一种同步检测四种苹果病毒的方法
【专利摘要】本发明涉及一种同步检测四种苹果病毒的方法。以带有叶芽苹果一年生枝条顶端0～5cm皮层组织或组培苗叶片组织为试材，采用TRIzol法提取组织总RNA，以总RNA为模板，六碱基随机引物进行cDNA合成，以四种病毒特异性引物及内源基因引物进行多重PCR反应。根据琼脂糖凝胶电泳中扩增条带大小判断组织携带病毒情况。判断标准为：未扩增出内源基因特异性片段即代表实验失败；扩增出内源基因特异性片段即代表苹果组织总RNA提取质量符合要求；扩增出内源基因特异性片段及任意病毒特异性片段即代表组织中带有该病毒；扩增出内源基因特异性片段，未扩增出任何病毒特异性片段即代表组织中不带有任何病毒。
【专利说明】—种同步检测四种苹果病毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种同步检测四种苹果病毒的方法。
【背景技术】
[0002]苹果病毒病在世界各地广泛分布，我国各苹果产区普遍存在，树体受到病毒危害后，病毒在寄主细胞内寄生并增殖，破坏干扰树体的正常生理机能，严重影响果树的生长，降低产量、品质、果品的贮藏性和耐运力，也影响苹果根系对土壤营养物质的吸收和利用。
[0003]苹果病毒病主要通过嫁接途径传染，在长期的无性繁殖过程中，病毒在植物体内积累和传播，用带毒树的任何部位做繁殖材料，其后代均带毒，造成病毒病害日益严重。在当今技术水平下，苹果病毒病尚无有效的防治药剂，采用脱毒方法，繁殖无病毒苗木，加强植物检疫是防治病毒病的有效途径之一。我国对苹果病毒病的研究起步较晚，自1978年从国外引进病毒指示植物才开始对苹果病毒病进行系统研究，目前已初步明确了我国苹果主产区病毒病的种类、分布，并在病毒检测方面取得一定的进展，获得了一些品种的无病毒苗木，但真正应用到生产实践中的脱毒源种微乎其微。脱除病毒是果树无毒化的基础，准确、灵敏、快速的病毒检测技术既是果树无毒化栽培的关键环节也是基本保障。
[0004]苹果病毒大多为潜隐性病毒，在常规品种不表现明显症状，其具有在树体中含量低、分布不均、分布受外界因素影响大、组织富含多糖、多酚的特点，目前，准确、快速、灵敏的苹果病毒检测技术还有待进一步完善。多重RT-PCR可同时检测侵染同一植株的多种病毒，大大缩短检测时间，同时减少检测费用。苹果病毒复合侵染现象普遍，因此，多重RT-PCR技术在苹果病毒检测中具有广泛的应用前景。
[0005]多重RT-PCR在国内外已有应用于果树病毒检测的报道，但同时检测四种苹果病毒的方法鲜有报道，加上病毒具有基因组变异快的特点，本发明针对我国四种主要苹果病毒多重RT-PCR方法的开发将为更好的繁育无毒苗木和病毒检疫奠定基础，为今后苹果病毒病的有效防治提供理论依据，从而促进我国苹果产业的发展。
【发明内容】
[0006]本发明建立了一套能够同时检测苹果四种病毒的多重RT-PCR技术体系。
[0007]本发明所采用的技术方案是:通过提取苹果组织总RNA，采用四种病毒及一种苹果内源基因的特异性引物，通过多重RT-PCR方法扩增各病毒及苹果内源基因特异性序列，苹果内源基因可以起到排除假阴性对照的作用，最后通过凝胶电泳观察扩增产物大小，判定组织中所带病毒种类。
[0008]本发明的具体内容，即同时检测四种苹果病毒的具体方法如下:
(I)苹果组织总RNA的提取田间样本采取带有叶芽一年生枝条顶端(T5cm皮层组织、组培苗采取叶片组织，采用Trizol法提取组织总RNA，定容于30 μ L除RNase水中，-80°C保存备用。
[0009] (2)病毒特异性基因序列的扩增以步骤(1)获得的总RNA为模板，进行多重RT-PCR得到扩增产物。引物为:第I对引物:ASPV-F:5’_T GGAACCTCATGCTGC A-3’ ；ASPV-R:5’-T TGGGATCAACTTTACTAAAAAGCATA A~3f。第 2 对引物:ASGV-F:5’-GAGGATTTAGGTCCCTCT C_3’ ；ASGV-R:5’ -GTATAAAGGCAGGCATGTCAAC C_3’。第 3 对引物:ApMV_F:5，-CAACCGAGAGGTTGGC A~3f ；ApMV-R j’-TTCTAGCAGGTCTTCATCGA-3’。第 4 对引物:ACLSV-F:5’ -G AGAGTTTCAGTTTGCTAGAC A_3’ ；ACLSV-R:5’-G CAAATTCAGTCTGTAAAA G_3’。第 5 对苹果内源基因引物:EFl-a-V:5’ -A CCAACCTTGACTGGTACAAG G~3f -,EF卜 a -认:5’ -TGGTGCATCTCAACAGAC T_3，。
[0010](3)琼脂糖凝胶电泳检测取8yL PCR扩增产物，用含0.Syg.mr1溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶在I X TAE缓冲液中进行电泳分析，120V电泳40分钟，根据电泳条带大小判断病
毒种类。
[0011]3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于四种苹果病毒特异性片段大小为:苹果莖痕病毒stem pitting virus, ASPV) 360 bp、苹果莖沟病毒stemgrooving virus, ASGV) 821 bp、苹果花叶病毒(々7/?7<9 mosaic virus, ApMV) 161 bp、苹果裡绿叶斑病毒(々少7(9 chlorotic leafspot virus, ACLSV) 566 bp,苹果内源基因 EF1_ α特异性片段大小为236 bp。
[0012]本发明专利的有益效果是，通过设计可明显区分四种苹果病毒的特异性引物及能够排除假阴性样本的内源基因引物，进行检测体系及程序的优化，建立了一套同步检测四种苹果病毒的检测技术，避免了普通PCR检测的多次重复工作，检测稳定性好，特异性强，可应用于田间苹果样本及组培苗带毒情况的快速检测，从而指导苹果病毒病害防控措施的制定，减少病害造成的损失。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是带毒样本经多重RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳效果图片。
【具体实施方式】
[0014]以带有叶芽苹果一年生枝条顶端0-5 cm皮层组织或组培苗叶片组织为试材，取50mg组织，在液氮中迅速研磨，加0.5 mL提取试剂(400 μ L RNA提取试剂+100 μ LP -巯基乙醇)进行提取，最后加入30 UL DEPC水充分溶解RNA。然后以六碱基随机引物为引物，以M-MLV为反转录酶进行cDNA合成，以合成的cDNA为模板，配制以下PCR反应体系:cDNA 4.0μ L, ASGV-F 0.6 μ L, ASGV-R 0.6 μ L, ASPV-F 0.2 μ L，ASPV-R 0.2 μ L，ACLSV-F 0.6μ L, ACLSV-R 0.6 μ L, ApMV-F 0.5 μ L, ApMV-R 0.5 μ L, EFl- α -F 0.05 μ L, EFl- α -R
0.05 μ L,2XES Taq 12.5 μ L，用dd2H20水补足25 μ L。按照以下程序进行PCR:预变性 94°C2 min ;35 个循环 :94°C 变性 I min，55°C 退火 I min，72°C 延伸 I min ;72°C 终延伸 7min。取8 UL PCR扩增产物，用含0.5 μ g.ml—1溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶在I XTAE缓冲液中进行电泳分析，120V电泳40分钟，根据电泳条带大小判断病毒种类。四种苹果病毒特异性片段大小分别为:ASPV 360 bp、ASGV 821 bp、ApMV 161 bp、ACLSV 566 bp,BFl-α236 bp ο
【权利要求】
1.一种同步检测四种苹果病毒的方法，其特征在于通过提取苹果组织总RNA，采用四种病毒及一种苹果内源基因的特异性引物，通过多重RT-PCR方法扩增各病毒及苹果内源基因特异性序列，凝胶电泳观察扩增产物大小，判定组织中所带病毒种类。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)苹果组织总RNA的提取田间样本采取带有叶芽一年生枝条顶端(T5cm皮层组织，组培苗采取叶片组织，采用Trizol法提取组织总RNA，定容于30 μ L除RNase水中，-80°C保存备用。 (2)病毒特异性基因序列的扩增以步骤(1)获得的总RNA为模板，进行多重RT-PCR得到扩增产物。引物为--第I对引物:ASPV-F:5’-TGGAACCTCATGCTGC A_3’；ASPV-R:5’-T TGGGATCAACTTTACTAAAAAGCATA Α_3’。第 2 对引物:ASGV-F:5’-GAGGATTTAGGTCCCTCT C_3，;ASGV_R:5’ -G T A T A AAGGCAGGCATGTCAAC C_3’。第 3 对引物:ApMV_F:5，-C A A C C G A G AGGTTGGC A-3，; ApMV-R:5，-T TCTAGCAGGT CTTCATCG A_3，。第 4对引物:ACLSV-F:5，-G AGAGTTTCAGTTTGCTAGAC A_3，;ACLSV-R:5，_GCAAATTCAGTCTGTAAAA G_3’。第 5 对苹果内源基因引物-F:5’_ACCAACCTTGACTGGTACAAG G~3f -,EF卜 a -义:5’ -T G G T G C A T C TCAACAGAC T-3，。 (3)琼脂糖凝胶电泳检测取8μ LPCR扩增产物，用含0.5 μ g.πι1溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶在I X TAE缓冲液中进行电泳分析，120V电泳40分钟，根据电泳条带大小判断病毒种类。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于四种苹果病毒特异性片段大小为:苹果茎痘病毒stem pitting virus, ASPV) 360 bp、苹果莖沟病毒stem groovingvirus, ASGV) 821 bp、苹果花叶病毒mosaic virus, ApMY) 161 bp、苹果裡绿叶斑病毒(AppIe chlorotic leafspot virus, ACLSV) 566 bp,苹果内源基因 EFl- α 特异性片段大小为236 bp ο
【文档编号】C12Q1/68GK103966362SQ201410196186
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月12日 优先权日:2014年5月12日
【发明者】王亚南, 曹克强, 赵绪生 申请人:河北农业大学