稻米叶宽分子标记flw-7及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种水稻LOC_07g1200的核苷酸序列的分子标记FLW-7，以水稻作为物种，所述分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，FLW-7，正向：TGGGTGCTTCTTTTGTGGGA；反向：TGCAGTTGTGAAGAAGTGGAGA。本发明还同时提供了上述分子标记FLW-7的开发方法。本发明的分子标记FLW-7的用途是：用于水稻上三叶叶片宽度的鉴定和/或其后代宽叶植株的辅助选择育种。具体为：当筛选培矮64S和扬稻6号的后代时，选择后代中带型与扬稻6号带型一致的单株用于宽叶株型育种。
【专利说明】稻米叶宽分子标记FLW-7及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于农业生物技术工程，特别涉及与水稻叶片宽度有关的分子标记及其获得方法和用途。
【背景技术】
[0002]叶片是植物进行光合作用和蒸腾作用的直接器官。植物通过叶片进行光合作用，把光能转变成植物生长发育所必须的化学能，是地球上一切动物的生命源泉，同时也是人类社会的主要物质和能量的来源[1]。叶片也可以通过蒸腾作用促进植物体中水分、养分和矿物质等的运输[2]。水稻叶片是水稻生产和输出同化产物的“源”器官，对生命活动的正常运转有着重要的作用。叶片形态是影响株型的主要因素，近年来，在水稻育种领域，先后有多位育种家提出了水稻高产理论株型模式，都提到了叶片形态的育种。水稻叶片形态是理想株型育种的重要目标之一。因此，水稻叶片形态直接影响到水稻产量的高低。
[0003]在水稻的高产育种及株型改良中，叶片形状一直是水稻遗传育种家关注的焦点之一[3]。水稻是一个多型性作物，叶片的形态也极其多样。在一般的栽培品种中，水稻叶片通常为平展叶，少数品种叶片为卷叶、披叶、窄叶等。
[0004]前人对模式植物拟南芥和玉米的卷叶突变体研究发现，叶片近轴/远轴面的发育影响叶片的卷曲度。位于叶片上表皮泡状细胞形态是影响叶形的最主要细胞结构之一；泡状细胞的膨胀与渗透压，也是影响叶片卷曲的重要因素。生理研究显示，在水分胁迫下，泡状细胞失水收缩，叶片卷曲；当去除胁迫，则泡状细胞吸水膨胀，叶片恢复原状。几乎所有涉及叶片卷曲的基因都或多或少的影响泡状细胞的发育。因此，可以推测，泡状细胞生长的状况与叶片的卷曲也是密切相关的。在缺水、干旱或重金属污染等外界环境因子影响下产生的水稻叶片的卷曲，最直接的反应也是泡状细胞的膨胀与渗透压两个方面受到了影响。而目前科学家们普遍认可的细胞决定新理论认为，自身基因水平的遗传因素是决定水稻叶片形态建成的主要因素，并开展了大量的水稻叶形分子调控层面的遗传与机理研究。借助水稻卷叶的突变体分离克隆多个叶形基因，至今已报道了 8个影响叶片近轴/远轴面发育的基因，包括SRL1、SLL1、RL9、ACL1/ACL2、ADL1和Roc5等^9]。水稻叶片中多个细胞类型、组织结构产生变异都可能导致叶片形态发生变化，目前发现最常见的导致叶片发生卷曲的组织细胞结构包括各级大小叶脉中的维管束组织、角质层及维管束两侧的泡状细胞[1°]。
[0005]生长素，作为一种植物激素，精密地调节着茎尖分生组织的叶原基分化和叶发育的细胞生长，与窄叶性状密切相关。在已克隆的3个窄叶基因NAL7、NALl及NRLl中，基因NAL7与NALl就分别涉及到生长素的生物合成与极性运输；而NRLl则通过调控叶片维管组织的发育，影响叶片宽度。
[0006]NAL7编码的是YUCCA家族的一个含核黄素的单加氧酶，参与生长素的生物合成。该基因的突变，引起生长素含量变化；与野生型相比，突变体在叶基部生长素含量下降，而在穗部及4日龄秧苗地上部 中生长素含量上升。该突变体中生长素含量的变化最终导致窄叶突变性状的出现[11]。NALl编码一个植物特有的生物学功能未知的蛋白，其主要在维管组织中表达。该基因的突变使得生长素的极性运输能力下降，进而影响到维管组织的发育与分布。突变体叶片中两条平行主脉之间的小脉数目比野生型明显减少，造成窄叶表型[12]。NRLl编码一个类纤维素合成酶蛋白D4(0sCslD4)。在抽穗阶段，该基因在生长旺盛的器官中表达更高，如根部、叶鞘和穗；而该基因的突变，使其表达量下降，叶片纵脉数减少，表现
窄叶[13]。
[0007]培育高产超高产的水稻品种,一直是水稻育种工作者的永恒目标。水稻叶片形态作为理想株型的重要组成部分，研究并筛选出生产上最有利用价值的叶形基因，对水稻理想株型育种具有十分重要的意义。传统高产育种与栽培措施相结合已经对水稻产量的提高做出了很大的贡献，再提高的潜力已经非常小。随着转基因技术的不断完善，定点改造成为可能。虽然当前水稻育种中叶片形态的优化主要还是通过传统的育种手段，然而借助转基因技术进行聚合育种，将有利基因聚合到现有的优良水稻品种中，更高效的完善株型结构。
[0008]上文中涉及的参考文献如下:
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【发明内容】
[0022]本发明要解决的技术问题是提供一种与水稻叶片宽度有关的分子标记及其开发方法和用途，本发明所得的分子标记FLW-7为水稻叶片宽度基因标记，能用于水稻叶形的辅助选择育种。
[0023]为了解决上述技术问题，本发明提供一种与水稻叶片宽度基因标记，以水稻作为物种，该分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5' —3'，
[0024]FLW-7 正向:TGGGTGCTTCTTTTGTGGGA ;
[0025]反向:TGCAGTTGTGAAGAAGTGGAGA。
[0026]本发明还提供了上述分子标记的开发方法，包括以下步骤:[0027]I)、以宽叶籼稻品种扬稻6号(93-11)作为宽叶基因供体亲本与窄叶的籼稻培矮64S(PA64S)进行杂交、回交和自交，从而获得后代的宽叶水稻单株；
[0028]2)、用 CTAB (十六烷基三乙基溴化铵,Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法提取水稻亲本幼苗及后代幼苗的基因组DNA ；
[0029]3)、采用STS (插入/缺失片段,insertion/deletions)分子标记方法进行水稻叶片宽度分子标记的筛选；
[0030]4)、鉴定出一个STS分子标记FLW-7。
[0031]本发明还同时提供了分子标记FLW-7的用途:用于水稻上三叶叶片宽度的鉴定和/或其后代宽叶植株的辅助选择育种。
[0032]作为本发明的分子标记FLW-7的用途的改进:当筛选培矮64S (PA64S)和扬稻6号(93-11)的后代时，选择后代中带型与扬稻6号(93-11)带型一致的单株用于宽叶株型育种。
[0033]与水稻叶片宽度相关的分子标记FLW-7，具体是用下述方法得到的:
[0034]I)、根据水稻基因注释网站(http://rice.plantbiology.msu.edu)公布的L0C_07gl200核苷酸序列，设计、发展STS分子标记，用于检测窄叶亲本培矮64S和宽叶亲本93-11的多态性；通过测序以进一步确定引物FLW-7区间的序列在窄叶的培矮64S和宽叶的93-11之间的差异；通过杂交、回交和自交结合标记辅助选择，获得培矮64S背景的宽叶的水稻新种质；
[0035]2)、用CTAB法提取水稻亲本幼苗及后代幼苗基因组DNA ；
[0036]3)、采用STS分子标记方法进行水稻叶片宽度分子标记筛选宽叶的水稻新种质；
[0037]4)、鉴定出一个STS分子标记FLW-7，经多态性检测，发现其与水稻叶片宽度相关联。
[0038]采用STS分子标记FLW-7进行水稻叶片宽度筛选的方法具体是:
[0039](I)、STS标记在叶片宽度不同的培矮64S和93_11的DNA多态性分析:
[0040]根据L0C_07gl200的核苷酸序列，设计、发展STS分子标记FLW-7，用于检测窄叶培矮64S和宽叶的93-11之间的多态性。引物委托上海申能博彩公司合成，在PTC-225PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为:20ng/ul水稻基因组DNAlul, 10XPCR Buffer2.0ul, 25mMMgCl22.0ul, 2mM dNTP2.0ul, IOuM 引物 2.0ul (正反向引物各 1.0ul), 5U/ul Taq DNA 聚合酶
0.2ul，ddH2010.8ul，总体系20ul。反应程序:95°C变性5分钟；94°C变性I分钟，55°C退火I分钟，72°C延伸I分钟，40个循环；72°C补齐10分钟；产物检测:在含有0.5% ug/ul EB的4.0%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。
[0041](2)、STS标记FLW-7的序列区间在窄、宽叶片品种培矮64S和93_11间的基因组序列差异:
[0042]根据获得的STS分子标记FLW-7，用于PCR扩增窄叶品种培矮64S和宽叶品种93-11的基因组序列，PCR扩增产物委托上海英骏生物技术有限公司进行测序分析。PCR扩增参照上述(I)进行 ，PCR产物的回收选用北京百泰克生物技术有限公司开发的PCR产物回收试剂盒(离心柱型，目录号:DP1403)。
[0043](3)、利用STS标记FLW-7开展宽叶选择育种:
[0044]宽叶基因供体亲本籼稻品种93-11，与窄叶品种培矮64S进行杂交，通过回交、自交结合标记辅助选择，将宽叶93-11中L0C_07gl200等位基因导入到窄叶培矮64S中，选择分离群体中带型与93-11带型一致的单株用于育种改良，获得了若干份PA64S背景并带93-11的L0C_07gl200等位基因的材料；收获这些植株上所结的种子，检测其叶片宽度，发现其叶宽增加。
[0045]水稻叶形是理想株型的重要组成部分。本发明采用分子生物学方法以宽叶的93-11为材料，发展和筛选新的、而且稳定的能增加叶片宽度的分子标记及其方法，用于水稻叶形的辅助选择育种；由于研究所用的材料能有效增加叶片宽度，其对水稻理想株型的建成具有普遍性。
[0046]本发明创造了水稻叶形建成相关L0C_07gl200的STS标记FLW-7。利用这种方法，不仅克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点，可以有目标地将宽叶93-11的L0C_07gl200等位基因在实验室内选择获得并有目的地进行多个理想株型调控基因的聚合，从而培育出具水稻理想株型高产新品种。在本发明中，当所得植株经检测出现培矮64S的条带或同时出现93-11+培矮64S的条带时，我们判定其属于窄叶的水稻；当所得植株经检测出现93-11的条带时，我们判定其属于宽叶水稻。
[0047]本发明可适用93-11和培矮64S之间的标记选择。因此，本发明的结果在水稻理想株型育种实践中具有重要意义。其优点具体归纳如下:
[0048](I)本发明的能调控水稻叶宽的分子标记，是在通过窄叶培矮64S与宽叶的93-11杂交、回交和自交中筛选获得的，能显著增加叶片宽度，而且稳定存在，可用于水稻理想株型的辅助选择育种。
[0049](2)本发明依据的是水稻叶形相关L0C_07gl200的核苷酸序列发展而获得的STS分子标记，极大提高了辅助选择的效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0050]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0051]图1是STS标记FLW-7在窄叶品种培矮64S(PA64S)和宽叶品种93-11的电泳谱带图；
[0052]图2是引物FLW-7在PA64S、93_11的PCR扩增片段序列及差异比较；
[0053]图2-1为STS分子标记FLW-7在PA64S扩增片段序列；
[0054]图2-2为STS分子标记FLW-7在93_11扩增片段序列；
[0055]注:带下划线的碱基为FLW-7标记前后引物；带双下划线)的碱基为93-11中特有插入序列；方框内碱基为PA64s和93-11核苷酸差异。
[0056]图3是亲本及不同叶片宽度的后代选择单株的STS标记FLW-7电泳谱带图；
[0057]注:M — Marker ;NL—窄叶纯合单株;WL —宽叶纯合单株；NF—窄叶杂合单株。
[0058]图4是STS分子标记FLW-7不同带型的后代单株上三叶宽度(即，标记FLW-7辅助选育的13份材料的上三叶平均宽度)；
[0059]注:WL—宽叶单株；NL—窄叶纯合单株；NF—窄叶杂合单株。
【具体实施方式】
[0060]实施例1、用STS标记FLW-7鉴定水稻叶片宽度的培矮64S和宽叶的籼稻93_11的多态性
[0061]具体做法是:从中国水稻研究所种质资源库中选取水稻材料培矮64S和宽叶93-11，用培矮64S和宽叶93-11杂交获得其Fl，利用引物FLW-7鉴定其多态性(图1)。
[0062]一、提取 DNA
[0063]I)、配制DNA提取缓冲液:
[0064]按顺序依次加I 体积的 DNA 提取溶液(0.35M sorbitol ；0.1M Tris, pH8.2 ；0.005MEDTA ;其余为水)，I 体积的核裂解液(0.2M Tris, pH7.5 ；0.05Μ EDTA ；2M NaCl ；0.055ΜCTAB ;其余为水)和0.4体积的5% (质量浓度)sarkosyl溶液(即十二酰-N-甲基甘氨酸钠的水溶液)；最后加入亚硫酸氢钠，配制成DNA提取缓冲液；亚硫酸氢钠在DNA提取缓冲液中的终浓度为0.02M。
[0065]上述DNA提取溶液的制备方法为:在0.35mol的sorbitol (山梨糖醇)、0.Imol的Tris(三羟甲基氨基甲烷，pH8.2)、0.005mol的EDTA(乙二胺四乙酸)中加水定容至1L。
[0066]上述核裂解液的制备方法为:在(X2m0l的Tris (三羟甲基氨基甲烷，ρΗ7.5)、
0.05mol的EDTA (乙二胺四乙酸)、2mol的NaCl (氯化钠)、0.055mol的CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)中加水定容至1L。
[0067]2)、对上述培矮64S、宽叶93-11、Fl的水稻叶片分别进行如下处理:
[0068]①、称取0.1g的水稻叶片用液氮研磨成粉状，然后加入700 μ I的上述步骤I)配制的DNA提取缓冲液，65°C水浴40分钟。再加700 μ I的氯仿:异戊醇(24:1的体积比)，并混匀。10，OOOrpm离心5分钟，将上清液转移到新的离心管中。
[0069]②、在上述步骤①离心后所得的上清液中加2/3~I倍体积预冷(至4°C )的异丙醇，轻轻混匀至DNA沉淀。13，OOOrpm离心8分钟,倒出上清液。
[0070]③、再用70% (体积浓度)的乙醇200 μ I洗涤上述步骤②所得的DNA沉淀物。
[0071]④、将上述洗涤后的DNA晾干并溶于100 μ I TE缓冲液或纯水中。
[0072]⑤、紫外分光光度法检测上述步骤④所得的DNA样品的浓度，0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。完整合适的DNA用于PCR扩增，不完整的DNA则重新提取，直至获得完整的DNA。
[0073]二、PCR 扩增
[0074]I)、反应体系:
[0075]水稻基因组DNA20ng/ul Iul，10XPCR Buffer2.0ul，25mM MgCl2 2.0ul，2mMdNTP2.0ul，IOuM 正反向引物各 1.0ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶 0.2ul, ddH2010.8ul,总体系20ul。
[0076]所述引物为:FLW-7正向:TGGGTGCTTCTTTTGTGGGA ；
[0077]反向:TGCAGTTGTGAAGAAGTGGAGA。
[0078]2)、反应程序:
[0079]95°C变性5分钟；94°C变性I分钟，55°C退火I分钟，72°C延伸I分钟，40个循环；72°C补齐10分钟。
[0080]三、电泳检测:
[0081]取扩增产物20ul，用4.0%的琼脂糖凝胶(含有0.5% ug/ul EB)电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。如图1所示。[0082]在图1 中，培矮 64S 为 201bp 的条带，93-11 为 232bp 的条带，“F1”为 201bp+232bp的条带。
[0083]根据图1，我们能得出下述结论:STS分子标记FLW-7能够检测93_11和培矮64S之间的多态性，且培矮64S的PCR扩增产物片段要小于93-11，由此表明FLW-7能用于93_11和培矮64S之间的分子检测及其后代的标记辅助选择。
[0084]实施例2、用STS分子标记FLW-7鉴定窄叶品种培矮64S和宽叶籼稻93_11的序列
差异
[0085]具体做法是:应用STS分子标记FLW-7对培矮64S和93_11的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物委托上海英骏生物技术有限公司进行测序，比较其序列的差异(图2)。
[0086]一、提取 DNA
[0087]同实施例1。
[0088]二、PCR 扩增
[0089]同实施例1。
[0090]三、PCR产物的回收
[0091]PCR产物的回收选用北京百泰克生物技术有限公司开发的PCR产物回收试剂盒(离心柱型，目录号:DP1403)，参照产品说明要求进行，回收的PCR产物委托上海英骏生物技术有限公司进行测序。
[0092]根据图2，我们能得出以下结论:培矮64S和宽叶93-11的FLW-7扩增产物存在31个碱基大小差异(如图2中双下划线标记的碱基序列)。这是我们能够使用STS分子标记FLW-7检测出其多态性的原因所在，也是我们能用于其后代标记辅助选择的遗传基础。
[0093]实施例3、利用STS标记FLW-7开展宽叶水稻的辅助选择育种
[0094]具体做法是:宽叶供体亲本品种93-11与窄叶亲本培矮64S依次进行杂交、回交和自交，对所得后代结合分子标记FLW-7的辅助选择，选择分离群体中带型与93-11带型一致的单株用于育种改良。
[0095]一、提取 DNA
[0096]同实施例1。
[0097]二、STS标记检测
[0098]I)、PCR 扩增
[0099]同实施例1的步骤二。
[0100]2)、电泳检测
[0101]同实施例1的步骤三。
[0102]三、STS分子标记FLW-7开展水稻叶形的辅助选择育种[0103]宽叶供体亲本籼稻品种93-11与窄叶品种培矮64S进行杂交、回交和自交，结合分子标记FLW-7的辅助选择，选择分离群体中带型与93-11带型一致的单株进一步用于育种改良(图3)，淘汰带型与窄叶品种培矮64S的带型一致和杂合带型(同时具有培矮64S和93-11带型)的个体，育种材料的上三叶宽度根据齐穗期的平均宽度进行检测。分析表明，所选择的带93-11带型的5个单株的叶片宽度均比轮回亲本培矮64S明显增加(图4)。该实验结果表明:STS标记FLW-7可以用于水稻叶片宽度的辅助选择育种。
[0104]备注说明:[0105]图3和图4中的“WL1~WL5”均为93-11和培矮64S依次进行杂交、回交和自交获得的，且是选择了 “带型与93-11带型一致”的单株。
[0106]对比例1、利用STS标记FLW-7判别水稻上三叶宽度。
[0107]具体做法是:将实施例3的步骤三中被淘汰的带型，即与培矮64S的带型一致以及杂合带型(同时具有培矮64S和93-11带型)的个体继续进行种植，通过对其后代水稻单株上三叶宽度进行测定，进一步分析分子标记FLW-7辅助选择的可靠性。
[0108]一、提取 DNA
[0109]同实施例1。
[0110]二、STS标记检测
[0111]I)、PCR 扩增
[0112]同实施例1。
[0113]2)、电泳检测
[0114]同实施例1。
[0115]三、STS标记FLW-7判别上三叶平均宽度:
[0116]随机选择了在实施例3的步骤三中被淘汰的5个带型与培矮64S —致的单株继续种植，经STS分子标记FLW-7检测，其后代均表现与培矮64S —致的带型，分别在成熟期检测这些单株上三叶的平均宽度。另外，随机选择其中I个杂合带型(同时具有培矮64S和93-11带型)的个体用于继续种植，在其后代中随机选取20个单株，STS分子标记FLW-7检测表明，该20个单株中有5个单株表现93-11带型，10个单株表现杂合带型，5个表现培矮64S带型，符合1:2:1的分离关系；在成熟期，分别检测这些单株上三叶的平均宽度。表1是这20个单株(株系)的上三叶平均宽度，5个与93-11带型一致的单株叶宽显著的高于培矮64S的宽叶；而在带型杂合10个后代单株的上三叶叶片宽度均小于与93-11带型一致的单株；5个呈培矮64S带型的单株，其上三叶叶片平均宽度类似亲本培矮64S。该实验结果表明:STS分子标记FLW-7可以用于判别水稻上三叶的叶片宽度。
[0117]表1.水稻叶片上三叶平均宽度及其对应的基因型
[0118]
【权利要求】
1.水稻L0C_07gl200的核苷酸序列的分子标记FLW-7，以水稻作为物种，其特征是:所述分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5' —3'， FLW-7 正向:TGGGTGCTTCTTTTGTGGGA ; 反向:TGCAGTTGTGAAGAAGTGGAGA。
2.如权利要求1所述的分子标记FLW-7的开发方法，其特征是包括以下步骤: 1)、以宽叶籼稻品种扬稻6号作为宽叶基因供体亲本与窄叶的籼稻培矮64S进行杂交、回交和自交，从而获得后代的宽叶水稻单株； 2)、用CTAB法提取水稻亲本幼苗及后代幼苗的基因组DNA； 3)、采用STS分子标记方法进行水稻叶片宽度分子标记的筛选； 4)、鉴定出一个STS分子标记FLW-7。
3.如权利要求1所述的分子标记FLW-7的用途，其特征是:用于水稻上三叶叶片宽度的鉴定和/或其后代宽叶植株的辅助选择育种。
4.根据权利要求3所述的分子标记FLW-7的用途，其特征是:当筛选培矮64S和扬稻6号的后代时，选择后代中带型与扬稻6号带型一致的单株用于宽叶株型育种。
【文档编号】C12Q1/68GK104004754SQ201410215059
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月20日 优先权日:2014年5月20日
【发明者】张光恒, 钱前, 王莉, 曾大力, 胡江, 朱丽, 高振宇, 徐杰, 郭龙彪, 董国军, 任德勇, 颜美仙 申请人:中国水稻研究所