菌检测等诸多领域，尤其适用于样品中微量病原体的快速检测。可供质监部门、进出口检疫部门等用于检测食样中的单核细胞增生性李斯特菌。
[0070]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人,分子克隆:实验室指南(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0071]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0072]实施例1.抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体6D4H7C8B6和1B4E7A6C9的制备
[0073]一、免疫原和阳性标准品的准备
[0074]单核细胞增生性李斯特菌(ATCC N0.43251)接种于李氏增菌肉汤37°C、150r/min振荡培养17h，计数，加入0.3%甲醛溶液室温灭活I天。用生理盐水调整单核细胞增生性李斯特菌(ATCC N0.43251)浓度至5 X 109cfu/ml作为免疫原；用生理盐水调整浓度为IO8Cfu/ml单核细胞增生性李斯特菌菌液作为阳性对照标准品，李氏增菌肉汤为阴性对照标准品。
[0075]二、单克隆抗体的制备
[0076]I)实验动物:选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。
[0077]2)免疫方法:每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射
一次。
[0078]3)米血:3次加强免疫后从尾部静脉米血,米用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
[0079]4)细胞融合:取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下常规融合，分别接种于96孔培养板，置于37°C、5% CO2培养箱培养。
[0080]5)杂交瘤细胞筛选:采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，将其转移至24孔培养板。
[0081]6)克隆培养及抗体制备:用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3 — 4次，直至阳性率达到100 %。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2 X IO6个杂交瘤细胞，7~10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水
中纯化抗体。Listeria monocytogenes单核细胞增生性李斯特菌-国标:GB4789.30一
2010
[0082]李氏增菌肉汤
[0083]成分:胰胨5.0g,多价胨5.0g,酵母膏5.0g,氯化钠20.0g,磷酸二氢钾1.4g，磷酸氢二钠12.0g，七叶苷1.0g，蒸馏水1000mL ；
[0084]制法:将上述成分加热溶解，调节pH7.2~7.4，分装，1211:高压灭菌151^11，备用。
[0085]单克隆抗体效价测定方法:
[0086](I)将饱和培养细菌抗原连同培养基在对应的孔中加入100μ 1，4°C过夜(约包板36h)。
[0087](2)倒空液体并拍干残留液体，用250 μ I洗涤液清洗3次。
[0088](3)每个孔中加 100 μ 11% BSA，37°C封闭 Ih0
[0089](4)倒空液体并拍干残留液体，用250 μ I洗涤液清洗3次。
[0090](5)每个孔中加100 μ I血清，37°C孵育lh。
[0091](6)倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250 μ IPBST洗涤液洗涤3次。
[0092](7)每个孔中50 μ I的HRP标记的二抗(sigma)，室温孵育lh。
[0093](8)用洗涤液浸泡5min，倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250 μ IPBST洗涤液洗涤3次。
[0094](9)每个孔中加100 μ I底物，显色30min，加终止液100 μ I并立即在OD450读数。
[0095]表1.两株单克隆抗体效价测定结果(OD45tl)
【权利要求】
1.一种用于检测单核细胞增生性李斯特菌的PCR反应管，其特征在于，所述的PCR反应管包括: 免疫PCR管；和 包被于所述的免疫PCR管管体内壁的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体，所述的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系6D4H7C8B6，CGMCC N0.8002或1B4E7A6C9, CGMCC N0.8765 产生。
2.一种检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有如权利要求1所述的PCR反应管。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有容器a，所述的容器a中装有如权利要求1所述的PCR反应管。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有缓冲液、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20、引物、阳性对照和阴性对照。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物包括正向引物和反向引物。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为灭活的单核细胞增生性李斯特菌菌液，所述的阴性对照为灭菌的李氏增菌肉汤。
【文档编号】C12Q1/68GK103937898SQ201410177007
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】刘箐, 宋春美, 吴嫚 申请人:上海理工大学