通过lps刺激建立的大鼠及猪肠道上皮细胞的综合模型的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种通过LPS刺激建立的大鼠及猪肠道上皮细胞的综合模型。细菌脂多糖（LPS）具有破坏肠上皮屏障功能，本发明旨在鉴定来源于蛇的抗菌肽Cathelicidin-BF（C-BF）是否对LPS诱导的肠炎具有保护作用。IPEC-J2是从猪空肠段分离的肠上皮细胞系，猪消化系统与人的非常相似。通过体内大鼠模型和体外猪IPEC-J2细胞模型检测了Cathelicidin-BF保护LPS诱导的肠道屏障功能受损的作用。我们发现，外源Cathelicidin-BF对LPS诱导的大鼠肠道屏障功能受损和LPS致IPEC-J2细胞损伤模型有保护作用。
【专利说明】通过LPS刺激建立的大鼠及猪肠道上皮细胞的综合模型
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域,具体涉及Cathelicidin-BF对脂多糖诱导的大鼠肠上皮屏障功能障碍及脂多糖致猪肠上皮细胞屏障损伤模型的保护作用。
【背景技术】
[0002]在体内小肠黏膜上皮成连续的单层状，它在抵抗微生物引发的胃肠道疾病方面起着关键作用。屏障完整性缺陷，作为黏膜炎性疾病的主要病理生理学特征，导致渗透性增加进而导致水和血浆蛋白的渗漏到管腔，同时肠细菌和/或微生物的副产物移位进入体循环引起全身败血症。因此，维持肠上皮屏障的完整性对于肠道稳态是十分重要的。众所周知，在体内，由革兰氏阴性菌产生细菌内毒素(脂多糖，LPS)导致黏膜通透性增加是由LPS对肠上皮细胞如粘膜缺血的间接作用导致的。通过跨膜电阻(TER)所示，LPS对IEC -6细胞作用是破坏紧密连接蛋白的屏障功能。LPS增加肠上皮细胞的渗透性与肠紧密连接相关蛋白再分配有关。
[0003]体内和体外动物和人体试验研究表明，LPS可能对肠屏障功能和细菌移位造成损害。尽管许多研究已证实LPS对肠道黏膜完整性具有破坏效果，但极少数试验研究有效地应用于临床和非抗生素治疗LPS诱导的肠炎方法。
[0004]Cathelicidins是具有保守的亲肽序列一大抗菌肽家族,首先在哺乳动物被发现。LL-37/hCAP-18是在人类中发现的唯一的抗菌肽，而我们研究中所涉及的抗菌肽C-BF是从爬行动物中首次被发现的Cathelicindin家族抗菌肽。虽然抗菌肽如cathelicidins有杀死病原微生物的活力，但有新的证据显示这些肽在不同的生理过程，如细胞增殖和迁移，免疫调节，促进伤口愈合，血管生成，细胞因子和组胺的释放等具有多个受体介导的功能。在小鼠上，Cathelicidins已被证实可以通过减少肠毒素引起的黏膜结构的改变部分降低艰难梭菌结肠炎和毒素A肠炎。从金环蛇蛇毒纯化得到的Cathelicidin-BF是一个具有30个氨基酸的多肽，具有较高的抗菌活性和非常迅速的微生物杀灭效果。然而，抗菌肽C-BF是否有肠道屏障功能的维护和重建的保护作用从未进行过相关研究。
【发明内容】
[0005]本发明旨在鉴定来源于蛇的抗菌肽Cathelicidin-BF (C-BF)是否对LPS诱导的肠炎有保护作用。
[0006]为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案:
一种通过LPS刺激建立的大鼠及猪肠道上皮细胞的综合模型，研究来源于蛇的抗菌肽Cathelicidin-BF (C-BF)是否对LPS诱导的肠炎有保护作用，
1)对于大鼠，建立5mg/kg剂量脂多糖诱导雄性Sprague-Dawley大鼠肠炎模型,LPS采用腹腔注射的方式。大鼠通过腹腔注射不同浓度(5mg/kg, 10mg/kg, 20mg/kg) C-BF的PBS溶液，注射顺序及时间为先注射不同剂量C-BF，24h后注射5mg/kg的LPS，于4h后处死取样，研究抗菌肽C-BF的保护功能，另一种处理方式为先注射5mg/kg的LPS，于4h后注射不同剂量的C-BF，24h后处死取样，研究抗菌肽C-BF的治疗作用，侧重于研究C-BF的保护功倉泛;
2)在体外建立LPS刺激猪肠道上皮细胞系J2 (IPEC-J2)细胞模型，处理方式为先10 μ g/ml C-BF处理24小时，再I μ g/ml LPS处理4小时后收取细胞。
[0007]进一步，3)对于大鼠，采取一截空肠段，利用尤斯灌流室测定电导率来评估肠上皮细胞和IPEC-J2细胞单层屏障的完整性，通过测定血浆D-乳酸和二胺氧化酶(DAO)的水平评价大鼠肠上皮细胞的渗透性，通过RT-PCR和western blot测定紧密连接蛋白(TJs)mRNA和蛋白水平来评估其屏障功能，通过HE染色观察肠上皮形态结构及测量绒毛高度与隐窝深度比值，通过透射电镜观察肠上皮细胞超微结构，通过免疫荧光和共聚焦成像法分析TJs在组织中位置和分布；
4)对于猪肠上皮细胞，利用尤斯灌流室测定跨膜电流，来评估营养物质转运效率，通过透射电镜，qRT-PCR, western-blot,免疫荧光技术方法评价C-BF对猪肠上皮细胞屏障功能的保护作用及初步机制；
5)综合体内大鼠实验和体外细胞实验，评价C-BF在改善肠道屏障功能方面的作用。
[0008]本发明的有益效果在于:
在体内，通过LPS诱导的大鼠肠炎模型发现C-BF可以缓解空肠黏膜结构的改变，恢复上皮屏障功能，并阻止紧密连接蛋白表达下降。在体外，通过LPS诱导IPEC-J2细胞模型发现C-BF可以防止屏障功能中断，还原和重新分配紧密连接蛋白。
[0009]这是第一次同 时从体内体外试验揭示抗菌肽C-BF可通过改善肠屏障功能防止LPS诱导的肠炎。C-BF对改善LPS诱导的肠炎的保护作用表明它可被用在LPS介导的肠疾病的潜在的预防和治疗药剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1.LPS单独处理或LPS+C-BF处理大鼠空肠黏膜结构的改变
图1A是空肠黏膜H&E染色(X40)图。对照:对照大鼠未经LPS和C-BF处理。LPS:大鼠用LPS单独处理。LPS+5CBF，+10CBF, +20CBF:大鼠先注射LPS后分别再添加5，10或20mg/kg 的 C-BF。5CBF+, 10CBF+, 20CBF+LPS:大鼠先添加 5，10 或 20 mg/kg 的 C-BF 后再注射LPS，显示不同浓度C-BF或LPS和C-BF不同添加顺序对LPS诱导空肠黏膜改变的恢复作用。
[0011]图1B是空肠黏膜的透射电镜。对照:对照大鼠未经LPS和C-BF处理，上皮细胞和TJ (―)是完整的。LPS:大鼠用LPS单独处理。LPS+5C，+10C, +20C:大鼠先注射LPS后分别再添加 5，10 或 20 mg/kg 的 C-BF。5C+，1C+, 20C+LPS:大鼠先添加 5，10 或 20 mg/kg的C-BF后再注射LPS。显示不同浓度C-BF或LPS和C-BF不同添加顺序对LPS诱导空肠黏膜改变的恢复作用。
[0012]图2是C-BF缓解LPS对大鼠上皮屏障的影响图
(A) 10 或 20 mg/kg C-BF显著抑制了 LPS诱导的 DAO增加(Ρ〈0.05)。(B) 10 mg/kg C-BF，无论在LPS注射之前还是之后添加,会引起血衆D-1actate水平的最显著下降(P〈0.05)。(C) C-BF恢复了 LPS诱导的空肠营养物质吸收减少(P〈0.05)。(D) C-BF改善了 LPS诱导的空肠TER下降(P〈0.05)。LPS+5CBF, +10CBF, +20CBF:大鼠先注射LPS后分别再添加5，10或 20 mg/kg 的 C-BF。5CBF+，10CBF+, 20CBF+LPS:大鼠先添加 5，10 或 20 mg/kg 的 C-BF后再注射LPS。
[0013]图3是C-BF抑制LPS诱导的紧密连接蛋白表达下降图。
[0014](A)用LPS, LPS+5CBF, LPS+10CBF或LPS+20CBF处理大鼠的空肠黏膜紧密连接蛋白表达。C-BF (10, 20 mg/kg)显著改善了 LPS诱导的Claudin-Ι和Occludin表达下降。C-BF (5，10，20 mg/kg)显著改善了 LPS 诱导的 Claudin-2 和 JAM 表达下降。C-BF(20 mg/kg)显著改善了 LPS 诱导的 TJP-1 表达下降。(B) LPS, 5CBF+LPS, 10CBF+LPS 和20CBF+LPS处理大鼠的空肠黏膜紧密连接蛋白表达。C-BF (5，10，20 mg/kg)显著改善了LPS 诱导的 Claudin-2 和 Occludin、JAM 表达下降。C-BF (10, 20 mg/kg)显著改善了 LPS诱导的Claudin-1表达下降。C-BF (5，10 mg/kg)显著改善了 LPS诱导的TJP-1表达下降。LPS+5CBF，+10CBF, +20CBF:大鼠先注射 LPS 后分别再添加 5，10 或 20 mg/kg 的 C-BF。5CBF+，1CBF+, 20CBF+LPS:大鼠先添加 5，10 或 20 mg/kg 的 C-BF 后再注射 LPS。
[0015]图4是C-BF降低LPS诱导的单层IPEC-J2细胞的TJs和完整性损害图
(A)对照组、LPS和CB-F+LPS组IPEC-J2细胞TJs的透射电镜图片。对照组TJs (—)是完整的；LPS组，TJs (―)是受损的；CB-F+LPS组，TJs (―)是不完整的；(B)对照、LPS、CB-F+LPS的IPEC-J2细胞AISC。C-BF恢复了 LPS诱导的营养物质吸收下降。(C)对照、LPS、CB-F+LPS 组 IPEC-J2 细胞的 TER。
[0016]图5是C-BF缓解LPS诱导的occludin和Z0-1表达下降图
(A)添加C-BF对LPS诱导的occludin和Z0-1的mRNA表达影响；(B)添加C-BF对LPS诱导的occludin和ZO-1 的蛋白表达影响表；(C)经C-BF预处理后免疫荧光染色观察LPS处理细胞相比occludin蛋白的分布；(D)经C-BF预处理后免疫荧光染色观察LPS处理细胞相比Z0-1蛋白的分布。
【具体实施方式】
[0017]下面结合附图对本发明做详细描述，实施例仅是描述而非限定本发明。
[0018]1、C-BF能减少由LPS诱导的大鼠空肠黏膜形态改变
为了评估C-BF在LPS相关肠炎中的潜在作用，我们在C-BF作用前后用LPS腹腔内注射健康成年大鼠(10只每组)。由图1所示，LPS处理的大鼠产生肠炎并伴有肠黏膜形态改变，而在LPS注射前后添加C-BF则能显著降低LPS诱导的空肠黏膜损害，可从H&E染色看出(图1A)。LPS处理组可观察到明显的肠绒毛高度减少和隐窝深度增加(表一)。LPS处理前后添加10或20 mg/kg C-BF可显著提高绒毛高度和减少隐窝深度(表一)。
[0019]
【权利要求】
1.一种通过LPS刺激建立的大鼠及猪肠道上皮细胞的综合模型，研究来源于蛇的抗菌肽Cathelicidin-BF (C-BF)是否对LPS诱导的肠炎有保护作用，其特征在于， 1)对于大鼠，建立5mg/kg剂量脂多糖诱导雄性Sprague-Dawley大鼠肠炎模型,LPS采用腹腔注射的方式，大鼠通过腹腔注射不同浓度(5mg/kg，10mg/kg, 20mg/kg)C-BF的PBS溶液，注射顺序及时间为先注射不同剂量C-BF，24h后注射5mg/kg的LPS，于4h后处死取样，研究抗菌肽C-BF的保护功能，另一种处理方式为调换两者的注射顺序，研究抗菌肽C-BF的治疗作用； 2)在体外建立LPS刺激猪肠道上皮细胞系J2(IPEC-J2)细胞模型，处理方式为先10 μ g/ml C-BF处理24小时，再I μ g/ml LPS处理4小时后收取细胞。
2.根据权利要求1所述的通过LPS刺激建立的大鼠及猪肠道上皮细胞的综合模型，其特征在于，进一步， 3)对于大鼠，采取一截空肠段，利用尤斯灌流室测定电导率来评估肠上皮细胞和IPEC-J2细胞单层屏障的完整性，通过测定血浆D-乳酸和二胺氧化酶(DAO)的水平评价大鼠肠上皮细胞的渗透性，通过RT-PCR和western blot测定紧密连接蛋白(TJs) mRNA和蛋白水平来评估其屏障功能，通过HE染色观察肠上皮形态结构及测量绒毛高度与隐窝深度比值，通过透射电镜观察肠上皮细胞超微结构，通过免疫荧光和共聚焦成像法分析TJs在组织中位置和分布； 4)对于猪肠上皮细胞，利用尤斯灌流室测定跨膜电流，来评估营养物质转运效率，通过透射电镜，qRT-PCR，western-blot，免疫荧光技术方法评价C-BF对猪肠上皮细胞屏障功能的保护作用及初步机制； 5)综合体内大鼠实验和体外细胞实验，评价C-BF在改善肠道屏障功能方面的作用。
【文档编号】C12Q1/26GK104031878SQ201410207726
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月16日 优先权日:2014年5月16日
【发明者】汪以真, 张海文, 金灵红 申请人:浙江大学