一种提取纯化m-mlv逆转录酶的方法
【专利摘要】本发明提出了一种提取纯化M-MLV逆转录酶的方法。步骤为：工程菌的活化和表达：取M-MLV逆转录酶工程菌进行活化后加入IPTG诱导表达得到表达的工程菌；用溶菌酶室温处理后加入DTT，吐温-20，冰上处理一段时间后离心，得到粗蛋白；粗蛋白中缓慢加入二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌，离心去除沉淀得到上清；上清移至已经预热至60℃的水浴锅中，孵育后离心，去除沉淀，得到上清；流过已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，再进行脱盐得到纯化的M-MLV逆转录酶；得到的M-MLV逆转录酶可加入甘油使体积分数为50%，-20℃保存。本发明方法简单，酶活性损失小，回收蛋白的纯度、活性、回收量高。
【专利说明】-种提取纯化M-MLV逆转录酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种提取纯化M-MLV逆转录酶的方法。
【背景技术】
[0002] Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT,M_MLV 逆 转录酶)是一种RNA依赖的DNA聚合酶，基因来源是莫洛尼（氏）鼠白血病病毒基因组。它 可以以单链RNA、DNA或RNA-DNA杂交体为模板进行cDNA合成。
[0003] M-MLV逆转录酶是从原核表达菌中（含M-MLV Reverse Transcriptase基因的 BL21 (DE3)工程菌）进行提取纯化。
[0004] 目前，因活性蛋白容易变性失活因而纯化都是要求在低温条件下进行(冰上操 作)，常规纯化M-MLV逆转录酶方法采用低温超声破碎，反复通过硫酸铵沉淀、离子交换、层 析和脱盐进行纯化，不仅高达50%的蛋白会在纯化初期就会损失，而且部分基因组蛋白很 难完全去除，再加上基因组蛋白的存在会导致上柱速度缓慢，延长纯化时间，纯化得到的蛋 白酶活降低，影响了后期酶的逆转录活性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种简单，酶活性损失小，回收蛋白的纯度和回收量高的 活性蛋白酶的提取方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供一种提取纯化M-MLV逆转录酶的方法，其特征在于， 包括如下步骤， 1) 工程菌的活化和表达：取M-MLV逆转录酶工程菌进行活化后并振荡培养后加入IPTG 诱导；洗涤；离心收集菌体；收集的菌体用缓冲液A洗涤，离心；再用缓冲液A重悬得到表达 的工程菌； 2) 粗蛋白制备：将所述表达的工程菌用溶菌酶室温处理后加入DTT，吐温-20,冰上处 理一段时间后离心，得到的上清即为粗蛋白； 3) 粗蛋白中缓慢加入二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌，离心去除沉淀得到上清； 4) 将所述得到的上清移至已经预热至60°C的水浴锅中，孵育后离心，去除沉淀，得到上 清； 5) 上清流过已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，再进行脱盐得到纯化的M-MLV逆转录酶； 所述缓冲液 A 为 20mM Tris-HCl，0. 2M NaCl，pH 8. 0 ; 任选的，得到的M-MLV逆转录酶加入甘油使体积分数为50%，-20°C保存。
[0007] 所述M-MLV逆转录酶工程菌为从莫洛尼氏鼠白血病病毒中PCR扩增得到PCR产 物，所得PCR产物经Sal I、Hindlll双酶切后连接至经Sal I、Hindlll双酶切的PET28a 载体上，构建表达载体PET28a-M-MLV，将上述质粒转化表达菌BL21 (DE3)，即获得生产重组 M-MLV逆转录酶的工程菌株。
[0008] 所述PCR扩增所用的引物为SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2。
[0009] 所述步骤1)为取M-MLV逆转录酶工程菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中， 振荡培养；取活化好的菌液转接到同样的LB液体培养基中，振荡培养后加入IPTG诱导培养 8小时；用离心管超声洗涤30min，并用双蒸水润洗一次；离心收集菌体；收集的菌体用缓冲 液A洗涤，离心；再用缓冲液A重悬得到表达的工程菌。
[0010] 所述步骤1)为取M-MLV逆转录酶工程菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中， 37°C，200rpm振荡培养过夜；取活化好的菌液转接到同样的LB液体培养基中，37°C，250转 /分振荡培养4小时后加入1M IPTG至终浓度1. 0mmol/L，28°C、250 rpm件下培养8小时； 用离心管超声洗涤30min，并用双蒸水润洗一次；12000rpm，4°C离心5分钟收集菌体；收集 的菌体用缓冲液A洗涤一次，12000rpm，4°C离心5分钟；再用缓冲液A重悬得到表达的工程 菌。
[0011] 所述步骤2)为将所述表达的工程菌用4mg/ml终浓度溶菌酶室温处理20分 钟后加入DTT使终浓度为ImM，加入吐温-20使体积百分比为0. 5%，冰上处理45分钟， 15000g/4°C /20分钟，得到的上清即为粗蛋白。
[0012] 所述步骤3)为粗蛋白中缓慢加入体积系数5%的二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅 拌10分钟，15000g，4°c离心20分钟，去除沉淀。
[0013] 所述步骤4)中孵育10分钟，离心条件为15000g/4°C /20分钟。
[0014] 所述步骤5)为上清补足NaCl后流过已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，该柱先用10倍床 体积结合缓冲液平衡；再用5倍床体积洗涤缓冲溶液依次洗涤；最后用洗脱液洗脱目的蛋 白；含目的蛋白的洗脱液用sephade XG25脱盐后即得到纯化的M-MLV逆转录酶；脱盐中用 到的脱盐缓冲液为缓冲液 E: 100mMTris-HCl，PH7.5, 2mMDTT, 0·2%ΝΡ-40, lOOmMNaCl， 0.2mM EDTA ； 所述结合缓冲液为20mM Tris-HCL，0. 5MNaCl，PH8. 0，5mM咪唑；所述洗涤缓 冲溶液为 20mM Tris-HCL, 0. 5MNaCl, PH8. 0,15mM/50mM 咪唑；所述洗脱液为 20mM Tris-HCL, 0· lMNaCl, ΡΗ8· 0，200mM 咪唑。
[0015] 本发明生产工艺合理简单，仅需要溶菌酶破碎菌体，二氧化硅吸附杂蛋白和核酸， 60°C加热孵化处理10分钟，亲和层析进行纯化，避免了常规逆转录酶纯化中反复通过离子 交换柱，层析柱和脱盐柱进行纯化。保证酶活性得到很好的保持，并且保证了产品产量和纯 度，后期使用过程中逆转录效果良好。
[0016] 1.产品的确认 (1)基因来源 M-MLV逆转录酶基因为从莫洛尼（氏）鼠白血病病毒基因中扩增得到。
[0017] 扩增引物为： M-MLV ：cgcGAGCTCATGACCCTAAATATAGAAGAT SEQ ID N0:1 M-MLV ：cgcAAGCTTCGAGGAGGGTAGAGGTG SEQ ID NO :2 基因序列信息：Moloney murine leukemia virus, complete genome. gb|AF033811. 1 |AF033811，Range 1: 2332 to 4347。 具体见 SEQ ID NO:3 ; (2)载体来源 PET-28a表达质粒购自美国Novagen公司。该质粒在克隆位点前有1个T7启动子，在T7 启动子前有1个6XHis-Tag coding序列，是Τ7的增强子，多克隆位点上有Ncol-Xholll 个酶切位点，载体上还有1个卡那霉素（Kan)的筛选标记； (3) 宿主菌 宿主菌为BL21 (DE3)菌株，即宿主菌BL21经噬菌体DE3溶源化后，DE3的lacUV5强启 动子及位于其下游的T7 RNA聚合酶基因被整合到宿主菌的基因组DNA中。宿主菌在非代 谢性乳糖类似物IPTG的诱导作用下能产生大量的T7RNA聚合酶，而T7RNA聚合酶能特异性 地识别PET-28a表达载体中的T7启动子序列，从而高效地表达目的重组蛋白。由于IPTG 不会被宿主菌利用，因此向培养液中加入少量的IPTG就能对lacUV5强启动子产生持久的 诱导作用； (4) M-MLV逆转录酶工程菌株 M-MLV逆转录酶基因的per产物经Sal I、HindIII双酶切后连接至经Sal I、HindIII 双酶切的PET28a载体上，构建表达载体PET28a-M-MLV，将上述质粒转化表达菌BL21 (DE3)， 即获得生产重组M-MLV逆转录酶的工程菌株。
[0018] 2.产品的制备 ①用50ml缓冲液A (20mM Tris-HCL, (λ 2MNaCl, PH8. 0)重悬菌体（生产重组M-MLV逆 转录酶的工程菌株），4mg/ml终浓度溶菌酶室温处理20分钟，加入DTT使终浓度为ImM，加 入吐温-20使体积百分比为0. 5%，冰上处理45分钟，15000g/4°C /20分钟，得到的上清即粗 蛋白。
[0019] ②粗蛋白中缓慢加入体积系数5%的二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌30分钟(吸 附基因组DNA和杂蛋白），15000g/4°C /20分钟，去除沉淀，上清移入干净离心管。
[0020] ③将步骤②得到的上清移至已经预热至60°C的水浴锅中，孵育10分钟， 15000g/4°C /20分钟，去除沉淀，上清移入干净离心管。
[0021] ④上清液补足NaCl至终浓度为0. 5M，流过已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，该柱先用10 倍床体积结合缓冲液（20mM Tris-HCL，0. 5MNaCl，PH8. 0，5mM咪唑）平衡；再用5倍床体积 洗涤缓冲溶液（20mM Tris-HCL，0· 5MNaCl，PH8. 0,15mM/50mM咪唑）依次洗涤；最后用洗脱 液（20mMTris-HCL，0. lMNaCl，PH8.0，200mM咪唑)洗脱目的蛋白。含目的蛋白的洗脱液用 s印hadexG25 脱盐，脱盐缓冲液为缓冲液 E : (100mMTris-HCl (7. 5)，2mMDTT，0· 2%NP-40， lOOmMNaCl，0. 2mMEDTA)。脱盐后加入甘油使体积分数为50%，-20°C保存备用。
[0022] 3.产品的用途 M-MLV逆转录酶可以以单链RNA、DNA或RNA-DNA杂交体为模板进行eDNA合成。由于 具有RNase Η活性低，eDNA得率高高的特点，M-MLV逆转录酶可用于逆转录、qRT-PCR，适合 应用于一步法qRT-PCR试剂盒的开发。
[0023] 有益效果： 1. 和常规M-MLV逆转录酶提取方法对比，采用60°C孵育步骤，最大限度去除杂蛋白，保 障提纯得到高纯度M-MLV逆转录酶； 2. 和常规M-MLV逆转录酶提取方法对比，提取纯化过程加入二氧化硅进行核酸和杂蛋 白的吸附，去除大量核酸和杂蛋白，上柱速度快，有效减少亲和层析柱中核酸和杂蛋白的非 特异吸附机会，减少上柱时间，有利于保证回收蛋白的纯度和保持逆转录酶活性； 3. 和常规M-MLV逆转录酶提取方法对比，本发明只需要亲和层析柱和脱盐柱，上柱次 数少，操作简单，避免反复使用离子交换柱和层析柱，容易在普通实验室进行蛋白纯化并且 有效保障蛋白回收率。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1是SDS-PAGE纯度检测电泳图。
[0025] 图2是M-MLV逆转录酶活性检测结果图。
[0026] 图3是不加 M-MLV逆转录酶的活性检测对照实验结果图。
【具体实施方式】
[0027] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例 中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明 书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0028] 实施例1 : 一、主要试剂 1. LB液体培养基（1000 mL) NaCl ：10g 蛋白胨：l〇g 酵母粉：5g 2. 缓冲液 A (20mM Tris-HC1，0.2M NaCl，pH 8.0) (1000 mL) Trizma-HCl： 1.7651g Trizma-Base ：1.066g NaCl ： 11. 688g 3. 缓冲液 B (20mM Tris-HC1，0.5M NaCl，pH 8.0) (1000 mL) Trizma-HCl ： 1.7651g Trizma-Base ： 1.066g NaCl ： 29. 22g 4. 洗涤缓冲液C:(20mM Tris-HC1，0.5M NaCl，5mM 咪唑，0.5%Tween-20，pH 8.0)(100 mL) 缓冲液B :100mL 3M 咪唑：167uL Tween-20 :500 uL 5. 洗涤缓冲液 D:(20mM Tris-HC1，0.5M NaCl，5mM 咪唑，pH 8.0) (100 mL) 缓冲液B :100mL 3M 咪唑：167uL 6. 菌种活化 取M-MLV逆转录酶工程菌200uL接种到20mL含卡那霉素（5(^g/mL)LB液体培养基中， 37°C，200rpm振荡培养过夜。
[0029] 二、工程菌的构建和表达 1、M-MLV逆转录酶工程菌的构建 模板为含莫洛尼（氏）鼠白血病病毒基因组gag-pol基因质粒。序列见SEQ ID N0:3 (Invitrogen全基因人工合成） 扩增引物为： M-MLVF ：cgcGAGCTCATGACCCTAAATATAGAAGAT (SEQ ID NO:1) M-MLVR ：cgcAAGCTTCGAGGAGGGTAGAGGTG (SEQ ID NO :2) PCR反应体系配置见表1 :
【权利要求】
1. 一种提取纯化M-MLV逆转录酶的方法，其特征在于，包括如下步骤， 1) 工程菌的活化和表达：取M-MLV逆转录酶工程菌进行活化后并振荡培养后加入IPTG 诱导；洗涤；离心收集菌体；收集的菌体用缓冲液A洗涤，离心；再用缓冲液A重悬得到表达 的工程菌； 2) 粗蛋白制备：将所述表达的工程菌用溶菌酶室温处理后加入DTT，吐温-20,冰上处 理一段时间后离心，得到的上清即为粗蛋白； 3) 粗蛋白中缓慢加入二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌，离心去除沉淀得到上清； 4) 将所述得到的上清移至已经预热至60°C的水浴锅中，孵育后离心，去除沉淀，得到上 清； 5) 上清流过已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，再进行脱盐得到纯化的M-MLV逆转录酶； 所述缓冲液 A 为 20mM Tris-HCl，0. 2M NaCl，pH 8. 0 ; 任选的，得到的M-MLV逆转录酶加入甘油使体积分数为50%，-20°C保存。
2. 权利要求1所述的提取纯化M-MLV逆转录酶的方法，其特征在于，所述M-MLV逆转 录酶工程菌为从莫洛尼氏鼠白血病病毒中PCR扩增得到PCR产物，所得PCR产物经Sal I、 Hindlll双酶切后连接至经Sal I、Hindlll双酶切的PET28a载体上，构建表达载体 PET28a-M-MLV，将上述质粒转化表达菌BL21 (DE3)，即获得生产重组M-MLV逆转录酶的工程 菌株。
3. 权利要求2所述的提取纯化M-MLV逆转录酶的方法，其特征在于，所述PCR扩增所用 的引物为 SEQ ID ΝΟ:1 和 SEQ ID NO:2。
4. 权利要求1或2所述的提取纯化M-MLV逆转录酶的方法，其特征在于，所述步骤1) 为取M-MLV逆转录酶工程菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养；取活化好的 菌液转接到同样的LB液体培养基中，振荡培养后加入IPTG诱导培养8小时；用离心管超声 洗涤30min，并用双蒸水润洗一次；离心收集菌体；收集的菌体用缓冲液A洗涤，离心；再用 缓冲液A重悬得到表达的工程菌。
5. 权利要求4所述的提取纯化M-MLV逆转录酶的方法，其特征在于，所述步骤1)为取 M-MLV逆转录酶工程菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37°C，200rpm振荡培养过夜； 取活化好的菌液转接到同样的LB液体培养基中，37°C，250转/分振荡培养4小时后加入 1]\11?16至终浓度1.0臟〇1/1，281：、250印111件下培养8小时；用离心管超声洗涤301^11，并 用双蒸水润洗一次；12000rpm，4°C离心5分钟收集菌体；收集的菌体用缓冲液A洗涤一次， 12000rpm，4°C离心5分钟；再用缓冲液A重悬得到表达的工程菌。
6. 权利要求1或2所述的提取纯化M-MLV逆转录酶的方法，其特征在于，所述步骤2) 为将所述表达的工程菌用4mg/ml终浓度溶菌酶室温处理20分钟后加入DTT使终浓度为 ImM，加入吐温-20使体积百分比为0. 5%，冰上处理45分钟，15000g/4°C /20分钟，得到的上 清即为粗蛋白。
7. 权利要求1或2所述的提取纯化M-MLV逆转录酶的方法，其特征在于，所述步骤3) 为粗蛋白中缓慢加入体积系数5%的二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌10分钟，15000g，4°C 离心20分钟，去除沉淀。
8. 权利要求1或2所述的提取纯化M-MLV逆转录酶的方法，其特征在于，所述步骤4) 中孵育10分钟，离心条件为15000g/4°C /20分钟。
9.权利要求1或2所述的提取纯化M-MLV逆转录酶的方法，其特征在于，所述步骤5) 为上清补足NaCl后流过已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，该柱先用10倍床体积结合缓冲液平衡； 再用5倍床体积洗涤缓冲溶液依次洗涤；最后用洗脱液洗脱目的蛋白；含目的蛋白的洗脱 液用 SephadeXG25脱盐后即得到纯化的M-MLV逆转录酶；脱盐中用到的脱盐缓冲液为缓冲 液 E: 100mMTris-HCl，PH7.5，2mMDTT, 0.2%NP-40，100mM NaCl, 0. 2mM EDTA ； 所述结合缓冲液为20mM Tris-HCL，0. 5MNaCl，PH8. 0，5mM咪唑；所述洗涤缓 冲溶液为 20mM Tris-HCL, 0. 5MNaCl, PH8. 0,15mM/50mM 咪唑；所述洗脱液为 20mM Tris-HCL, 0· lMNaCl, ΡΗ8· 0，200mM 咪唑。
【文档编号】C12R1/19GK104250642SQ201410180381
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】魏劭, 林家旺, 魏超 申请人:厦门安普利生物工程有限公司