四川泡菜中一种高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌的制作方法
【专利摘要】本发明为四川泡菜中一种高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌，解决己有短乳杆菌产GABA能力不高的问题。该菌分离于四川泡菜，具有在含谷氨酸钠的培养基中产生γ-氨基丁酸的能力，属于短乳杆菌（Lactobacillusbrevis），菌株保藏号：CGMCC?NO.9029。接种于辐照灭菌的糙米粉中，使糙米粉中γ-氨基丁酸含量提高了5倍。
【专利说明】四川泡菜中一种高产Y-氨基丁酸的短乳杆菌
[0001]【技术领域】:
本发明本发明属于食品生物【技术领域】，涉及泡菜中一种高产Y-氨基丁酸的短乳杆菌。
[0002]【背景技术】:
Y-氨基丁酸(Y- aminobutyric acid,简称GABA)是一种具有生物活性的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质。临床研究表明摄入GABA或者类似物可以降血压，抑制癌细胞生长、刺激癌细胞凋亡，还可以镇静安神，利尿。摄入富含GABA的食品可以有效的改善抑郁、失眠、精神分裂和长期饮酒导致的相关疾病。
[0003]乳酸菌是一类能利用碳水化合物发酵产生大量乳酸的细菌的总称。乳酸菌被广泛用于食品、医药等领域。其在食品发酵过程中可以赋予食品特殊的风味，改进食品的品质和营养的特性。乳酸菌是益生菌的主要来源，经科学研究证实许多乳酸菌是人体肠道固有的益生菌，具有调节肠道菌群、降低血清胆固醇、调节血压、抗氧化、抗癌和增强宿主免疫力等多种生理功能特性。天然食品中GABA含量比较低，传统发酵泡菜含有丰富的乳酸菌资源。
[0004]
【发明内容】
:
本发明的目的是提供 一种从四川自然发酵泡菜水中分离出的具有高产GABA能力的短乳杆菌。
[0005]四川泡菜中一种高产Y-氨基丁酸的短乳杆菌，该菌分离于四川泡菜，具有在含谷氨酸钠的液体培养基中产生Y-氨基丁酸的能力，属于短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)。
[0006]工艺操作步骤为:
本发明短乳杆菌的获得:取回实验室的泡菜水用无菌生理盐水稀释到合适梯度，取ImL稀释液于无菌培养皿中，倾倒固体培养基混匀，培养至出现大量单菌落，挑取菌落，反复划线培养，进行纯化。
[0007]本发明提供的短乳杆菌自编号:p-14，保藏编号为CGMCC N0.9029,2014年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。
[0008]本发明短乳杆菌具有产GABA能力:短乳杆菌P —14接种在液体培养基中，30°C发酵，采用薄层层析定性检测，其具有产GABA能力，用氨基酸自动分析仪测定发酵液中GABA含量达到了 501mg/100g。
[0009]本发明短乳杆菌接种在经辐照灭菌的糙米粉中，30°C发酵3天，使糙米粉中GABA含量达到64.7mg/100g,比未发酵糙米粉提高了 5倍。
[0010]本发明产GABA短乳杆菌具有良好稳定性，连续20次培养，性状稳定，仍具有高产GABA能力。
[0011]本发明的短乳杆菌P— 4分离自四川传统自然发酵泡菜水，未经过人工诱变处理，属于公认安全(Generally Recognized As Safe, GRAS)菌种，可用于食品加工。
[0012]【具体实施方式】:下面对本发明【具体实施方式】做一个详细的说明。
[0013]本发明高产GABA短乳杆菌的分离方法，采用梯度稀释混菌法从四川自然发酵泡菜水中分离。包括以下步骤:将ImL泡菜水用9mL无菌生理盐水进行梯度稀释，稀释到泡菜水浓度为10_6-10_8mL/mL,取ImL稀释液于无菌培养皿中，倾倒固体培养基并混匀，待培养基凝固后，置于30°C培养箱培养48— 96小时，出现大量细菌菌落，挑取具有不同特征的单菌落，在分离培养基上划线纯化，并进一步培养，得到纯菌株。纯化的菌株采用2种方式保藏，①用液体培养基在30°C培养24— 36小时后，在培养好的液体培养基中添加甘油，使甘油终浓度为20% (W/V)，-20°C冻存，每隔I年转接一次;?将菌种穿刺接种在半固体培养基中，30°C培养48小时后，放于4°C冷藏，每隔4个月转接一次。
[0014]本发明的短乳杆菌接种在固体培养基上，30°C培养48小时后，观察菌落特征，菌落较大、圆形、突起，乳白色，表面湿润光滑，边缘整齐，与短乳杆菌形态相似；通过革兰氏染色后在显微镜下观察细胞特征，革兰氏染色阳性，细胞呈短杆状，无芽孢。过氧化氢酶试验阴性，在15°C生长，45°C不生长，氯化钠耐受范围为O — 6%(v/w)，能利用阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、木糖发酵产酸，能缓慢利用蜜二糖产酸，不能发酵苦杏仁苷、纤维二糖、七叶灵、乳糖、甘露醇、甘露糖、松三糖、棉子糖、鼠李糖、核糖、水杨苷、山梨醇、蔗糖、海藻糖。其生理生化特征与短乳杆菌(Lbrevis)最相似，但也存在一定差异，其不能利用七叶灵、核糖、棉子糖产酸，而短乳杆菌标准菌株L.brevis DSM20054能发酵以上三类糖产酸。本发明中短乳杆菌P-14 不能利用核糖产酸，这一性质与产GABA短乳杆菌L.brevis CCTCCM208054不同。本发明中短乳杆菌不能利用甘露糖发酵，与高产GABA短乳杆菌L2保藏号为CCTCCM 209132不同。提取DNA后，用细菌通用引物27F，1492R扩增出其16S rDNA，送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，序列长度为1434bp，与短乳杆菌(L.brevis)相似性高达99%以上。鉴定该菌株为短乳杆菌(L.brevis)。本发明短乳杆菌与Genbank中短乳杆菌相似性为99%以上，而短乳杆菌L.brevis CCTCCM 208054和短乳杆菌CCTCCM 209132与短乳杆菌相似性为97%。
[0015]本发明的高产GABA短乳杆菌产GABA定性检测，采用薄层层析法，具体步骤包括:挑取适量冷藏的菌体接种到5mL液体培养基中，30°C静置发酵48小时，取I μ L发酵液在硅胶薄层层析板上点样，以浓度为0.2% (w/w)的GABA标准溶液、添加有2% (w/w) GABA的液体培养基为对照。展层后于105°C显色5min，拍照。观察薄层层析结果，本发明的高产GABA短乳杆菌发酵液具有与GABA标品相同层析距离的条带。
[0016]本发明的高产GABA短乳杆菌产GABA定量检测，采用氨基酸自动分析仪(塞卡姆
S-433D型)。挑取适量冷藏的菌体划线接种到固体培养基上，待长出单菌落，挑取一个单菌落菌体接种到IOOmL液体培养基中培养10小时，制成活菌体数约为IO8个的种子发酵液，将种子发酵液以2% (v/v)的接种量接种在250mL装有IOOmL液体培养基的三角瓶中，30°C静置发酵72小时，所得发酵液于10000 Xg离心10min，取上清液经0.22 μ m膜过滤后用氨基酸自动分析仪分析其氨基酸组成，以未接种的液体培养基为对照。结果表明本发明的短乳杆菌发酵液中GABA含量达到了 501mg/100g
本发明的短乳杆菌活化后接种到液体培养基中，30°C培养，0D600为1.1—1.2,6000Xg离心5min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤后制成0D600为10左右的浓菌悬液，添加3mL到20g辐照灭菌糙米粉中(糙米粉:无菌水=1: 2;W/V)，30°C静置发酵3三天，以未接种辐照糙米粉作对照，冻干后用氨基酸自动分析仪分析其GABA含量变化，接种发酵糙米粉中GABA含量为65mg/100g，未接种糙米粉中GABA含量为llmg/100g，GABA含量提高了 5倍。
[0017]上述发明中的短乳杆菌保藏编号为=CGMCC N0.9029，保藏单位:保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期:2014年4月9日。
[0018]本发明中的液体培养基配方为:蛋白胨IOg,牛肉粉5g,酵母粉4g,葡萄糖20g,谷氨酸钠10g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g,吐温80ImL,蒸馏水 1000mL, ρΗ6.2 左右。
[0019]本发明中的固体培养基为液体培养基添加1.7 — 2.0% (w/v)琼脂。
[0020]本发明中半固体培养基为液体培养基添加I (w/v)琼脂。
[0021]本发明中薄层层析展层剂组成:正丁醇:冰醋酸:水(V: V: v=4:1: 3)，展层剂中含0.4%茚 三酮。
【权利要求】
1.四川泡菜中一种高产Y-氨基丁酸的短乳杆菌，其特征在于该菌分离于四川泡菜，具有在含谷氨酸钠的培养基中产生Y-氨基丁酸的能力，属于短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)，菌株保藏号:CGMCC N0.9029。
【文档编号】C12R1/24GK103966139SQ201410205013
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月15日 优先权日:2014年5月15日
【发明者】朱宇, 董玲, 姚英政 申请人:四川省农业科学院农产品加工研究所