在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法
【专利摘要】本发明公开了一种在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法，采用Real-time?PCR，在水稻叶片上采用剪叶法侵染白叶枯病菌，侵染46～50小时后，取距离剪口处1cm之内的叶片组织进行检测。表达基因包括Os03g0853200、OsPR1b、OsNPR1等。采用本发明的方法能轻易的对白叶枯病菌侵染的水稻组织进行选取，并能有效地检测其诱导基因的表达。
【专利说明】在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种在水稻中检测受白叶枯病菌诱导表达基因的有效方法，属于分子遗传学领域。
【背景技术】
[0002]水稻白叶枯病是由革兰氏阴性黄单孢菌水稻变种(Xanthomonas oryzaepv.0ryzae, Xo0.)所引起的一种世界性细菌病害，它与稻瘟病、纹枯病一起被称为水稻的“三大病害”。水稻遭遇白叶枯病后，一般减产20~30%，严重时可达50%，甚至绝收。利用水稻的抗病基因是防治白叶枯病最经济、环保的方法，也是水稻育种中提高杂交稻抗病性的有效途径。水稻抗白叶枯病基因往往受白叶枯病菌的诱导表达，所以在白叶枯病菌侵染的水稻中检测被诱导表达的基因，是发现抗性基因的有效方法，为水稻抗性基因的功能研究和育种利用奠定坚实基础。
[0003]目前，检测基因表达的方法非常成熟，主要有半定量RT-PCR法、Real-time PCR法、Northern blotting法等。其中，Real-time PCR可以精确定量某个基因的表达水平,是比较公认的检测基因表达的方法。在检测白叶枯病菌诱导表达的基因时，一般是选取一段接种过白叶枯病菌的水稻叶片，提取总RNA后，用Real-time PCR分析基因表达水平。由于不同基因的表达方式可能有所不同，有些可能是在叶片接种病菌的局部受到诱导表达，有些则是在整张叶片上受到诱导表达，因此如何合理地选取叶片组织是检测基因受白叶枯病菌诱导表达一个非常关键的因素。但是，选取哪一段接种过白叶枯病菌的水稻叶片，离接种处多少距离，才能有效地检测出被诱导表达的抗性基因，目前还没有一个明确的标准。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法；采用本发明的方法能轻易的对白叶枯病菌侵染的水稻组织进行选取，并能有效地检测其诱导基因的表达。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明提供一种在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法，采用Real-time PCR，在水稻叶片上采用剪叶法侵染白叶枯病菌(白叶枯病菌PX086)，侵染(接种)46~50小时(较佳为48小时)后，取距离剪口处Icm(包括Icm)之内的叶片组织进行检测。
[0006]作为本发明的在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法的改进:在水稻分蘖期，在水稻叶片上采用剪叶法侵染白叶枯病菌。
[0007]作为本发明的在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法的进一步改进:
[0008]表达基因为0s03g0853200、OsPRlb, OsNPRl 等；
[0009]当表达基因为0s03g0853200时，引物为:
[0010]5， -GAGCAACGACCAACAAAAG-3，和 5， -GCAGAAAATGGGAAAGAAG-3，；[0011]当表达基因为OsPRlb时，引物为:
[0012]5’ -GGCAACTTCGTCGGACAGA-3’ 和 5’ -CCGTGGACCTGTTTACATTTTCA-3’ ；
[0013]当表达基因为OsNPRl时，引物为:
[0014]5’ -CTGATCCGGTTTCCCTCGGA-3’ 和 5’ -GACCTGTCATTCTCCTCCTTG-3’。
[0015]本发明的方法提供了有效的取样方法，采用本发明的方法能最有效地检测到基因受白叶枯病菌的诱导表达。
[0016]本发明的过程如下:
[0017]通过Real-time PCR技术，发明人发现了水稻一个基因(GenBankaccession:0s03g0853200)受白叶枯病基因的诱导表达，在动物中该基因的同源基因参与机体的免疫应答。为了分析该基因(0s03g0853200)在接种白叶枯病菌的水稻叶片中的表达情况，发明人首先采用剪叶法(Kauffman et al.，1973)对水稻抗病品种IRBB7和感病品种IR24接种白叶枯病菌，用沾了菌液的剪刀在叶片顶端横向剪去一段，在剪过的伤口处白叶枯病菌会沿着维管束向叶片基部方向侵染；然后，根据离剪口的距离，将接种的叶片分成I至V区域(图1)，每个区域的叶片组织独立提取总RNA和反转录成cDNA，用Real-timePCR分析该基因的表达水平。结果表明该基因在感病品种IR24中没有被诱导表达，而在抗病品种IRBB7中被显著性地诱导表达。不过，在叶片I至V区域中该基因表达被诱导的程度不同，在I区的表达量最高，随着距离剪口处越远，基因表达越低，在II区的表达量只有I区的一半，到IV区已趋 于本底表达，无诱导表达。以上结果表明，在I至III区域内都能非常明显地检测到该基因受白叶枯病菌的诱导表达，但是在I区检测到的表达量最高，即在距离剪口处Icrn以内可最有效地检测到基因受白叶枯病菌诱导的表达(图2)。
[0018]本发明对在水稻中检测受白叶枯病诱导表达的基因时，如何科学地取样做了明确的说明，为抗白叶枯病基因的表达分析提供了一种有效的方法，也为其它植物抗病基因的研究提供了借鉴。
[0019]综上所述，采用本发明的方法能有效的在白叶枯病菌侵染的水稻中检测出被诱导表达的基因，是发现抗性基因的有效方法，为水稻抗性基因的功能研究和育种利用奠定坚实基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0021]图1接种白叶枯病菌的水稻叶片分区示意图；
[0022]图2叶片不同部位中0s03g0853200基因的Real time_PCR表达分析图；
[0023]图3水稻抗病相关基因OsPRlb的Real time-PCR表达分析图。
[0024]图4水稻抗病相关基因OsNPRl的Real time-PCR表达分析图。
【具体实施方式】
[0025]实施例1、
[0026]1、接种体制备方法:
[0027]将白叶枯病菌PX086接种在PDA培养基(马铃薯300g/L，葡萄糖30g/L，琼脂15g/L)上,于28恒.温培养箱中培养3-4d,用蒸懼水从培养基上洗下菌落,并稀释成浓度为9X 108cfu/mL的细菌悬浮液。在水稻分蘖期,采用剪叶法(Kauffman et al.，1973)对水稻抗病品种IRBB7和感病品种IR24的叶片侵染白叶枯病菌。在侵染48小时后，根据距离剪
口处的远近选取I至V区域(图1)的叶片组织，迅速置于液氮中冷冻，-80保存。
[0028]备注说明:
[0029]距离剪口处O至Icm为区域I,距离剪口处< I至2cm为区域II,距离剪口处< 2至3cm为区域III,距离剪口处< 3至5cm为区域IV,距离剪口处< 5至7cm为区域V。
[0030]备注说明:上述每个区域取样时是选取该区域中距离剪口最远之处，即，区域I选取距离剪口 Icm之处，区域II选取距离剪口 2cm之处，其余以此类推。
[0031]2、用RNeasy Plant mini Kit (QIAGEN公司)分别从每一叶片组织的区域I~区域V中每个区域提取总RNA(即为下文中所用的RNA)，参照该试剂盒说明书方法操作。
[0032]将提取的总RNA逆转录成cDNA:取5ug总RNA、4uL Oligo (dT) 18引物(浓度为5uM),加 Rnase free water 至 20uL, 72 °C 温育 5min,再冰浴 IOmin ；加入 10uL5XM_MLVBuffer、3uL dNTP (IOmM each) >IuL RNase Inhibitor (40U/uL)>2uL ReverseTranscriptase M-MLV (200U/uL)和 20uL RNase free water, 42 °C温育 60min, 72°C 温育15min，获得所需的cDNA。
[0033]3、米用 ABI 公司 StepOne Real-Time PCR System,用 Fast SYBR GreenMaster Mix(T0Y0B0 公司 )试剂盒，反应体系为:10uL2XFast SYBR GreenMaster Mix，0.4uL50 X Rox, 0.8uL 基因(0s03g0853200)特异性引物(序列为5’-GAGCAACGACCAACAAAAG-3’和 5’_GCAGAAAATGGGAAAGAAG_3’，浓度均为 5uM，各加 0.4uL)，IuL cDNA 模板(浓度为 10ng/uL)，加 ddH20 至 20uL。
[0034]PCR反应程序为:95预变性5min ；95 ；C6E5s IQ 40个循环；从而获得相应的CT值。
[0035]备注说明:经常规方法验证，所得确为基因0s03g0853200。
[0036]以水稻管家基因β -actin作为内参，即将上述反应体系中的“基因(0s03g0853200)特异性引物”改成水稻管家基因β -actin的引物(序列为:5’ -CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA-3’ 和 5’ -CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA-3’)；其余等同。每个样品重复3次，使用法处理数据，分析基因的表达水平和差异，具体公式为:
j-QQgyj^-[(样品目的基因°1值-样品管家基因°1值)]—[(对照目的基因^1值-对照管家基因^1值)]
[0038]备注说明，上式中:
[0039]样品目的基因CT值是指:水稻抗病品种IRBB7于目的基因(0s03g0853200)下所得的CT值；
[0040]样品管家基因CT值是指:水稻抗病品种IRBB7于水稻管家基因β -actin下所得的CT值；
[0041]对照目的基因CT值是指:感病品种IR24于目的基因(0s03g0853200)下所得的CT值；
[0042]对照管家基因CT值是指:感病品种IR24于水稻管家基因β -actin下所得的CT值。
[0043]最终所得的结果如图2所示。[0044]根据图2可知:在接种了白叶枯病菌的IRBB7叶片中，在I至III区域内都能非常明显地检测到该基因受白叶枯病菌的诱导表达，但是在I区检测到的表达量最高，即在距离剪口处Icm以内可最有效地检测到基因受白叶枯病菌诱导的表达。
[0045]实施例2、将实施例1中的基因(0s03g0853200)改成OsPRlb (GenBankaccession:EF061247.1)，将相应的引物序列改为 5’ -GGCAACTTCGTCGGACAGA-3’ 和5，-CCGTGGACCTGTTTACATTTTCA-3，，其余同实施例1。
[0046]备注说明:经常规方法验证，所得确为基因OsPRlb。
[0047]实验结果如图3所不，在感病品种IR24中，该基因没有受:白叶枯病菌的诱导表达；而在接菌的抗病品种IRBB7叶片的I区域(即距离剪口处Icm以内)，最显著地检测到该基因受诱导表达。
[0048]备注说明:受病原菌诱导表达的水稻抗病相关基因OsPRlb是一个公认的抗病标记基因，用以表明植物抗病系统的激活。
[0049]实施例3、将实施例1中的基因(0s03g0853200)改成OsNPRl (GenBankaccession:DQ450948.1)，将相应的引物序列改为 5’ -CTGATCCGGTTTCCCTCGGA-3’ 和5，-GACCTGTCATTCTCCTCCTTG-3，，其余同实施例1。
[0050]备注说明:经常规方法验证，所得确为基因OsNPRl。
[0051]实验结果如图4所不，在感病品种IR24中，该基因没有受:白叶枯病菌的诱导表达；而在接菌的抗病品种IRBB7叶片的I区域(即距离剪口处Icm以内)，最显著地检测到该基因受诱导表达。
[0052]备注说明:受病 原菌诱导表达的水稻抗病相关基因OsNPRl也是一个公认的抗病标记基因，用以表明植物抗病系统的激活。
[0053]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法，采用Real-timePCR，其特征是: 在水稻叶片上采用剪叶法侵染白叶枯病菌，侵染46~50小时后，取距离剪口处Icm之内的叶片组织进行检测。
2.根据权利要求1所述的在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法，其特征是:在水稻分蘖期，在水稻叶片上采用剪叶法侵染白叶枯病菌。
3.根据权利要求1或2所述的在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法，其特征是: 所述表达基因为 0s03g0853200、OsPRlb, OsNPRl 等。
4.根据权利要求3所述的在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法，其特征是: 表达基因为0s03g0853200，引物为:
5， -GAGCAACGACCAACAAAAG-3，和 5， -GCAGAAAATGGGAAAGAAG-3，。
5.根据权利要求3所述的在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法，其特征是: 表达基因为OsPRlb，引物为:
5’ -GGCAACTTCGTCGGACAGA-3’ 和 5’ -CCGTGGACCTGTTTACATTTTCA-3 ’。
6.根据权利要求3所述的在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法，其特征是: 表达基因为OsNPRl，引物为:
5’ -CTGATCCGGTTTCCCTCGGA-3’ 和 5’ -GACCTGTCATTCTCCTCCTTG-3 ’。
【文档编号】C12Q1/68GK103966331SQ201410209468
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月17日 优先权日:2014年5月17日
【发明者】马伯军, 金彬, 孙青芝, 陈析丰 申请人:浙江师范大学