利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基因的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术筛选白棉子叶衰老相关基因的方法。其步骤如下：待棉花幼苗长至10d左右，两片子叶完全展开后，选取长势一致的幼苗，分别用300、500和700mg·L-1的乙烯利涂抹子叶，同时对照用蒸馏水涂抹，经过乙烯利处理5d后，提取子叶的基因组DNA；再通过MSAP分析，对回收的差异条带纯化和测序继而进行功能分析。本发明利用MSAP技术，分析棉花子叶经乙烯利处理后CCGG位点胞嘧啶甲基化水平和模式的变化，进而分离乙烯利诱导的甲基化差异片段，以期从基因组水平上揭示乙烯利调控棉花衰老的调控机制提供理论依据。
【专利说明】利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基 因的方法 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于生物【技术领域】，具体的涉及利用甲基化敏感扩增多态性（MSAP)技术 分析乙烯利处理对棉花子叶DNA的甲基化水平和甲基化模式变化的影响及衰老相关基因 的筛选。 技术背景
[0002] 在棉花实际生产中，叶片早衰是导致棉花产量减低的主要因素之一。棉田叶片早 衰可导致棉花减产1/5以上，棉花叶片的早衰不但影响了棉花的产量，还导致棉纤维品质 下降，进而影响棉纤维的成纱质量。因此，研究棉花叶片衰老，具有重要的理论和实际意义。
[0003] 棉花子叶具有生长期长，且当真叶长出后，子叶会自然衰老脱落等优点，在棉花子 叶生命周期中，子叶的衰老是一个基因遗传调控的程序化过程，这个过程是伴随着衰老相 关基因的表达而发生的。
[0004] DNA甲基化是表观遗传修饰领域的重点内容之一，广泛存在于高等植物中，能够调 控基因表达，进而调控植物的生长发育，并在植物处于逆境时发挥重要作用。目前有关DNA 甲基化的研究多集中于医学、动物学等领域，而对植物DNA甲基化的相关研究是近些年来 开始受到重视，由于DNA甲基化在调节植物生命活动中的重要性，对植物DNA甲基化的研究 已经成为表观遗传学研究领域所关注的热点。
[0005] 甲基化敏感扩增多态性（methylation-sensitive amplification polymorphism, MSAP)技术是在1997年由Reyna Lopez等人第一次报道，这项技术是在AFLP分子标记技术 的基础上衍生出来的，是基于PCR扩增的DNA甲基化多态性的检测方法，即将标准的AFLP 分子标记分析中使用的高频酶Mse I，替换成了一对同裂酶Hpa II和Msp I，而此对同列 酶对甲基化识别位点敏感性不同，而其余操作与AFLP完全一样。主要操作步骤包括基因 组DNA双酶切、人工接头连接、MSAP预扩增反应、MSAP选择性扩增反应、聚丙烯酰胺凝胶电 泳、条带统计分析等。MSAP可以检测在DNA序列没有发生变化时，基因组DNA的甲基化修 饰水平，又能够对DNA特异性位点的甲基化状态进行检测。该技术的优点在于：（1)不需 要知道被检测植物DNA的遗传信息，可用于DNA遗传背景未知的生物。（2)操作相对简便， 在AFLP技术体系的基础上稍加改进，即可操作。（3)MSAP技术的引物设计简单（4)多态性 丰富，可在植物全基因组范围内检测CCGG位点的胞嘧啶甲基化变化，因此可提供丰富的甲 基，化位点信息。利用该技术，前人研究了多种植物在盐、重金属、干旱、低温胁迫等逆境条 件下的DNA甲基化程度和甲基化状态，但关于由乙烯利诱导棉花子叶衰老的基因组DNA甲 基化方面的研究还鲜有报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种利用甲基化敏感扩增多态性（MSAP)技术筛选由乙烯 利诱导的白棉子叶衰老相关基因的方法。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] 利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基因的方法，按如下步骤 进行：
[〇〇〇9] A.材料的处理
[〇〇1〇] 首先棉花种子经浓硫酸脱绒后，用无菌水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分，粒选 饱满、正常发育的种子备用，然后通过沙培的方式培养，将种子植于育苗盘中，28°C培养箱 暗培养2d后转至光照培养箱中继续培养，培养条件是12h/d的光照时间，45 μ mol ·πΓ2 · 的光照强度，温度（30± 1) °C。待棉花幼苗长至lOd左右，两片子叶完全展开后，分别用300、 500和700mg · I71的乙烯利涂抹长势一致的幼苗子叶，每天上午10点和下午4点，分别涂 抹两次，每个处理选取10株为一组，重复三次，同时对照用蒸馏水处理；经过乙烯利处理5d 后，将棉花幼苗的子叶用经过消毒的刀片切下，并保存于一 80°C冰箱中备用；
[0011] B.提取步骤A中子叶的基因组DNA ;
[0012] C.对所提取的棉花子叶基因组DNA进行双酶切；
[0013] D.对酶切后的DNA模板进行连接；
[0014] E. MSAP预扩增反应；
[0015] F. MSAP选择性扩增反应；
[0016] G.反应产物的电泳检测，特异性条带的回收；
[0017] H.回收条带的纯化、测序；
[0018] I.差异序列的功能分析。
[0019] 本发明步骤A中的乙烯利浓度为300、500和700mg · L'
[0020] 本发明步骤B中棉花子叶的基因组DNA的提取，采用改良的CTAB法。
[0021] 本发明步骤 C 中双酶切体系为：DNA 模板（300-500) ng，（5-10) U EcoRI (Thermo)， 2yL10XBuffer EcoRI (500mM Tris-Hcl (pH7. 5), 100mM MgCl2, lOOOmM NaCl,0. 2 % Trition X-100, lmg/ml BSA)，加 ddH20 至 20μ L，反应混合液在 37 °C 保温（6-12)h，然 后65 °C水浴20min ;再将上一步的酶切产物进行第二步酶切，酶切反应体系（30 μ L) 为，第一步酶切产物2(^1^，（5-10"邱3 11(或1^?1)，3 4 1^10\81^€61'了3叩〇(33〇1111 Tris-Ac (ρΗ7· 9)，lOOmM Mg-Ac，660mM K-Ac，lmg/ml BSA)，加 ddH20 至 30 μ L，反应混合液在 37°C保温（6-12)h，然后 65°C (Hpall)或 80°C (MspI)水浴 20min，备用。
[0022] 本发明步骤D中连接体系为：将双酶切产物，加入（3-5) U T4DNA连接酶（Thermo)， 5pmol EcoRI 接头，50pmol Hpall/MspI 接头，4yL10XT4DNA Ligase Buffer，加 ddH20 至 40 μ L，（21-23) °C连接（8-12) h，产物稀释10倍后备用。
[0023] 本发明步骤E中MSAP预扩增反应体系为：(0.5-2) yL的连接产物稀释液， (1. 5-3) μ L 的 2. 5mM dNTPs，（2-3. 5) μ L 的 10XPCR Buffer，（0· 5-2)U 的 Taq DNA 聚合酶， 预扩增引物 E0 和 H0 各（2. 5-10) μπιο?，加 ddH20 至 25μ LoPCR 条件为 95°C 5min ;95°C 30s， 56°C lmin，72°C lmin，20轮循环；72°C 10min，4°C终止。然后把预扩增产物稀释（10-100) 倍以备用。
[0024] 本发明步骤F中MSAP选择性扩增反应体系：(0.5-2) μ L的连接产物稀释液， (1. 5-3) μ L 的 2. 5mM dNTPs，（2-3. 5) μ L 的 10XPCR Buffer，（0· 5-2)U 的 Taq DNA 聚合酶， 选择性扩增引物（El - El 1和HI - H6)各（2· 5-10) μ mol，加 ddH20至25 μ L。PCR条件 为 95°C 5min ;95°C 30s，65°C (每轮循环减少 0· 7°C ) 30s，72°C lmin，12 轮循环；95°C 30s， 56°C 30s，72°C lmin，23 轮循环；72°C 10min，4°C终止。
[0025] 以上所用引物组合如表1所示：
[0026] 表1MSAP分析采用的接头序列和引物序列
[0027]
【权利要求】
1. 一种利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基因的方法，其特征在 于，按如下步骤进行： A. 材料的处理 首先棉花种子经浓硫酸脱绒后，用无菌水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分，粒选饱 满、正常发育的种子备用，然后通过沙培的方式培养，将种子植于育苗盘中，28°C培养箱暗 培养2d后转至光照培养箱中继续培养，培养条件是12h/d的光照时间，45 μ mol ·πΓ2 --Γ1的 光照强度，温度（30±1)°C。待棉花幼苗长至10d左右，两片子叶完全展开后，分别用300、 500和700mg · I71的乙烯利涂抹长势一致的幼苗子叶，每天上午10点和下午4点，分别涂 抹两次，每个处理选取10株为一组，重复三次，同时对照用蒸馏水处理；经过乙烯利处理5d 后，将棉花幼苗的子叶用经过消毒的刀片切下，并保存于一 80°C冰箱中备用； B. 提取步骤A中子叶的基因组DNA ; C. 对所提取的棉花子叶基因组DNA进行双酶切； D. 对酶切后的DNA模板进行连接； E. MSAP预扩增反应； F. MSAP选择性扩增反应； G. 反应产物的电泳检测，特异性条带的回收； H. 回收条带的纯化、测序； I. 差异序列的功能分析。
2. 根据权利要求1所述的利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基 因的方法，其特征在于，所述步骤A中的乙烯利浓度为300、500和700mg · L'
3. 根据权利要求1所述的利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基 因的方法，其特征在于，所述步骤B中棉花子叶的基因组DNA的提取，采用改良的CTAB法。
4. 根据权利要求1所述的利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关 基因的方法，其特征在于，所述步骤C中双酶切体系为：DNA模板（300-500)ng，（5-10) U EcoRI (Thermo) ,2 μ L10XBuffer EcoRI (500mM Tris-Hcl (pH7. 5) , lOOmM MgCl2, lOOOmM NaCl，0.2%Trition X-100，lmg/ml BSA)，加 ddH20 至 20yL，反应混合液在 37°C 保温（6-12)h，然后65°C水浴20min ;再将上一步的酶切产物进行第二步酶切，酶切反应 体系（30yL)为，第一步酶切产物 20yL，（5-10)U Hpall(或 MspI)，3yL10XBuffer Tango(330mM Tris-Ac(pH7.9)，100mM Mg_Ac，660mM K_Ac，lmg/ml BSA)，加 ddH20 至 30yL， 反应混合液在37°C保温（6-12)h，然后65°C (Hpall)或80°C (MspI)水浴20min，备用。
5. 根据权利要求1所述的利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基 因的方法，其特征在于，所述步骤D中连接体系为：将双酶切产物，加入（3-5) U T4DNA连接 酶（Thermo)，5pmol EcoRI 接头，50pmol Hpall/MspI 接头，4 μ L10XT4DNA Ligase Buffer， 加 ddH20至40 μ L，（21-23) °C连接（8-12) h，产物稀释10倍后备用。
6. 根据权利要求1所述的利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基 因的方法，其特征在于，所述步骤E中MSAP预扩增反应体系为：(0. 5-2) μ L的连接产物稀 释液，（1. 5-3) μ L 的 2. 5mM dNTPs，（2-3. 5) μ L 的 lOXPCRBuffer，（0· 5-2)U 的 Taq DNA 聚 合酶，预扩增引物E0和HO各（2. 5-10) μπιο?，加 ddH20至25yL。PCR条件为95°C 5min; 95°C 30s，56°C lmin，72°C lmin，20轮循环；72°C 10min，4°C终止。然后把预扩增产物稀释 (10-100)倍以备用。
7.根据权利要求1所述的利用甲基化敏感扩增多态性（MSAP)技术筛选白棉子叶衰老 相关基因的方法，其特征在于，所述步骤F中MSAP选择性扩增反应体系：(0. 5-2) μ L的连 接产物稀释液，（1. 5-3) μ L 的 2. 5mM dNTPs，（2-3. 5) μ L 的 10XPCR Buffer，（0· 5-2)U 的 Taq DNA聚合酶，选择性扩增引物（El - Ell和HI -H6)各（2. 5-10) μπιο?，加 ddH20至 25 μ L。PCR 条件为 95°C 5min ;95°C 30s，65°C (每轮循环减少 0· 7°C ) 30s，72°C lmin，12 轮 循环；95°C 30s，56°C 30s，72°C lmin，23 轮循环；72°C 10min，4°C终止； 以上所用引物组合如下表所示：
【文档编号】C12Q1/68GK104087656SQ201410208965
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年5月16日 优先权日:2014年5月16日
【发明者】郭宁, 席晓广, 林毅, 蔡永平, 樊洪泓, 孙旭 申请人:安徽农业大学