利用四环素调控的dcf1基因诱导表达系统及其构建方法
【专利摘要】本发明利用四环素调控的dcf1基因诱导表达载体及其构建方法。本发明利用四环素来调控DCF1在哺乳动物细胞中表达，构建了Tet-on四环素调控载体pTRE-EGFP-DCF1，与ptTS-Neo一起完成调控作用。共转染后，载体pTRE-EGFP-DCF1表达被抑制，加入强力霉素（Dox）后，载体pTRE-EGFP-DCF1被诱导表达。该系统可以在特定空间和时间诱导表达DCF1基因，有助于更好地研究DCF1基因的功能，具有调节效率高、无副作用、反应迅速等特点。
【专利说明】利用四环素调控的dcfl基因诱导表达系统及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用四环素调控的dcfl基因诱导表达载体及其构建方法。
【背景技术】
[0002]树突状细胞因子(Dendritic Cell Factor, DCFl)又被称为跨膜蛋白59(Transmembrane Protein59, Tmem59)。最早是在树突状细胞中发现而因此得名的，其被认为是一种在DC分化和迁移的过程中起作用的信号分子。根据本实验室前期的工作，在未分化的神经干细胞与分化的神经细胞内发现了 12个存在高度差异表达的序列表达标签(Express Sequences Tag，EST)，其中编号 SHDll 的序列与小鼠 EST BG172336 有 91% 的同源性，其包含117个氨基酸的开放阅读框，蛋白序列分析表明其与DFCl有98%的同源性。接下来的研究又发现，在小鼠神经干细胞系C17.2中过表达DCF1，可维持神经干细胞状态，而RNAi沉默DCFl表达，可引起C17.2神经干细胞进入分化状态，主要向胶质细胞分化(10%星形胶质细胞，1%神经元)。通过小分子MicroRNA-351下调DCFl表达时，C17.2神经干细胞也向胶质细胞分化。而且通过之前构建的荧光载体PEGFP-DCF1，发现在U251胶质瘤细胞系中过量表达而/1基因，可显著抑制U251细胞增殖、迁移、侵袭能力。
[0003]Gossen和Bujard最先描述了一种适用于哺乳动物细胞的四环素(Tetracycline,Tc)调控基因表达系统，可根据需求控制外源基因在细胞中的表达量和表达时间。四环素调控系统根据实验需求可分为Tet-off和Tet-on两种，其中Tet_off调控系统通过加入四环素或者强力霉素(Doxycycline, Dox)来停止基因的表达，而相反地，Tet-on系统则是在加入了四环素或强力霉素后基因才开始表达。我们根据实验需求，选择了构建Tet-on系统来调控而/1的表达。该系统包含两部分:四环素控制的转录抑制子(tetracyline-controlled transcriptional suppressor, tTS)与含有四环素反应原件的人巨细胞病毒启动子0°?^/。》)。tTS是一个很强的转录抑制子，是四环素抑制子蛋白(tetrepressor protein, TetR)与 Kid-1 蛋白的 KRAB-AB 沉默区域(SDKid-1)的融合蛋白。Amiod/w主要部分为四环素反应原件(Tet response element, TREmod),由7段重复的36bp碱基构成，每段36bp碱基中包含一段19bp的四环素操纵子序列(tet operator sequence,tetO、。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一在于克服现有技术中存在的问题，提供一种利用四环素调控的dcfl基因诱导表达载体。
[0005]本发明的目的之二在于提供该载体的构建方法。
[0006]为达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种利用四环素调控的dcfl基因诱导表达载体，其特征在于该载体为SEQ ID N0.1所不的喊基序列。
[0007]—种构建上述的利用四环素调控的dcfl基因诱导表达载体的方法，其特征在于该方法的具体步骤为:
a.以pSIREN-RetroQ-TetP为模板，用PCR酶扩增出长为330bp的TREmod;所述的酶扩增所用引物序列如下，下划线部分为AseI酶切位点:
上游引物:5 ’ -TTATCCATTAATCACTCCTTCTCTAG-3，；
下游引物:5’ -TCAAGTTACATTAATCATATGACCT-3’ ；
b.将步骤a所得TREmod片段割胶回收，酶切出粘性末端后，用碱性磷酸酶脱磷处理，再连接到载体pEGFP-DCFl的CMV启动子前的AseI位点中，即得到利用四环素调控的dcf\基因诱导表达载体。
[0008]本发明利用四环素调控系统的原理，结合DCFl表达载体pEGFP-DCFl，构建了一个全新的DCFl调控系统，该系统可以在特定空间和时间诱导表达DCFl基因，有助于更好地研究DCFl基因的功能，具有调节效率高、无副作用、反应讯速等特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1载体pTRE-EGFP-DCFl构建示意图
图2 pTRE-EGFP-DCFl的PCR鉴定与酶切鉴定。A图中1_7为所挑克隆，以其为模板用上游引物与下游引物进行鉴定，若连入了 TREmod片段，便能扩增出条带。8为pEGFP-DCFl，阴性对照。B)2-4为没有酶切过的克隆，作为对照。6-7为酶切后的克隆，若连入了 TREmod片段，酶切后释放出条带。I和5为pEGFP-DCFl，阴性对照。 [0010]图3 Hek293T细胞中转染调控质粒，转然后用荧光显微镜检测载体表达情况，可以看到当tTS与TREmod同时存在时，载体表达受到抑制。A图为转然后用荧光显微镜检测载体表达情况，可以看到当tTS与TREmod同时存在时,载体表达受到抑制。图中标尺，100 μ m。
[0011]图4 Hek293T细胞中转染调控质粒，使用Image-Pro Plus 6分析图3中转染图片(每组3张)，发现与其他情况相比tTS针对TREmod的抑制效果显著。(*p ^ 0.05，**p < 0.01)
图5加入Dox载体表达。通过荧光显微镜观察载体表达水平，Hek293T细胞中共转染ptTS-neo与pTRE-EGFP-DCFl后加入不同浓度的Doxycycline,载体的表达量随着Doxycycline的升高而升高。图中标尺，100μπι。
【具体实施方式】
[0012]实施例一:利用四环素调控的而/1基因诱导表达载体的构建方法，参见图1和图2。
[0013]载体PEGFP-N2的多克隆位点中插入DCFl基因，得到载体pEGFP-DCFl，具体方法参见文献(Xie Y, et al.(2014) Overexpression of DCFl inhibits glioma throughdestruction of mitochondria and activation of apoptosis pathway.Scientific reports4:3702.)。
[0014]a.以pSIREN-RetroQ-TetP为模板,用高保真PCR酶扩增出长为330bp的TREmod，所述的酶扩增所用引物序列如下，下划线部分为AseI酶切位点:
上游引物(Up primer):5’ -TTATCCATTAATCACTCCTTCTCTAG-3，；
下游引物(Low primer):5’ -TCAAGTTACATTAATCATATGACCT-3，；对TREmod进行PCR扩增的反应体系如下(20 μ I):
ddH20 12.5μ I
10XPCR buffer 2μ I
2.5mM dNTPs 2 μ I
Up primer I μ I
Low primer I μ I
Template I μ I
Pfu Taq0.5 μ I
PCR反应程序:
Stepl104 °C Wait
Step298 °C 8 min
Step398 °C 30 s
Step455 °C 30 s
Step572 °C 60 s
Step6Go to 2 Rep 32
Step772 °C 10 min
Step84 °C Hold ；
b.将步骤a所得TREmod片段割胶回收，酶切出粘性末端后，用碱性磷酸酶脱磷处理，再连接到载体pEGFP-DCFl的CMV启动子前的AseI位点，得到利用四环素调控的dcf\基因诱导表达载体。载体的PCR鉴定与AseI酶切鉴定如图2所示。酶切鉴定和基因测序表明成功构建重组载体pTRE-EGFP-DCFl。
[0015]片段与质粒载体酶切:
1)PCR产物经割胶回收后，进行AseI酶切。
[0016]TREmod片段酶切体系如下(50 μ I): ddH2024 μ I
IOXBuffer tango 10 μ I
TREmod回收产物 15 μ I (量可调整)
Ase II μ I
2)载体pEGFP-DCFl 酶切体系(50 μ I): ddH20 37 μ I
IOXBuffer tango 10 μ I
pEGFP-DCFl 2 μ I
Ase II μ I
将配制好的上述体系放入37°C孵育器中，反应时间为3小时左右。
[0017]碱性磷酸酶脱磷处理:
将上述酶切产物，经割胶回收，稍浓缩后，配制脱磷体系。
[0018]ddH202μ I FastAP I μ I IOXBuffer 2μ IpEGFP-DCFl 15 μ I
将配制好的上述体系放入37°C孵育器中，反应时间为10-15分钟左右，然后75°C 5-10分钟将碱性磷酸酶失活。
[0019]片段与质粒载体连接:
将上述酶切产物，经割胶回收，稍浓缩后。配制连接体系(8 μ I)。
[0020]pEGFP-DCFl 1.5μ I
TREmod 4.5 μ I
T4 Buffer 0.8 μ I
T4 ligase 1.2 μ I
16°C反应12-16小时。
[0021]实施例二:系统的调控效果，参见图3、图4和图5
2.1将调控载体pTRE-EGFP-DCFl与ptTS-neo共转染到HEK293T细胞中，可以看到在共转两种质粒的细胞中融合蛋白EGFP-DCF1表达量显著偏低，说明tTS对启动子PTREmod/cmv起到了抑制效果，如图4所示。
[0022]细胞转染具体步骤:
I)转染前准备好无内毒素质粒，测定浓度，用于转染。长期保存应置于_80°C。 [0023]2)本实验中的所有细胞转染均采用阳离子脂质体Lipofectamine ? 2000Transfection Reagent (Invitrogen, 11668-019)。
[0024]3)转染前一天，在不含抗生素的培养基中接种细胞。24小时后，待细胞密度为80%-90%时进行转染。
[0025]4)以24孔板一个孔为例,取I μ g无内毒素质粒与50 μ I无血清DMEM混匀，I μ ILipofectamine ? 2000与50 μ I无血清DMEM混匀，两者室温放置5分钟。质粒与Lipo2000用量要根据细胞系及细胞状态进行适时调整。
[0026]5) 5分钟后，将质粒混合物与Lipofectamine ? 2000混合物混合，用枪吹打混匀，
注意轻柔。室温放置20分钟。
[0027]6)将24孔板中培养基换成400 μ I无血清DMEM。
[0028]7)将转染混合溶液加入24孔板中，轻柔摇晃孔板，使溶液混匀，置于C02培养箱(37°C，5%C02)中培养。
[0029]8) 6小时后，将无血清DMEM培养基换成含10% FBS-DMEM,继续培养。RNA抽提一般于转染后24小时,蛋白抽提及免疫荧光于转染后48小时。
[0030]2.2当加入不同浓度的Doxycycline后,载体开始表达,表达量与加入的Dox浓度呈正相关，且Dox大于0.75 μ g/ml时，载体的表达量达到最高，如图5所示。
【权利要求】
1.一种利用四环素调控的而/I基因诱导表达载体，其特征在于该载体为SEQ ID N0.1所不的喊基序列。
2.—种构建根据权利要求1所述的利用四环素调控的而/1基因诱导表达载体的方法，其特征在于该方法的具体步骤为: a.以pSIREN-RetroQ-TetP为模板，用PCR酶扩增出长为330bp的TREmod;所述的酶扩增所用引物序列如下，下划线部分为AseI酶切位点: 上游引物:5 ’ -TTATCCATTAATCACTCCTTCTCTAG-3，； 下游引物:5’ -TCAAGTTACATTAATCATATGACCT-3’ ； b.将步骤a所得TREmod片段割胶回收，酶切出粘性末端后，用碱性磷酸酶脱磷处理，再连接到载体pEGFP-DCFl的CMV启动子前的AseI位点中，即得到利用四环素调控的dcf\基因诱导 表达载体。
【文档编号】C12N15/63GK103993029SQ201410210708
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月19日 优先权日:2014年5月19日
【发明者】文铁桥, 严煌, 黄晨, 杨眉, 吴喨 申请人:上海大学