一种环介导等温扩增技术快速检测胡萝卜成分用的引物组的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种环介导等温扩增技术快速检测胡萝卜成分用的引物组，包括内引物、外引物和环引物，属于利用核酸扩增技术进行植物源性成分快速检测的【技术领域】。具体地说是采用环介导等温扩增方法检测食品和饮料中胡萝卜成分的引物组。本发明针对胡萝卜核糖体RNA基因，根据其基因的保守序列，设计一组特异性引物，使用该组引物，采用环介导等温扩增技术，可快速、灵敏、特异地检测胡萝卜成分。
【专利说明】—种环介导等温扩增技术快速检测胡萝卜成分用的引物组
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种环介导等温扩增技术快速检测胡萝卜成分用的引物组，属于利用核酸扩增技术进行植物源性成分快速检测的【技术领域】。
【背景技术】
[0002]全球经济一体化和贸易国际化的的不断扩大，对于发展中的中国，是机遇也是挑战。目前，我国已成为世界上第五大农产品出口国，农产品进出口贸易持续增长。美国、欧盟、日本等发达国家和地区为了维护本国的经济利益，争夺国际市场，竭力通过名目繁多的检验项目和严格甚至苛刻的技术标准，对进口农产品设置贸易障碍，导致我国农产品出口增长遭受较大压力。就进出口的农产品而言，合格的产品，不仅要无毒无害，满足安全卫生要求；而且要无搀杂搀假，满足品质要求。其中品质合格，又主要包含两方面的含义:1.原料来源与标签一致。2.组分含量与标签一致。欧盟自2006年I月I日起开始实施新的食品卫生法规，新法规突出了食品生产过程中的可追溯管理与食品的可追溯性，强调食品的身份鉴定标识与健康标识。我国国家标准GB 7718-94《食品标签通用标准》和国家出入境检验检疫局发布的《进出口食品标签管理办法》，也明确提出食品标签标注内容应与食品相符。为此，国家质检总局专门发文，要求严厉打击制假制劣的违法行为，对假冒伪劣产品要依法没收并监督销毁，追查生产源头和去向，严防流入消费环节。
[0003]在食品和饮料的生产与销售中，产品无标签或标签不规范，利用掺杂掺假、以次充好等手段欺骗消费者谋取暴利的事件，国内、国外均屡屡发生。各种原料被加工成食品和饮料成品后，已无法从外观对其组成进行鉴定。生产者受利益驱动，擅自改变产品组成，或掺入价廉的替代品，或直接减少原料用量，导致产品的真实属性与标签不符。这种造假行为不仅仅涉及经济、营养价值，更直接影响着消费者的健康，可能引发食源性过敏反应。
[0004]胡萝卜是一种质脆味美的家常蔬菜，素有“小人参”之称，其富含糖类、脂肪、挥发油、胡萝卜素、维生素A、维生素B1、维生素B2、花青素、钙、铁等多种营养成分，常作为食品配料用于制作各种糕点、面食和饮料。胡萝卜虽营养丰富，但同时也是一种常见的食物过敏原。有文献报道，胡萝卜、苹果、大豆、榛子、猕猴桃、小麦是柏林人最常见的食物过敏原。瑞士专家报道，大约25%的食物过敏者会对胡萝卜产生过敏反应。《亚运食品安全食品过敏原标识标注》地方技术规范已于2009年颁布实施，规范列出可导致过敏反应的食品名单，要求含有名单上过敏原的亚运食品必须如实标注，胡萝卜位列其中。鉴于此，尽快建立可靠有效的胡萝卜成分检测方法，确保食物标签真实准确，对于减少食源性过敏反应发生，加强食品过敏原标识管理，改进食品安全，保护消费者利益具有重要意义。
[0005]食品中植物源性成分检测，常采用蛋白检测和DNA检测的方法。两类方法，对于不同产品中植物源性成分的检出和定量检测，各有优、缺点。以DNA为测试对象的方法与以蛋白为测试对象的方法相比，在产品成分复杂的情况下，目标DNA可以有效提取，受产品基质的影响较小；此外，DNA比较稳定，不象蛋白质组成那样易受加工工艺的影响。当前，基于DNA的检测方法中，常用的有聚合酶链式反应(常规PCR和实时荧光PCR)，该方法灵敏、特异，但需要高品质热循环仪，而且因为温度循环导致耗时较长。其他新开发的核酸扩增方法，比如 NASBA (nucleic acid sequence-based amplification)>3SR (self-sustainedsequence replication)、SDA (strand displacement amplification)等，在扩增循环方面，都有各自的创新点。NASBA和3SR使用一系列转录和反转录过程来循环以避免高温变性作用，SDA则使用限制性内切酶和修饰过的模板来循环扩增。虽然它们的敏感性都很高，可以检测并扩增小于10个拷贝的核酸样本，但是它们还有各自需要克服的缺点。技术要求、材料仪器要求、技术本身特异性缺陷等方面严重束缚了这些技术的推广应用。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,简称LAMP)技术则在这些方面有所突破。LAMP有比较高的特异性和抗干扰能力，只有当2对引物与目的片段的六个区域都匹配上时才能进行扩增。非目的片段对LAMP反应的干扰比较小，这方面比常规的PCR要强。LAMP的反应体系比较稳定可靠，在室温下放置2周后仍然稳定并且对于样品中原有或污染的无关、干扰片段仍然不敏感。同时LAMP的敏感性也比较高，可以以单拷贝的基因为模板进行扩增。LAMP反应的过程简单快速而且高效，能够在Ih内将单拷贝的基因模板扩增到IO9个拷贝，如果在体系中增加2条环状引物，还可使LAMP的反应时间缩短至20-40min，从而提高检测效率。而且这一过程是在60-70°C的恒温下进行的。这就摆脱了昂贵仪器的束缚，一个水浴锅即可完成绝大多数检测过程。此外，LAMP结果的检测可使用浊度仪检测沉淀浊度，也可通过使用染料，在日光下肉眼直接判定。因此，相比于其他基于DNA的检测方法，LAMP方法更加简便、快捷，是真正普及型的核酸检测方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对胡萝卜，设计一组特异性引物，进而建立一种快速检测胡萝卜DNA的方法，以克服基于蛋白的检测方法在某些产品检测中的局限性，为胡萝卜成分检
测提供有效工具，确保食品标签的一致性和消费者的饮食安全。
[0007]本发明的主要原理为:设计6条特异引物，依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在恒温条件下不停地自我循环。LAMP扩增分两个阶段:第I阶段为起始阶段:任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的Flc与此单链上的Fl为互补结构，自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板，下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的Fl区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。第2阶段是扩增循环阶段:以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合，开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的BI区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA。BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增，且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。该循环反应可使靶DNA累积到IO9-1Oltl拷贝。扩增结果通过荧光染料染色肉眼观察。
[0008]本发明涉及的胡萝卜环介导等温扩增检测用的引物，其序列如下:(1)上游内引物(FIP):5’_ AACCACCGATGTCGCGATGCCTTTTGTGTGCGGTTGGC-3’ ；
(2)下游内引物(BIP):5’_ GTCGTTGTGTATACCCGCCGCGGGTCACAATCGAAGTGCA-3’ ；
(3)上游外引物(F3):5’- GAAATTGGCCTCCCGTGC-3’ ；
(4)下游外引物(B3):5’- GCTTAAACTCAGCGGGTAGT-3’ ；
(5)上游环引物(FLP):5’- CGTCACCAGAGACTCATTTTTGA-3’ ；
(6)下游环引物(BLP):5’- GGCCCTTGGGCACAGCAAA-3’ ；
在应用中，上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物、上游环引物、下游环引物体积比为:8:8:1:1:4:4 ；
使用上述引物，检测产品中胡萝卜成分的方法，依次包括下列步骤(1) - (3):
(I)待检样品DNA的提取
DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。
[0009](2)胡萝卜环介导等温扩增
A.在反应管中加入IOXBstbuffer反应缓冲液2.5μL (内含200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烧-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1%曲拉通 X-100)、25mmol/L dNTPl.3μL、100mmol/L 硫酸镁 1.5PL、5mol/L 甜菜碱 4μL、10Mmol/L上游内引物2.4gL、10Mmol/L下游内引物2.4pL、10Mmol/L上游外引物0.3μL、10Mmol/L下游外引物 0.3PL、10Mmol/L 上游环引物 1.2PL、10Mmol/L 下游环引物 1.2μL,8υ/μL Bst DNA聚合酶1PL、ddH20 (灭菌双蒸水)2.9μL，混匀；
B.在反应管中加入待检样品DNA4μL (lOOng)，混匀；
C.于恒温水浴上63°C放置40min；
D.将水浴调到85°C中止反应，5min后取出待检。
[0010]扩增时，应设立2个对照:阳性对照(取胡萝卜提取的基因组DNA)、空白对照(不含DNA模板，可以水代替)。
[0011](3)显色检测
在待检的每个反应管中加入?μL显色剂SYBR Green，直接用肉眼观察颜色变化。在阳性对照和空白对照都成立的情况下(即胡萝卜DNA出现扩增，加入显色剂后，扩增反应液颜色变为绿色；空白对照无扩增，加入显色剂后，扩增反应液颜色为橙色)，如果反应管中扩增反应液颜色变为绿色，说明待检样品检出胡萝卜成分，如果颜色为橙色，则说明待检样品中未检出胡萝卜成分。
[0012]本发明根据胡萝卜核糖体RNA基因的保守序列，设计了 2条特异性内引物、2条特异性外引物和2条特异性环引物。该组引物可保证不同食品和饮料中胡萝卜成分的检出。使用该组引物，采用环介导等温扩增技术，可灵敏、特异地检出产品中的胡萝卜成分。该方法不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料肉眼观察即可，简单而快速，特别适用于一些基层单位。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为用胡萝卜环介导等温扩增检测方法检测同属伞形科植物的孜然、香芹、香菜、大茴香、小茴香，常见蔬菜青椒、黄瓜、菜花、圆白菜、洋葱以及常见食品花生、牛奶、大豆、小麦、鸡蛋、猪肉、牛肉DNA，上述样品的显色反应，图中管I为阳性对照(胡萝卜DNA)显色结果。管2为空白对照(水)的显色结果；管3-管19依次为孜然、香芹、香菜、大茴香、小茴香、青椒、黄瓜、菜花、圆白菜、洋葱、花生、牛奶、大豆、小麦、鸡蛋、猪肉、牛肉的显色结果。
[0014]图2为用胡萝卜环介导等温扩增检测方法检测不同含量胡萝卜成分DNA溶液的显色反应。图中管I为空白对照(水)的显色结果。管2-管7依次为含10%、1%、0.1%、0.01%、
0.001%,0.0001%胡萝卜成分DNA溶液的显色结果。
[0015] 图3为用胡萝卜环介导等温扩增检测方法检测米粉样品DNA，样品的显色反应。图中管I为阳性对照(胡萝卜DNA)的显色结果，管2为空白对照(水)的显色结果，管3为米粉样品的显色结果。
[0016]图4为用胡萝卜环介导等温扩增检测方法检测面条样品DNA，样品的显色反应。图中管I为阳性对照(胡萝卜DNA)的显色结果，管2为空白对照(水)的显色结果，管3为面条样品的显色结果。
【具体实施方式】
[0017]下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0018]实施例1
按照以下程序进行检测:
(I)非胡萝卜样品DNA的提取
A.称取0.1g样品，转至1.5mL离心管中。加入600μL预热的裂解缓冲液，轻轻混匀后，65°C水浴保温IOmin ；
B.在管中加入等体积酚/氯仿600μL，上下颠倒充分混匀，抽提2min；
C.12000g离心5min,吸取上清到一新的离心管中,加入与上清等体积的沉淀液,混匀，常温放置IOmin后，12000g离心5min,去上清,保留沉淀；
D.在沉淀中加入60μLRNA酶，37°C放置2min后，用枪头将其充分混匀，于37°C溶解沉淀，5min后加入300μL缓冲液，上下颠倒混匀10次；
Ε.取出离心柱，将离心柱放置在I个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min ；
F.将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加入200μL洗液，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
G.在离心柱中加入200μL70%乙醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
H.12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液；
1.将离心柱放置在一个新的1.5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50μL洗脱缓冲液，37°C放置2min后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作LAMP反应的模板。
[0019](2)非胡萝卜样品DNA的环介导等温扩增:
A.在反应管中加入IOXBst buffer反应缓冲液2.5μL (内含200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烧-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1%曲拉通 X-100)、25mmol/L dNTPl.3μL、100mmol/L 硫酸镁 1.5PL、5mol/L 甜菜碱 4μL、10Mmol/L上游内引物2.4gL、10Mmol/L下游内引物2.4pL、10Mmol/L上游外引物0.3μL、10Mmol/L下游外引物 0.3PL、10Mmol/L 上游环引物 1.2PL、10Mmol/L 下游环引物 1.2μL,8υ/μL Bst DNA聚合酶1PL、ddH20 (灭菌双蒸水)2.9μL，混匀；B.在反应管中加入待检样品DNA4ML，混勾；
C.于恒温水浴上63°C放置40min；
D.将水浴调到85°C中止反应，5min后取出待检。
[0020](3)加入显色剂SYBR Green,显色检测
管3-管19，即孜然、香芳\香菜、大茴香、小茴香、青椒、黄瓜、菜花、圆白菜、洋葱、花生、牛奶、大豆、小麦、鸡蛋、猪肉、牛肉DNA均无扩增，反应液颜色为橙色；阳性对照管管1(胡萝卜基因组DNA作为反应模板)反应液颜色为绿色、空白对照管管2 (以水作为反应模板)反应液颜色为橙色，见图1。
[0021]该组引物，经在线BLAST的结果证实，具有很高的特异性，不会与其他物种发生交叉反应。胡萝卜为伞形科植物，因此在特异性实验中特别选择同属伞形科的孜然、香芹、香菜、大茴香、小茴香，以及其他常见食品青椒、黄瓜、花生、牛奶、大豆、小麦、鸡蛋DNA等进行实验。经验证，除胡萝卜基因组DNA出现阳性扩增，反应液颜色变为绿色外，其他物种均无扩增，反应液颜色为橙色，与预期相符，表明该组引物有良好的特异性，与上述物种没有交叉反应。
[0022]实施例2
按照以下程序进行检测:
(I)不同含量胡萝卜样品DNA的提取
A.将胡萝卜和大豆，加入液氮，研磨成粉末状后，各称取0.1 g，转至1.5mL离心管中。加入600μL预热的裂解缓冲液，轻轻混匀后，65°C水浴保温IOmin ；
B.在管中加入等体积酚/氯仿600μL，上下颠倒充分混匀，抽提2min；
C.将胡萝卜和大豆样品的DNA抽提缓冲液按比例(10%,1%，0.1%，0.01%, 0.001%,
0.0001%)进行混合；
D.加入与上清等体积的沉淀液，混匀，常温放置IOmin后，12000g离心5min，去上清，保留沉淀；
E.在沉淀中加入60μLRNA酶，37°C放置2min后，用枪头将其充分混匀，于37°C溶解沉淀，5min后加入300μL缓冲液，上下颠倒混匀10次；
F.取出离心柱，将离心柱放置在I个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min ；
G将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加入200μL洗液，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
H.在离心柱中加入200μL70%乙醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
1 .12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液；
J.将离心柱放置在一个新的1.5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50μL洗脱缓冲液，37°C放置2min后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作LAMP反应的模板。
[0023](2)不同含量胡萝卜样品DNA的环介导等温扩增:
A.在反应管中加入IOXBst buffer反应缓冲液2.5μL (内含200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烧-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1%曲拉通 X-100)、25mmol/L dNTPl.3μL、100mmol/L 硫酸镁 1.5PL、5mol/L 甜菜碱 4μL、10Mmol/L上游内引物2.4gL、10Mmol/L下游内引物2.4pL、10Mmol/L上游外引物0.3μL、10Mmol/L下游外引物 0.3PL、10Mmol/L 上游环引物 1.2PL、10Mmol/L 下游环引物 1.2μL,8υ/μL Bst DNA聚合酶1PL、ddH20 (灭菌双蒸水)2.9μL，混匀；
B.在反应管中加入待检样品DNA4ML，混勾；
C.于恒温水浴上63°C放置40min；
D.将水浴调到85°C中止反应，5min后取出待检。
[0024](3)加入显色剂SYBR Green,显色检测
管2-管6，即胡萝卜含量为10%、1%、0.1%、0.01%,0.001%的DNA样品均出现阳性扩增，反应液颜色变为绿色；空白对照管管I (以水作为反应模板)反应液颜色为橙色，见图2。
[0025]胡萝卜样品取0.lg，提取得到的核酸浓度为103.2ng/yL。检测中使用4yL，据此可计算出，当DNA抽提缓冲液中的胡萝卜成分含量为0.001%，胡萝卜成分DNA总量为4.128pg，即该方法的绝对检测限为4.128pg。
[0026]实施例3
按照以下程序进行检测:
(I)待测米粉样品DNA的提取
A.称取0.1g米粉，转至1.5mL离心管中。加入600μL预热的裂解缓冲液，轻轻混匀后，65°C水浴保温IOmin ；
B.在管中加入等体积酚/氯仿600μL，上下颠倒充分混匀，抽提2min；
C.12000g离心5min,吸取上清到一新的离心管中，加入与上清等体积的沉淀液,混匀，常温放置IOmin后，12000g离心5min,去上清,保留沉淀；
D.在沉淀中加入60μLRNA酶，37°C放置2min后，用枪头将其充分混匀，于37°C溶解沉淀，5min后加入300μL缓冲液，上下颠倒混匀10次；
Ε.取出离心柱，将离心柱放置在I个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min ；
F.将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加入200μL洗液，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
G.在离心柱中加入200μL70%乙醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
H.12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液；
1.将离心柱放置在一个新的1.5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50μL洗脱缓冲液，37°C放置2min后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作LAMP反应的模板。
[0027](2)待测米粉样品DNA的环介导等温扩增
A.在反应管中加入IOXBstbuffer反应缓冲液2.5μL (内含200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烧-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1%曲拉通 X-100)、25mmol/L dNTPl.3μL、100mmol/L 硫酸镁 1.5PL、5mol/L 甜菜碱 4μL、10Mmol/L上游内引物2.4gL、10Mmol/L下游内引物2.4pL、10Mmol/L上游外引物0.3μL、10Mmol/L下游外引物 0.3PL、10Mmol/L 上游环引物 1.2PL、10Mmol/L 下游环引物 1.2μL,8υ/μL Bst DNA聚合酶1PL、ddH20 (灭菌双蒸水)2.9μL，混匀；
B.在反应管中加入待检样品DNA4μL (100ng)，混匀；
C.于恒温水浴上63°C放置40min；
D.将水浴调到85°C中止反应，5min后取出待检。[0028](3)加入显色剂SYBR Green,显色检测
样品管管3反应液颜色变为绿色，见图3。阳性对照管管I (以胡萝卜基因组DNA作为反应模板)反应液颜色变为绿色、空白对照管管2 (以水作为反应模板)反应液颜色为橙色，结果均正常，据此可判定该样品检出胡萝卜成分。
[0029]实施例4
按照以下程序进行检测:
(I)待测面条样品DNA的提取
A.取面条适量，磨碎后，称取0.1g转至1.5mL离心管中。加入600μL预热的裂解缓冲液，轻轻混匀后，65°C水浴保温IOmin ； B.在管中加入等体积酚/氯仿600μL，上下颠倒充分混匀，抽提2min；
C.12000g离心5min,吸取上清到一新的离心管中，加入与上清等体积的沉淀液,混匀，常温放置IOmin后，12000g离心5min,去上清,保留沉淀；
D.在沉淀中加入60μLRNA酶，37°C放置2min后，用枪头将其充分混匀，于37°C溶解沉淀，5min后加入300μL缓冲液，上下颠倒混匀10次；
Ε.取出离心柱，将离心柱放置在I个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min ；
F.将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加入200μL洗液，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
G.在离心柱中加入200μL70%乙醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
H.12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液；
1.将离心柱放置在一个新的1.5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50μL洗脱缓冲液，37°C放置2min后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作LAMP反应的模板。
[0030](2)待测面条样品DNA的环介导等温扩增
A.在反应管中加入IOXBstbuffer反应缓冲液2.5μL (内含200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烧-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1%曲拉通 X-100)、25mmol/L dNTPl.3μL、100mmol/L 硫酸镁 1.5PL、5mol/L 甜菜碱 4μL、10Mmol/L上游内引物2.4gL、10Mmol/L下游内引物2.4pL、10Mmol/L上游外引物0.3μL、10Mmol/L下游外引物 0.3PL、10Mmol/L 上游环引物 1.2PL、10Mmol/L 下游环引物 1.2μL,8υ/μL Bst DNA聚合酶1PL、ddH20 (灭菌双蒸水)2.9μL，混匀；
B.在反应管中加入待检样品DNA4μL (100ng)，混匀；
C.于恒温水浴上63°C放置40min；
D.将水浴调到85°C中止反应，5min后取出待检。
[0031](3)加入显色剂SYBR Green,显色检测
样品管管3反应液颜色为橙色，见图4。阳性对照管管I (以胡萝卜基因组DNA作为反应模板)反应液颜色变为绿色、空白对照管管2 (以水作为反应模板)反应液颜色为橙色，结果均正常，据此可判定该样品未检出胡萝卜成分。
【权利要求】
1.一种环介导等温扩增技术快速检测胡萝卜成分用的引物组，包括内引物、外引物和环引物，其特征在于: 上游内引物序列为:5’- AACCACCGATGTCGCGATGCCTTTTGTGTGCGGTTGGC -3’， 下游内引物序列为:5’_ GTCGTTGTGTATACCCGCCGCGGGTCACAATCGAAGTGCA -3’， 上游外引物序列为:5’_ GAAATTGGCCTCCCGTGC -3’， 下游外引物序列 为:5’_ GCTTAAACTCAGCGGGTAGT -3’， 上游环引物序列为:5’_ CGTCACCAGAGACTCATTTTTGA -3’， 下游环引物序列为:5’_ GGCCCTTGGGCACAGCAAA -3’。
【文档编号】C12N15/11GK103937900SQ201410183954
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月26日 优先权日:2014年4月26日
【发明者】孙敏, 肖西志, 邓明俊, 高宏伟 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心