C-bf保护小鼠及人结肠癌上皮细胞系溃疡性结肠炎综合模型的制作方法

C-bf保护小鼠及人结肠癌上皮细胞系溃疡性结肠炎综合模型的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种C-BF保护小鼠及人结肠癌上皮细胞系溃疡性结肠炎综合模型。金环蛇抗菌肽cathelicin-BF具有广谱抗菌活性，特别是对革兰氏阴性菌。炎症性肠病（IBDs），包括溃疡性结肠炎（UC）和节段性结肠炎（CD），其病理机制尚不清楚。本发明1）对于小鼠，建立3%葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠溃疡性结肠炎模型；小鼠直肠注射C-BF的PBS溶液，每天一次，C-BF的剂量是5mg／kg，注射持续1周，实验期每天称重记录体重数据，并观察小鼠直肠出血，粪便成型情况；2）对于Caco-2细胞，培养基中抗菌肽C-BF的浓度为25ug/ml，抗菌肽处理Caco-2细胞24h后用3%DSS处理24h。
【专利说明】C-BF保护小鼠及人结肠癌上皮细胞系溃疡性结肠炎综合模型

【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，具体涉及C-BF抗菌肽对UC小鼠的保护作用。

【背景技术】
[0002]IBD是炎症性肠疾病的简称，包括溃疡性结肠炎和节段性结肠炎，其病理机制尚不清楚。IBD被定义为慢性复发性胃肠道炎症。最近有研究表明，各种免疫，遗传和环境因素会影响结肠炎的萌生、进展。在西方国家IBD的发病率更高，然而，由于西方生活方式的影响IBD在世界上其他地区的发病率也越来越高。溃疡性结肠炎，是一种与结肠粘膜表面炎症相关的慢性胃肠疾病，人感染溃疡性结肠炎可能转变成人类的第三大恶性肿瘤——大肠癌。
[0003]抗菌肽有两大家族:Cathelicidin和β -防御素,前者已具备先天免疫反应防止宿主感染微生物的抗菌功能。起源于Cathelicidin的抗菌肽具有抗菌、抗病毒和抗真菌作用。Cathelicidin中广泛报道的抗菌肽LL-37来源于人，而mCRAMP是鼠源抗菌肽，代表鼠种。Cathlicidin-BF，来源于金环蛇，是一种新的抗菌肽，据报道C-BF具有广谱抗菌活性，特别是对革兰阴性细菌。Cathlicidin-BF可以成为寻常性痤疮的有效治疗药物(plosone)。迄今为止，C -BF的非抗菌活性机制导致的其他潜在生物医学功能研究尚处于空白阶段。


【发明内容】

[0004]为了克服现有技术的不足，本发明的目的是通过活体小鼠模型和体外Caco-2细胞和小鼠巨噬细胞模型检测Cathelicidin-BF调节DSS诱导的结肠炎的作用。研究结果显示结肠给药外源性Cathelicidin-BF显著降低DSS引起的炎症反应和肠屏障功能的损害。体内和体外结果结合，我们还发现Cathelicidin-BF可以通过抑制NF-K B通路的激活降低DSS引起的炎症。目前，IBD的治疗主要是仅限于暂时性缓解炎症反应，而且，结肠炎症最终极有可能导致结肠癌，因此，我们迫切需要一个更安全和更有效的治疗和预防IBD的药物，抗菌肽作为一个潜在的抗生素替代品可能是理想的选择。
[0005]一种抗菌肽C-BF保护小鼠及人结肠癌上皮细胞系溃疡性结肠炎综合模型，
[0006]I)对于小鼠，建立3%葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠溃疡性结肠炎模型；小鼠直肠注射C-BF的PBS溶液，每天一次，C-BF的剂量是5mg/kg，注射持续I周，实验期每天称重记录体重数据，并观察小鼠直肠出血，粪便成型情况；
[0007]2)对于Caco-2细胞，培养基中抗菌肽C-BF的浓度为25ug/ml，抗菌肽处理Caco_2细胞24h后用3% DSS处理24h ;进一步，
[0008]3)对于小鼠，荧光标记C-BF，浓度为2mg/ml，直肠注射，通过活体成像、HE染色、免疫荧光、免疫组织化学、流式细胞仪、Tunnel、ELISA、利用细胞电阻仪对跨上皮电阻值进行测定、western-blot、实时荧光定量PCR技术方法；
[0009]4)对于Caco-2细胞，利用细胞电阻仪对跨上皮电阻值进行测定，Western_blot、实时荧光定量PCR技术方法；
[0010]5)综合体内小鼠实验和体外细胞实验，评价C-BF在缓解炎症、降低细胞凋亡水平以及改善肠道屏障功能的作用。
[0011]本发明的有益效果在于:
[0012]3% DSS给药7天后，与其他组相比，DSS模型组结肠炎更严重，同时结肠黏膜中的mCRAMP表达升高。与DSS组相比，C-BF+DSS组结肠上皮形态在很大程度上得到缓解，血液中B、T、巨噬细胞的比例恢复到正常水平，血清中促炎性细胞因子(TNF-α，IL-6，IL_8)和抗炎因子IL-10的蛋白水平和这些细胞因子的mRNA水平显著降低。通过免疫组化，我们发现，与DSS组相比，C-BF+DSS组细胞凋亡指标和炎症细胞如巨噬细胞和中性粒细胞浸润指数在结肠上皮细胞明显减弱，炎症相关的C0X-2和INOS的酶活性明显下降。同时，我们对经典的下游信号因子(c-jun and NF-kB)磷酸化水平进行了测试，发现DSS可以激活这两个典型的转录因子的磷酸化水平而C-BF能有效抑制NF-κ B的磷酸化(P65)但不能抑制c-jun的磷酸化。与DSS组相比，回肠中段SlgA的分泌量和血清中IgA，G，M的分泌水平明显升高。另一方面，我们分析了 C-BF对肠粘膜屏障功能的影响，通过对血清中异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖的荧光强度以及结肠上皮的跨膜上皮电阻值的动态变化趋势的检测，我们发现C-BF能有效降低肠道通透性增加和显著上调由DSS引起的屏障功能相关基因表达水平，Caco-2细胞模型的建立进一步验证体内试验结果,综合评价，C-BF可以通过调节肠道免疫功能，缓解肠上皮细胞凋亡，增强肠粘膜屏障功能减轻DSS诱导的溃疡性结肠炎。

【专利附图】

【附图说明】
[0013]图1为利用活体成像技术确认抗菌肽C-BF可以被腹膜吸收情况；
[0014]图2为建立3% DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎模型，分两种处理，一种是自由饮用无菌水(对照组，C-BF组)或自由饮用溶有DSS的水(DSS组，C-BF+DSS组)I周，另一种处理是C-BF组和C-BF+DSS组直肠注射C-BF (溶于PBS)或对照组和DSS组单独注射PBS。
[0015]图3-1为小鼠大肠段出血状况；图3-2为日增重；图3-3为结肠长度；图3_4为结肠重量；图3-5为结肠长度/重量；图3-6为疾病活动指数；
[0016]图4-1为结肠组织HE染色(100X);图4-2为结肠组织HE染色(400 X)；
[0017]图5-1为回肠组织HE染色(200 X);图5-2为回肠组织HE染色(40 X);图5-3为回肠组织HE染色(200 X)；
[0018]图6-1为巨噬细胞的比例；图6-2为T淋巴细胞的比例；图6-3为B淋巴细胞的比例；图6-4为NK细胞的比例；
[0019]图7-1为结肠组织的免疫荧光染色(200 X);图7-2为Western-blot分析mCRAMP的表达量，泳道I为DSS组，泳道2为对照组；图7-3为回肠组织的免疫荧光染色(200X)；
[0020]图8-1为小鼠血清中TNF-α的表达量；图8_2为小鼠血清中IL_6的表达量；图8-3为小鼠血清中IL-8的表达量；图8-4为小鼠血清中IL-10的表达量；
[0021]图8-5为TNF- a /GAPDH的相对表达量；图8-6为IL-6/GAPDH的相对表达量；图8-7为IL-8/GAPDH的相对表达量；图8-8为IL-10/GAPDH的相对表达量；
[0022]图9-1为小鼠结肠组织进行TUNNEL免疫组化染色(400 X);图9_2为小鼠细胞凋亡指数；
[0023]图10-1为小鼠结肠组织中INOS的浓度；图10_2为小鼠结肠组织中C0X-2的浓度；图10-3为Western-blot分析相关基因的表达量；
[0024]图11-1为结肠组织的免疫荧光染色(⑶177400X);图11_2为中性粒细胞入侵指数；图11-3为结肠组织的免疫荧光染色(F4/80400X);图11_4为巨噬细胞入侵指数；图
11-5为MPO酶活性的测定；图11-6为NAG酶活性的测定；图11_7为EPO酶活性的测定；
[0025]图12-1为血清中SlgA的浓度；图12_2为血清中IgA的浓度；图12_3为血清中IgG的浓；
[0026]图12-4为血清中IgM的浓度；
[0027]图13-1为血清中FITC-葡聚糖的浓度；图13-2为TEER ;图13-3为结肠组织的免疫荧光染色(Z01200X);图13-4为小鼠血清中Z01/GAPDH的相对表达量；图13_5为小鼠血清中Z02/GAPDH的相对表达量；图13-6为小鼠血清中Claudin-1/GAPDH的相对表达量；图13-7为小鼠血清中Mucinl/GAPDH的相对表达量；图13_8为小鼠血清中Mucin2/GAPDH的相对表达量；
[0028]图14-1为TEER ;图14-2为TER ;图14-3为小鼠血清中Z01/GAPDH的相对表达量；图14-4为小鼠血清中Claudin-1/GAPDH的相对表达量；图14_5为小鼠血清中Occludin/GAPDH的相对表达量；图14-6 为Western-blot分析相关基因的表达量。

【具体实施方式】
[0029]下面结合附图对本发明做详细描述，实施例仅是描述而非限定本发明。
[0030]1:我们首先利用活体成像技术确认抗菌肽C-BF可以被腹膜吸收，但在体内存留24h后代谢完全。图1为利用活体成像技术确认抗菌肽C-BF被肠腔吸收情况；从图1中我们可以确认C-BF在大约10分内由肠腔遍及全身，然而24h内C-BF代谢或排出体内，因此每次注射C-BF不应超过24小时；
[0031]2:在此基础上我们建立3% DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎模型，实验分组与设计如图2:
[0032]C-BF剂量:5mg/kg小鼠体重，C-BF终浓度为200 μ g/ml，DSS剂量:3% (m/v)溃疡性结肠炎模型建立如上所述，四组分别为对照组、DSS组、C-BF组和C-BF+DSS组，分两种处理，一种是自由饮用蒸馏水或溶有DSS的水，另一种处理是直肠注射C-BF或PBS作为对照，小鼠第8天处死。
[0033]3:实验期每天称重记录体重数据，并观察小鼠直肠出血，粪便成型情况，精神状态。
[0034]各大大肠段出血状况(图3-1):
[0035]在实验过程中，第6天对照组、DSS组拍照验证模型建立成功，照片上肛门处我们可以发现DSS组有明显的血迹，而对照组正常。随后，处死这两组小鼠，发现大肠(盲肠，结肠，直肠)严重出血，并从日增重和结肠长度/重量比的数据确认建模成功。
[0036]从图3-2、图3-3、图3_4、图3_5、图3_6中我们发现DSS组结肠长度/重量比显著降低，而C-BF+DSS组症状改善，与对照组水平几乎一致，DSS组疾病活动指数(DAI，粪便成型情况，结肠出血、体重的综合评分)一天比一天恶化，而C-BF+DSS组在一定程度上衰减。
[0037]4:在此基础上，我们采取结肠中段多聚甲醛固定后首先进行HE染色观察:
[0038]通过在100倍光镜下(图4-1)观察结肠上皮结构形态发现DSS处理后结肠粘膜层肠上皮形态结构破坏严重，且粘膜下层出现明显的水肿现象，而加入抗菌肽C-BF后其肠上皮形态得到一定程度的恢复，且粘膜下层水肿情况明显缓解。
[0039]进一步我们放大到400倍光镜下(图4-2)，同样发现DSS组粘膜层肠上皮组织形态破坏严重，而加入抗菌肽C-BF后其形态在一定程度上得到了改善。
[0040]5:同样，我们采取了回肠中段进行固定HE染色观察:
[0041]首先我们在200倍光镜下(图5-1)发现DSS处理组回肠上皮组织分泌强度与对照组相比明显增强，边缘有很多分泌细胞聚集。说明此处有炎症发生。
[0042]同时，我们分别在40 (图5-2)和200倍(图5-3)对回肠组织进行观察发现，DSS组回肠上皮长度严重变短，而加入抗菌肽后其长度有了明显的增加。
[0043]6:进一步，我们对小鼠进行眼眶取血，全血除去红细胞后进行流式分析B，T，巨噬细胞，NK细胞的比例，我们发现DSS处理后显著抑制了 B，T，巨噬细胞的比例，而加入抗菌肽后三种免疫细胞的比例明显提升(图6-1、图6-2、图6-3、图6-4)。
[0044]7:同时 ，我们对小鼠结肠中段的内源性抗菌肽mCRAMP的表达丰度进行免疫荧光检测，结果发现在200倍情况下(图7-1、图7-2、图7-3)，DSS处理组mCRAMP的表达丰度明显升高，而加入抗菌肽处理后其表达丰度显著降低，而有研究报道，小鼠内源抗菌肽的高表达与炎症的发生成正相关。
[0045]8:通过ELISA对小鼠血清中促炎因子TNF-a，IL-6，IL-8，抑炎因子IL-10进行检测(图8-1、图8-2、图8-3、图8-4)，同时对结肠组织提取RNA进行qRT-PCR检测(图8_5、图8-6、图8-7、图8-8)，结果表明，DSS处理组炎性细胞因子显著提高，而加入抗菌肽C-BF后炎性因子的分泌水平显著下降，基因表达水平与血清蛋白水平一致。
[0046]9:对小鼠结肠组织进行TUNNEL免疫组化染色(图9_1)，检测结肠上皮细胞凋亡情况，结果表明DSS处理显著增加了细胞凋亡水平(棕色)，而加入抗菌肽C-BF后其凋亡指数显著下降(图9-2)。
[0047]10:对小鼠结肠组织的炎性相关酶活进行检测发现DSS组INOS和C0X-2的酶活显著提高(图10-1、图10-2)，而加入抗菌肽后其酶活水平明显下降，进一步提取组织蛋白进行Western-blot分析发现(图10_3)，DSS通过对MAPK和NF_kB信号通路途径的激活上调炎性相关酶活及细胞因子的表达，而C-BF可能是通过抑制NF-kB (p65)的磷酸化下调炎性相关酶活，同时可能与上述几种细胞因子的表达下调有关。
[0048]11:进一步通过⑶177嗜中性粒细胞(图11-1)，F4/80巨噬细胞的特异性抗体对结肠组织进行免疫组化(图11-3)，分析嗜中性粒细胞入侵肠组织情况(图11-2、图11-4)，同时，提取结肠组织总蛋白用于标志性酶活的检测(图11-4、(图11-5、图11-6、图11-7)，结合免疫组化和酶活的数据表明，DSS处理嗜中性粒细胞入侵明显增加，而加入抗菌肽后一定程度上缓解了这一现象，同时，测定MPO这一嗜中性粒细胞标志性酶活结果与组化结果保持一致。检测嗜酸性粒细胞标志性酶活EPO发现其表达规律与MPO —致，同时检测巨噬细胞标志性酶活，但发现其表达与免疫组化的结果不一致，但与文献报道一致。
[0049]12:同时提取近盲端回肠总蛋白，分离血清，测定结果表明，DSS处理组回肠SlgA的分泌水平显著降低(图12-1)，血清中IgA，G，M三抗体的水平明显受到抑制，加入抗菌肽处理后其slgA分泌水平和三种免疫球蛋白水平均有一定程度升高(图12-2、图12-3、图
12-4)。
[0050]13:同时，我们对抗菌肽在屏障方面的作用进行检测，主要分为4个分实验，实验一为取样前2h直肠注射FITC标记的葡聚糖，通过检测血清中FITC浓度间接评价肠道通透性(图13-1)，实验二为实验时，取结肠鲜活组织Icm2左右，利用USING Champer进行肠道跨膜上皮电阻值变化趋势测定(图13-2)，实验三为取结肠组织，4%多聚甲醛固定后，进行屏障紧密连接蛋白ZO-1的免疫荧光实验，检测其表达丰度(图13-3)。实验四为提取结肠组织RNA，进行相关紧密连接蛋白的基因表达水平检测(图13-4、图13-5、图13-6、图13-7、图13-8)。实验一的结果表明，DSS处理后，其荧光强度显著提高，证明肠道屏障受到破坏，而加入抗菌肽后其荧光强度显著降低，说明其屏障功能得到了一定改善，结合实验二的结果表明，DSS处理肠跨膜上皮电阻值显著下降，对应肠道通透性明显上升，而抗菌肽处理组明显提高了跨膜上皮电阻值，间接反映其肠道屏障功能得到改善。从实验三可以看出，DSS处理后紧密连接蛋白ZO-1的表达丰度明显降低，抗菌肽处理组表达丰度有所提高，实验三结合实验四的结果表明，DSS处理显著下调了紧密蛋白相关基因Claudin-1，ZO-1, Z0-2的基因表达，与肠上皮屏障功能密切相关的粘蛋白mucin-l，2的表达水平也受到抑制，而加入抗菌肽处理后，五种基因的表达水平都得到了显著上调。
[0051]14:为进一步对抗菌肽C-BF的作用机制进行研究，接着建立细胞模型，屏障功能以Caco-2细胞为模型，首先，我们通过细胞增殖率实验对抗菌肽和DSS的作用浓度进行了初步筛选，结果选择抗菌肽C-BF的浓度为25ug/ml，DSS的浓度为3%，我们利用Transwell小室将Caco-2细胞种于小室中连续培养21d致形成稳定的似单层上皮组织样形态(即电阻值稳定)，然后用抗菌肽处理细胞24h后用3% DSS处理24h，利用细胞电阻仪对跨上皮电阻值进行测定，提取细胞总RNA和蛋白，对屏障相关蛋白进行基因与蛋白水平检测，结果与小鼠体内实验结果保持一致(图14-1、图14-2、图14-3、图14_4、图14_5、图14_6)。
[0052]最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术进行的若干改进与润饰，均视为本发明的保护范围。
[0053]本发明探究抗菌肽C-BF对肠道炎症UC模型的作用。
[0054]为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案:
[0055]建立3%葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠溃疡性结肠炎模型，通过活体成像、HE染色、免疫荧光、免疫组织化学、流式细胞仪、Tunnel、ELISA、western-blot、实时荧光定量PCR技术方法，探究C-BF对DSS诱导的结肠炎的作用。在体外，我们研究C-BF对Caco-2细胞细胞系的作用。
[0056]C-BF 和 DSS 的制备:
[0057]CatheIicidin-BF (C-BF)由中肽生化有限公司(中国杭州)合成和纯化，其分子量以α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALD1-TOF MS7Model Autoflex，布鲁克道尔顿公司，美国)测定。通过反相-高效液相色谱法分析肽的纯度在95%以上。肽溶解于PBS缓冲液中，浓度为200μ μ g/ml，使用前_80°C储存。葡聚糖硫酸钠(简称DSS)购自MP (美国)，分子量为36000-50000Da，以3%溶于无菌水，(3g DSS/100ml无菌水)。
[0058]溃疡性结肠炎诱导后通过DAI评分系统测定C-BF的效果:
[0059]试验分组为对照组，DSS组C-BF组，C-BF+DSS组，预饲I周后，诱导I周，分两种处理，一种是自由饮用无菌水(对照组，C-BF组)或自由饮用溶有DSS的水(DSS组，C-BF+DSS组)I周，另一种处理是C-BF组和C-BF+DSS组直肠注射C-BF(溶于PBS)或对照组和DSS组单独注射PBS，每天一次，注射持续I周，C-BF的剂量是5mg/kg，总注射量为500ul。实验期每天称重记录体重数据，并观察小鼠直肠出血，粪便成型情况。DAI代表这三个指数的平均值。
[0060]利用生物发光成像对C-BF吸收进行评价:
[0061]六只C57/BL6雄性小鼠分为三组，分别直肠注射10ul PBS, FITC，FITC-C-BF,浓度为2mg/ml，直肠注射FITC-C-BF后的10分钟、30分钟、2小时、24小时分别腹腔注射镇定剂戊巴比妥钠，然后打开生物发光成像机和荧光光源的电源，点击活体成像图标，IVIS系统初始化，机器初始化并且温度状态灯从红色变成绿色后，把麻醉小鼠放置在观察处，关上门，激发和发射波长分别为488nm和525nm，选择荧光模型和设置曝光时间和分级值，F/停止值被设置为2，然后获得相应的图片，包括荧光图像和激光数据。
[0062]组织病理学评估:
[0063]肠组织取自五只小鼠，每组一只，进行组织学测量。回肠中段和结肠全层段切下并纵向剖开，立即固定于4%多聚甲醛溶液，石蜡包埋，HE染色。上皮形态特征通过徕卡NEWDM4500BR显微镜放大不同倍数观察。
[0064]流式细胞仪分析免疫细胞(B，T淋巴细胞，巨噬细胞，NK细胞):
[0065]眼眶取血置于含有肝素钠(Sangong中国上海)的L 5ml管中，取血50ul与特定的表面抗体混合，该混合物在室温避光孵育15分钟，抗体⑶3 (PE-Cy5)，⑶45R(FITC)，CD49B (PE)，F4/80 (PE)购自(联科，中国上海)，用量分别为 0.25ug/5ul, 0.5ug/5ul，
0.5ug/5ul，0.25ug/5ul，然后加入I XFCM裂解液，室温避光孵育10分钟，300_400g离心5min,弃上清，2ml PBS重悬，300-400g离心5min，弃上清，500ul PBS重悬，流式细胞仪荧光分析。
[0066]结肠组织免疫荧光和免疫组化染色:
[0067]mCRAMP (Abeam美国)和Z0-1 (Abeam美国)免疫荧光分析，首先，用含有I % w/vBSA的PBS封闭非特异结合位点30分钟，然后以1: 1000比例将兔多克隆抗体加入到Cathelicidin抗体中，以1: 500比例将兔多克隆抗体加入到ZO-1抗体中，溶液为含1%w/vBSA的PBS，切片4°C孵育过夜，PBS洗5次，每次3分钟，然后用吸水纸擦干标本周围的PBS,以1: 100比例加入TRITC标记的羊抗兔IgG(JIR美国)，室温避光孵育lh，再次洗涤二抗，然后用DAPI细胞核染色，最后，洗去未结合的DAPI，甘油封片，立即用荧光显微镜观察染色切片。
[0068] ⑶177和F4/80免疫组化分析，首先，用含有I % w/v BSA的PBS封闭非特异结合位点30分钟，然后以1: 100比例将羊多克隆抗体加入到⑶177 (Santa美国)抗体中，以I: 100比例将羊多克隆抗体加入到F4/80 (Santa美国)抗体中，溶液为含I % w/v BSA的PBS，切片4°C孵育过夜，PBS洗5次，每次3分钟，然后用吸水纸擦干标本周围的PBS，以I: 100比例加入HRP标记的兔抗羊IgGCJIR美国)，4°C孵育lh，PBS冲洗三次，然后加入50-100ul DAB(DAK0美国)，颜色形成后，苏木素抑制切片，用70-100%不同梯度的酒精脱水，每个梯度10分钟，后用二甲苯使切片透明，中性树胶封片。评价组织中细胞凋亡水平，石蜡切片脱蜡、水化和抗原修复，的TDT和TUNEL (试剂盒，罗氏美国)以1: 9的比例混合，37°C孵育60min后，那盒子保持湿度。内源性过氧化物酶封闭，切片干燥，转化剂-POD(试剂盒，罗氏美国)覆盖组织，37°C孵育30分钟，PBS洗三次，添加DAB，蒸馏水终止显色，细胞核复染，切片脱水并封片。
[0069]血清中细胞因子FITC-葡聚糖，IgA，IgG, IgM,回肠末端SIgA分泌水平和结肠中MPO, EPO, NAG酶活性的测量:
[0070]血清中细胞因子TNF- a，IL-6, IL-8, IL-10的检测用ELISA试剂盒(博士德，中国武汉)。测定过程如下:用10ul标准品制作标准曲线，待测样品加入到相应的抗体包被酶标板，37°C反应90分钟，弃板中液体，加入10ul TNFa，IL-6，IL-8，IL-10抗体，37°C反应60分钟，PBS洗板三次，各孔加入ABC工作液，37 V反应30分钟，再次用PBS洗板，加入预混的TMB底物溶液，37°C反应25分钟，加入TMB终止液，在酶标仪450nm处测定OD值。
[0071]间接定量测定肠道通透性，采血前4小时注射FITC-葡聚糖200ul至结肠，眼眶静脉采血，避光将血清加入至96孔板中，然后用酶标仪(spectramax M5Molecular devices,美国)检测荧光强度，激发、发射波长分别为488nm和525nm。
[0072]血清中细胞因子IgA，IgG, IgM,回肠末端SIgA分泌水平和结肠中MP0，EP0，NAG酶活性的测量使用ELISA试剂盒(R&D美国)，简单的操作步骤如下:50ul标准品和待测样品加入抗体包被酶标板，各孔加入50ul酶标试剂，37°C孵育lh，弃残渣，洗涤液洗涤5次，各孔先后加入50uL显色剂A和B，避光37°C孵育15分钟。取出板，加入50ul终止液，测定然450nm 处 OD 值。
[0073]结肠中INOS和C0X-2酶活性测定
[0074]结肠中INOS和C0X-2酶活性测定，使用相应的INOS和C0X-2的ELISA试剂盒(B1value英国)。操作如下:组织的制备，用RIPA裂解液(博士德中国武汉)提取结肠组织总蛋白和BCA试剂盒(凯基中国南京)检测蛋白质浓度、定量，50uL标准品和待测样品加入到抗体包被酶标板，各孔加入25ul酶标试剂，银纸包被和37°C孵育lh，清洗液洗板五次，依次加入50ul底物一、底物二，避光孵育15分钟，然后加入50ul终止液终止反应，30分钟内测定450nm处OD值。
[0075]电生理学测量
[0076]采用先前所描述的改进的尤斯灌流室(VCC MC6，PI)测量跨膜电位。切下小鼠结肠组织，立即浸在含氧的Kreb缓冲液中，放入尤斯灌流室(世界精密仪器；毒品科学，密西沙加市，安大略，加拿大)。37°C下，流室组织表面0.6平方厘米浸在8U ml的循环氧中的Kreb缓冲区中。浆膜缓冲液中含有1ml葡萄糖作为能量来源，而黏膜缓冲液中含有1ml甘露醇来平衡渗透压。灌流室含有琼脂盐桥监测不同组织两端的电位差，通过自动电压钳指示，注入所需的Isc保持零电位差。组织电导，相当于被动渗透离子，由欧姆定律计算出。作为组织电阻的逆推措施，ISC的基线值指示净离子分泌和电导，肠段平衡20分钟后记录。
[0077]caco-2细胞以5 X 15在transwell板中培养，37V，5%的二氧化碳，95%的湿度，每隔一天更换培养基。每天用电阻表测定电阻值直到电阻值趋于稳定，进行后续的实验。上层和基底分别添加0.5ml和1.5ml新鲜培养基，上层添加终浓度25 μ g/ml C-BF,孵育24h，然后用D-Hanks洗去C-BF，换新鲜培养基并加入终浓度3% (m/v) DSS，放入孵化器中培养，每隔2小时测定各孔的电阻值。
[0078]分析Western blot
[0079]研磨结肠中段，用总蛋白提取试剂盒(凯基中国南京)的完全抑制蛋白酶混合物溶解。各组织蛋白质含量进行定量稀释后确保7.5% /10%的SDS-PAGE凝胶每孔含有30yG蛋白。蛋白通过SDS-PAGE进行分离，转移到硝酸纤维素膜上，TBS配置的5% (w/v)的脱脂奶粉封闭，一抗(NF-K B P65, p-p65, c-jun, P-c-jun, Santa Cruze 美国)4?孵育过夜。辣根过氧化物酶标记二抗孵育，显色。
[0080]分离RNA和荧光定量PCR
[0081]Trizol 试剂((Invitrogen Corporat1n, Carlsbad, CA)分离提取总 RNA, M-MuLV逆转录酶试剂盒(Fermentas, EU, Glen Burnie, Maryland, USA)逆转录合成 cDNA。SYBR?Premix Ex Taq?试剂盒(Applied B1systems,Foster City, CA,USA)通过实时突光定量PCR检测单个基因的mRNA水平。在ABI第一步PLUSTM实时PCR系统(Applied B1systems公司，福斯特市，CA，USA)。数据是根据循环阈值(CT)和内参(GAPDH)比较分析。本发明所用引物在表1列出。
[0082]表1
[0083]

【权利要求】
1.一种抗菌肽C-BF保护小鼠及人结肠癌上皮细胞系溃疡性结肠炎综合模型，其特征在于， 1)对于小鼠，建立3%葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠溃疡性结肠炎模型；小鼠直肠注射C-BF的PBS溶液，每天一次，C-BF的剂量是5mg / kg,注射持续I周，实验期每天称重记录体重数据，并观察小鼠直肠出血，粪便成型情况； 2)对于Caco-2细胞，培养基中抗菌肽C-BF的浓度为25ug/ml，抗菌肽处理Caco_2细胞24h后用3%DSS处理24h。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽C-BF保护小鼠及人结肠癌上皮细胞系溃疡性结肠炎综合模型，其特征在于，进一步， 3)对于小鼠，荧光标记C-BF，浓度为2mg/ml，直肠注射，通过活体成像、HE染色、免疫荧光、免疫组织化学、流式细胞仪、Tunne1、ELISA、利用细胞电阻仪对跨上皮电阻值进行测定、western-blot、实时荧光定量PCR技术方法； 4)对于Caco-2细胞，利用细胞电阻仪对跨上皮电阻值进行测定，Western-blot、实时荧光定量PCR技术方法； 5)综合体内小鼠实验和体外细胞实验，评价C-BF在缓解炎症、降低细胞凋亡水平以及改善肠道屏障 功能的作用。
【文档编号】C12N5/09GK104046592SQ201410208089
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年5月16日 优先权日:2014年5月16日
【发明者】汪以真, 张海文, 戎亦骊 申请人:浙江大学