结核分枝杆菌核酸快速检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种结核分枝杆菌核酸快速检测试剂盒及检测方法。本发明选取针对结核分枝杆菌特有的基因序列保守区段设计四条特异性引物，结合DNA聚合酶在恒温条件下完成靶基因序列的扩增，从而实现对结核分枝杆菌的快速检测，应用于痰液或拭子样本中结核分枝杆菌的快速检测。本发明试剂盒程序化了操作步骤，实现了对痰液和拭子样本中结核分枝杆菌的检测，使操作过程简便和可控，检测过程采用闭管检测同时又加入了稳定液防治气溶胶的形成，解决了污染问题，结果更可靠。本发明试剂盒因快速、高敏、操作简单、成本低等优点适合检测现场和基层医疗机构推广应用。
【专利说明】结核分枝杆菌核酸快速检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域中的检测试剂盒，具体地说，本发明涉及一种结核分枝杆菌核酸快速检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]结核分枝杆菌是结核病的病原体。目前结核病已成为严重威胁人类健康的一个重大的全球性公共卫生问题，WHO已把结核病与AIDS、疟疾一起共同列为人类的主要杀手，具有高死亡率，高感染率，底递降率等特点。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，有超过4亿的感染人群。我国现有肺结核病人约500万，每年约有13万人死于该病。据研究，受感染的人群中，10%的人会发展成为结核病。因此，早期诊断、及时治疗是有效控制结核病传播蔓延，恢复结核病患者健康的关键。
[0003]目前，结核病的临床诊断主要根据病史、胸片、痰培养、涂片抗酸染色等结果。其中传统检测方法存在灵敏度低、耗时长等不足，容易对部分患者造成误诊或漏诊。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定的单克隆抗体，否则准确性不够，仅能作为辅助检测手段。因此能否提供快速、高敏、特异、简便、可靠、适合临床应用的检测技术已成为国内外研究的重点。
[0004]分子生物学技术具有灵敏、特异、快速等优点，可以提高病源的检出率，对我国及全球疾病防治有着重要 促进作用。但是目前常用的分子生物手段中，PCR方法检测程序相对复杂，对实验室环境要求较高，同时电泳实验极易产生污染导致假阳性结果的产生；荧光PCR方法解决了污染问题，但因其昂贵的仪器设备也难进行基层医疗机构推广应用。
[0005]在结核分枝杆菌的检测方法中，聚合酶链反应(PCR)技术检测结核分枝杆菌具有敏感性高，特异性强的特点，但该技术在临床应用过程中也存在易交叉污染、耗时长等方面问题，除人为因素外，PCR技术在操作过程必须有高精密的温度循环装置；而荧光定量PCR虽然具有引物和探针的双重特异性，与传统PCR相比，在对结核分枝杆菌检测的特异性上大为提高，但其检测也易出现假阳性，并需要昂贵的仪器，成本高，加大推广应用难度。所以，及时应用生物技术的最新成果开发一种适于临床推广的结核分枝杆菌检测试剂盒具有重要意义。
[0006]环介导等温扩增技术(LAMP)是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术，由Notomit等于2000年建立。该技术通过识别靶序列上6个特异区域和一种具有链置换的DNA聚合酶，在恒温条件实现靶序列快速、高敏、特异的扩增。该技术又因其不需要昂贵高精密的温度循环装置，只需在一个恒定的温度下完成操作，大大降低了成本同时也节省了时间，更适合推广应用。显然，开发结核分枝杆菌快速、高敏、特异、可靠、适合临床应用的一种试剂盒是非常必要的。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌核酸快速检测试剂盒及检测方法，以克服现有技术特异性、灵敏性不高以及实验污染不易控制的缺点，实现了结核分枝杆菌检测过程的简单化、标准化、规范化、快速化。
[0008]本发明的另一目的是提供一种检测试剂盒供现场检测和基层医院使用。
[0009] 首先，本发明选取针对结核分枝杆菌特有基因序列保守区段设计四条特异性引物，结合DNA聚合酶在恒温条件下实现靶基因序列的扩增，从而实现对结核分枝杆菌的检测。
[0010]本发明选取结核分枝杆菌复合群的保守基因片段，同时又参考卡介苗基因组序列进行生物信息学分析，选取特定基因片段做为靶基因序列设计四条专用引物。该基因片段因其高度保守，并广泛存在于结核分枝杆菌复合菌群中，而在卡介苗基因组序列中不存在该基因片段，因此该基因序列的选取既可以检测出结核分支杆菌复合菌群所有菌种，又成功的区别开了结核分枝杆菌自然感染和人工卡介苗免疫，避免了人工卡介苗免疫假阳性的产生，使检测结果更可靠。
[0011]为进一步缩短检测时间、简化检测步骤，本发明对该检测试剂盒进行了优化。首先对痰液或拭子的处理方法进行了优化，并采用煮沸法进行核酸提取(裂解液中含有NP-40)，大大缩短了样本核酸制备时间。
[0012]本发明还解决了核酸检测易污染的问题，所采用的技术方案是闭管式预装核酸染料检测法。本发明采用的检测管内置扩增反应液和核酸染料，反应结束后上下反复震荡，在不打开管盖的条件下实现扩增反应液与核酸染料的混合，同时检测管内还添加了稳定液防止扩增反应过程中气溶胶的形成，实现双重保护，有效的消除了污染风险。
[0013]本发明的结核分枝杆菌核酸快速检测试剂盒包括:
(1)洗涤管，内装样本洗涤液；
(2)裂解管，内装样本裂解液；
(3)检测管，内装扩增反应液、核酸染料和稳定液，检测管每8管一组密封于铝箔袋中；扩增反应液由以下组份组成:扩增引物的外引物F3和B3各0.1~0.4 μ Μ,扩增引物的内引物 FIP 和 BIP 各 I ~2 μ M，dATP、dTTP、dCTP、dGTP 各 0.8 ~2.0mM, MgC124 ~10mM，Betaine0.6 ~1.2M, Tris-HCllO ~40mM，KCllO ~20mM，MgS041 ~4mM，(NH4)2S046 ~12mM, Triton X-1000.05%~1.0%，Bst DNA聚合酶8~20U ;核酸染料为分子生物学中常用的染料，包括GeneFinder?、SYBR Green或GelRed等；且核酸染料预先粘附于检测管的管盖内侧中央位置或检测管的管壁内侧上方；稳定液成份是石蜡油。
(4)阴性核酸管，内装无结核分枝杆菌基因非传染DNA片段的阴性溶液；
(5)阳性核酸管，内装有结核分枝杆菌基因非传染DNA片段的阳性溶液；
上述结核分枝杆菌核酸快速检测试剂盒中所述的扩增引物是根据结核分枝杆菌特有基因而设计的，其核苷酸序列如下:
外引物 F3:CGCAATCCAGGGAAATGTCA
外引物 B3:CCCAGTGACGTTGCCTTC
内引物 FIP:ACGCCTCCGAACCGCTACCTTTTCCTCCTTGACGAGGGGAAG
内引物 BIP:AATGGGACGCCACGGCTACCTTTTCATTGCCTGACCGGCTT
[0014]用本发明上述核酸快速检测试剂盒检测痰液或拭子样本中结核分枝杆菌的方法，按下列步骤进行:(1)样本处理，估计痰液样本的量，加入2-4倍体积的4%的NaOH溶液，充分混匀，室温静置液化10min-20min,使其充分液化；拭子样本直接保存于拭子保存液中；
(2)样本洗涤，取液化的痰液(或拭子冲洗液)样本转移到离心管中，离心去除上清液收集沉淀，用样本洗涤液洗涤沉淀，离心收集沉淀；
(3)核酸提取，用样本裂解液重悬上述沉淀，混匀，100°C温浴裂解5-15min，立即置于冰上，然后离心，上清液即为样本模板DNA ；
(4)加样反应，取出检测管，分别标记阴性对照管、检测管和阳性对照管，依次分别加入阴性溶液、步骤(3)上清液和阳性溶液，60 - 65°C条下件保温30-60min ；
(5)染料混合，上述步骤完成后，将上述阴性对照管、检测管和阳性对照管向下甩动，使管中的扩增反应液与染料充分混合，离心使混合后的液体聚集于管底部；
(6)结果判读，肉眼观察扩增反应液颜色，如果扩增反应液呈现绿色则该表示样本的检测结果为阳性，如果扩增反应液呈现橙黄色则表示该样本的检测结果为阴性。
在上述步骤中，结果判读时应依照阳性对照管扩增反应液应显示为绿色，阴性对照管扩增反应液应显示为橙黄色，否则应判定该实验无效。
[0015]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
[0016]1.本发明的结核分枝杆菌核酸快速检测试剂盒，应用六个区段，四条引物，根据靶基因是否扩增判断靶基因序列的有无，因此具有高特异性，同时特殊靶基因序列的选取，可以区分结核分枝杆菌自然感染和人工卡介苗免疫，本试剂盒对卡介苗的检测结果报告为阴性；2.本发明试剂盒基于恒温扩增技术，实现了试剂盒的快速，高敏特点，在不到I小时内即可完成扩增检测，扩增模板仅需很少；3.本发明试剂盒对痰液样本和拭子样本中的核酸提取过程分别进行了优化，使操作步骤简单化，规范化；4.本发明试剂盒只需在温度恒定的设备中就能进行反应，不需要特殊设备要求，降低了检测本低，核酸染料的添加使检测结果肉眼即可判读，结果更加明显可靠；5.本发明试剂盒的整个检测过程在全封闭不开盖状态下进行，同时又添加了稳定液，使得待测样本的反应和结果判读过程均在物理封闭条件下完成(PCR管盖和稳定液双重保护)，所以本试剂盒有效的防止实验室扩增物交叉污染，防止假阳性结果的产生，适于现场检测和基层医院使用。
[0017]综上，本发明试剂盒将核酸提取、DNA扩增和结果判读有机地融为一体，实现了检测过程的简单化、快速化、程序化和标准化便于普及推广。本发明试剂盒具有比PCR方法更高的灵敏性和特异性，检测快速且成本低，检测过程中摆脱了对大型仪器的依赖，特别适合现场检测和基层医院使用；整个检测过程是在闭管全封闭不开盖的状态下进行同时添加了稳定液，起到防止交叉污染和防止假阳性的结果产生，大大提高了检测结果的可靠性。本发明可以实现对结核分枝杆菌的早期预测，对该疾病的防控意义重大，而具有很高的推广和应用价值。
【具体实施方式】
[0018]以下通过实施例对本发明作进一步说明。
[0019]实施例1结核分枝杆菌核酸快速检测试剂盒 本发明的试剂盒由以下部件组成
(I)洗涤管，I个，内装样本洗涤液；(2)裂解管，I个，内装样本裂解液；
(3)检测管，内装扩增反应液、核酸染料和稳定液，检测管每8管一组密封于铝箔袋中。扩增反应液由以下组份组成:扩增引物的外引物F3和B3各0.1~0.4 μ Μ,扩增引物的内引物 FIP 和 BIP 各 I ~2 μ M，dATP、dTTP、dCTP、dGTP 各 0.8 ~2.0mM, MgC124 ~10mM，Betaine0.6 ~1.2M, Tris-HCllO ~40mM，KCllO ~20mM，MgS041 ~4mM，(NH4) 2S046 ~12mM, Triton X-1000.05%~1.0%，Bst DNA聚合酶8~20U ;核酸染料为分子生物学中常用的染料，包括GeneFinder?、SYBR Green或GelRed等；且核酸染料预先粘附于检测管的管盖内侧中央位置或检测管的管壁内侧上方；稳定液成份是石蜡油。
引物信息如下:
外引物 F3:CGCAATCCAGGGAAATGTC A
外引物 B3:CCCAGTGACGTTGCCTTC
内引物 FIP:ACGCCTCCGAACCGCTACCTTTTCCTCCTTGACGAGGGGAAG
内引物 BIP:AATGGGACGCCACGGCTACCTTTTCATTGCCTGACCGGCTT
(4)阴性核酸管，I管，内装无结核分枝杆菌基因非传染DNA片段的阴性溶液；
(5)阳性核酸管，I管，内装有结核分枝杆菌基因非传染DNA片段的阳性溶液；
(6)包装盒(I个)，内装一块有多孔的海绵块；
(7)使用说明书，1份。
[0020]实施例2本发明的结核分枝杆菌核酸快速检方法 使用实施例1的检测试剂盒，按如下步骤进行:
(1)样本洗涤，取Iml液化的痰液(或拭子冲洗液)样本转移到离心管中，12，000r/min离心5min去除上清液收集沉淀,用样本洗漆液洗漆沉淀I次，12，000r/min离心5min收集
沉淀；
(2)核酸提取，用^(^!样本裂解液重悬上述沉淀^混匀’^^^温浴裂解^^^^立即置于冰上2min，然后8，000r/min离心5min，上清液即为样本模板DNA ；
(3)加样反应，取出检测管，分别标记阴性对照管、检测管和阳性对照管，依次分别加入阴性溶液、步骤(3)上清液和阳性溶液各2μ 1，65°C条下件保温60min ；
(4)染料混合，上述步骤完成后，将上述阴性对照管、检测管和阳性对照管向下甩动，使管中的扩增反应液与染料充分混合，离心使混合后的液体聚集于管底部；
(5)结果判读，肉眼观察扩增反应液颜色，如果扩增反应液呈现绿色则该表示样本的检测结果为阳性，如果扩增反应液呈现橙黄色则表示该样本的检测结果为阴性。
在上述步骤中，结果判读时应依照阳性对照管扩增反应液应显示为绿色，阴性对照管扩增反应液应显示为橙黄色，否则应判定该实验无效。
[0021]实施例3使用本发明试剂盒检测结核分枝杆菌核酸的灵敏度 分别用本发明试剂盒和常规PCR方法进行鉴定
1、使用实施例1的检测试剂盒，按如下步骤进行:
(1)样本处理，取分离纯化的结核分枝杆菌一次稀释为1.0X106、1.0X105、1.0X 104、1.0X 103、1.0XlO2U.0X 11CFUAiL,每个浓度做 3 个重复；
(2)样本洗涤，分别取分离纯化稀释后的不同梯度浓度的结核分枝杆菌菌液各1ml，转移到离心管中，12，000r/min离心5min去除上清液收集沉淀，用样本洗涤液洗涤沉淀I次，12，OOOr/min离心5min收集沉淀；
(3)核酸提取，用100μI样本裂解液重悬上述沉淀，混匀，100°C温浴裂解lOmin，立即置于冰上2min，然后8，OOOr/min离心5min，上清液即为样本模板DNA ；
(4)加样反应，取出检测管，分别标记阴性对照管、检测管(1-18号)和阳性对照管，依次分别加入阴性溶液、步骤(3)上清液和阳性溶液各2μ 1，65°C条下件保温60min ；
(5)染料混合，上述步骤完成后，将上述阴性对照管、检测管和阳性对照管向下甩动，使管中的扩增反应液与染料充分混合，离心使混合后的液体聚集于管底部；
(6)结果判读，肉眼观察扩增反应液颜色，表明阴性对照管扩增反应液为橙黄色，阳性对照管扩增反应液为绿色；检测管17号扩增反应液为橙黄色结果判读为阴性；其他检测管扩增反应液均为绿色，结果判读为阳性。
2、使用常规PCR检测试剂盒
(I)样本处理，样本洗涤，核酸提取与实施例1中步骤一致；
⑵PCR引物，反应采用本方法反应中的外引物F3和B3 ；
(3)PCR反应，PCR体系为25μI体系，反应液由以下组份组成=IOXPCRbuffer2.5 μ I (PCR 反应缓冲液，TAKARA 公司)，IOmM dNTPs2 μ I (TAKARA 公司)，引物 F3 和B3各Iul，Taq酶0.15 μ I (5U/μ 1，TAKARA公司)，模板DNA2 μ 1，最后用灭菌水补至25 μ I体积。
(4)反应程序，95°C预变性5min;95°C变性30S，58°C退火30S，72°C延伸30S，30个循环；72°C延伸 IOmin0
(5)PCR产物取10μ I与I %琼脂糖凝胶电泳，100V电压30min，观察；结果显示，PCR检测方法检测样本浓度为1.0X102、1.0xio1CFUAiL无目的条带的扩增，结果判读为阴性；其他样本浓度都有目的条带的扩增结果为阳性。
由以上两种方法比较可以看出，本发明的核酸快速检测试剂盒灵敏度可到达1.0X 11CFUAiL的浓度，而常规PCR检测方法的灵敏度为1.0X 103CFU/mL的浓度为阳性，
1.0X 102CFU/mL以及以下浓度结果均显示为阴性，经对比，本发明的核酸快速检测试剂盒灵敏度明显高于PCR方法的灵敏度，能检测出更低浓度含量的样本。
[0022]实施例4用本发明试剂盒检测结核分枝杆菌的特异性
根据实施例3的方法,分别对分离纯化的结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌进行鉴定。
检测结果显示，鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌检测管扩增反应液均为橙黄色，即结果判读为阴性；结核分枝杆菌的检测管扩增反应液为绿色，结果判读为阳性。本结果与常规PCR结果一直，显示出良好的特异性。
[0023]本发明所需的试剂和材料:引物由上海生物工程有限责任公司合成；甜菜碱(betaine)、dNTP、KCl、MgS04、(NH4)2S04、MgCl2, NP-40、购自上海生物工程有限责任公司；购自国药集团化学试剂北京有限公司；恒温扩增用的BstDNA聚合酶购自NEB公司；核酸染料Genef inder?购自厦 门百维信生物科技有限公司。
【权利要求】
1.一种结核分枝杆菌核酸快速检测试剂盒，其特征在于该检测试剂盒包括: (1)洗涤管，内装样本洗涤液； (2)裂解管，内装样本裂解液； (3)检测管，内装扩增反应液、核酸染料和稳定液，检测管每8管一组密封于铝箔袋中； (4)阴性核酸管，内装无结核分枝杆菌基因非传染DNA片段的阴性溶液； (5)阳性核酸管，内装有结核分枝杆菌基因非传染DNA片段的阳性溶液。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于上述的核酸染料为分子生物学中常用的染料，包括 GeneFinder?、SYBR Green 或 GelRed。
3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于上述检测管内核酸染料预先粘附于检测管的管盖内侧中央位置或检测管的管壁内侧上方。
4.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于上述的扩增反应液由以下组份组成:扩增引物的外引物F3和B3各0.1~0.4 μ M，扩增引物的内引物FIP和BIP各I~2 μ Μ，dATP、dTTP、dCTP、dGTP 各 0.8 ~2.0mM，MgC124 ~10mM，Betaine0.6 ~1.2M, Tris-HCllO ~40mM, KCllO ~20mM ，MgS041 ~4mM，(NH4) 2S046 ~12mM，Triton X-1000.05%~1.0%，Bst DNA聚合酶8~20U。
5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于扩增反应液中扩增引物依据结核分枝杆菌east基因而设计的引物。
6.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于扩增反应液中扩增引物的核酸序列如下:
外引物 F3:CGCAATCCAGGGAAATGTCA
外引物 B3:CCCAGTGACGTTGCCTTC
内引物 FIP:ACGCCTCCGAACCGCTACCTTTTCCTCCTTGACGAGGGGAAG
内引物 BIP:AATGGGACGCCACGGCTACCTTTTCATTGCCTGACCGGCTTo
7.权利要求1所述的检测试剂盒应用于痰液或拭子样本中结核分枝杆菌的检测。
8.使用权利要求1所述试剂盒检测结核分枝杆菌的方法，其特征在于该试剂盒的检测方法包括如下步骤: (1)样本处理，估计痰液样本的量，加入2-4倍体积的4%的NaOH溶液，充分混匀，室温静置液化10min-20min,使其充分液化；拭子样本直接保存于拭子保存液中； (2)样本洗涤，取液化的痰液或拭子冲洗液样本转移到1.5ml离心管中，离心去除上清液收集沉淀，用样本洗涤液洗涤沉淀，离心收集沉淀； (3)核酸提取，用样本裂解液重悬上述沉淀，混匀，100°C温浴裂解5-15min，立即置于冰上，然后离心，上清液即为样本模板DNA ； (4)加样反应，取出检测管，分别标记阴性对照管、检测管和阳性对照管，依次分别加入阴性溶液、步骤(3)上清液和阳性溶液，60-65°C条件下保温30-60min ; (5)染料混合，上述步骤完成后，将上述阴性对照管、检测管和阳性对照管向下甩动，使管中的扩增反应液与染料充分混合，离心使混合后的液体聚集于管底部； (6)结果判读，肉眼观察扩增反应液颜色，如果扩增反应液呈现绿色则该表示样本的检测结果为阳性，如果扩增反应液呈现橙黄色则表示该样本的检测结果为阴性。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于阳性对照管扩增反应液应显示为绿色，阴性对照管扩增反应液应显示为橙黄色，否则应判定该实验无效 。
【文档编号】C12M1/34GK103937666SQ201410185161
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年5月4日 优先权日:2014年5月4日
【发明者】杨帆, 邓旭, 王明儒, 王佳丽, 石中强, 刘万建, 杨致亭, 侯继胜 申请人:青岛汉唐生物科技有限公司