一种蛹虫草Rhf1基因失活的工程菌以及蛹虫草Rhf1基因的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种蛹虫草Rhf1基因失活的工程菌以及蛹虫草Rhf1基因的应用。本发明筛选得到一株菌丝分支繁多、菌球生物量增多、原基分化提前、子实体粗壮、子实体收获时间缩短以及子实体干重增加的蛹虫草突变子g38。经过实验发现，其是由于菌丝分裂蛋白基因插入失活，进一步，本发明证实，菌丝分裂蛋白基因与菌丝分枝、分生孢子梗分化、原基分化速度、子实体的粗细或子实体产量相关。因此，本发明为在蛹虫草的栽培过程中，缩短栽培时间、提高子实体产量等提供了一条解决途径。
【专利说明】—种蛹虫草Rhfl基因失活的工程菌以及蛹虫草Rhfl基因的应用
【技术领域】:
[0001]本发明属于生物基因工程领域，具体涉及一种蛹虫草Rhfl基因失活的工程菌以及蛹虫草Rhfl基因的应用。
【背景技术】:
[0002]冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是中国传统的珍贵中药，需求量大且价格高昂。但是，冬虫夏草产量急剧下降，而且到目前为止仍不能人工培养。蛹虫草(Cordyc印smilitaris)具有冬虫夏草类似的功效，成为冬虫夏草的首选代用品。在蛹虫草人工商业栽培过程中，如何解决菌种退化、缩短栽培时间、提高子实体产量和活性成份含量以及增强蛹虫草感染昆虫能力等，是核心技术问题。
[0003]作为传统的中草药，蛹虫草的基因组DNA中没有含任何已知对人体有害的真菌毒素基因，这为蛹虫草安全性提供了基因水平的证据。蛹虫草比较重要的药理活性物质是虫草素、虫草酸、多糖和留醇。虫草中所含一系列的药用活性物质，都被很好的研究。
[0004]2011年蛹虫草的基因组DNA已经测序完成，2014年在NCBI中可以查到各基因的DNA序列，为蛹虫草的深入研究及应用提供了基因水平的支持。和粗糙脉饱菌相似的是，蛹虫草基因组DNA中含有完整的RNAi途径所需要的各种元件。
【发明内容】
:
[0005]本发明的第一个目的是提供一种菌丝分裂蛋白基因(Rhfl)失活的蛹虫草工程菌。
[0006]本发明以蛹虫草JM4为材料，利用根癌农杆菌介导转化(ATMT)方法，将载体pKHt-gfp导入到蛹虫草JM4的分生孢子中，构建蛹虫草真菌的突变子库，筛选和测定影响蛹虫草生长性状的突变株。从中筛选出一株菌丝分支繁多、菌球生物量增多、原基分化提前、子实体粗壮、子实体收获时间缩短以及子实体干重增加的蛹虫草突变子g38。其在固体PPDA平板培养时，蛹虫草突变子g38只是扁平贴在培养基上生长，不像野生型蛹虫草JM4那样可以蓬松的向上生长；在固体培养过程中可以看到蛹虫草突变子g38向外扩增速度极慢，生长圈很小。液体PPDA培养7天后，在显微镜下可以看到蛹虫草突变子g38菌丝分枝增多、有二极分枝形成；液体培养的菌球紧实、轮廓清晰、菌液澄清偏黄色；经过冷冻干燥，发现相同处理培养的菌球生物量比野生型的高。
[0007]蛹虫草突变子g38在子实体培养过程中发现:g38的原基分化比野生型提早2周左右、子实体粗壮、子实体收获也相应提前2周；子实体产量也较高、含水量相对野生型的低约I %。
[0008]Tail-RCR获得突变子g38的突变基因为菌丝分裂蛋白基因(Rhfl)。该菌丝分裂蛋白基因(Rhfl),其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示,其genbank登录号为Sequence ID:ref I XM_006667964.1 ("GeneID: 18164839)，在 genbank 中其的描述是 Cordyceps militarisCMOlfilamentat1n protein (Rhfl), putative,其是应用生物信息学对其进行预测的，并没有确切的证据证明其功能的。qRT-PCR检测显示g38菌株的Rhfl基因转录水平仅为野生型的30%-40%。Rhfl基因总长为4495bp，含5个内含子和6个外显子，cDNA长为3969bp，蛋白大小为1322aa。Southern blot显示Rhf I在蛹虫草基因组中以单拷贝形式存在。
[0009]为了验证Rhfl的功能，构建了 Rhfl基因的RNAi质粒(带双元反向启动子gpd和PtrpC)和Rhfl (只带gpd启动子)的过表达载体。
[0010]以ATMT方法，构建了蛹虫草Rhfl基因过表达突变子、蛹虫草Rhfl基因RNAi突变子和ARhfl突变子g38的恢复突变子库。利用qRT-RCR筛选到合适的转化子，进行后续研究。结果发现:
[0011]在野生型蛹虫草JM4中，Rhfl基因表达被干扰时，突变子会出现菌丝分枝变多、原基诱发时间提前和子实体粗短的现象。
[0012]在野生型蛹虫草JM4中，过表达Rhfl基因时，突变子会出现菌隔变短、分生孢子梗高度分化的现象；当分生孢子梗成熟时可分裂出大量孢子，产孢量是野生型的10倍以上；但是相对的，孢子形成会延迟3天以上。在JM-OERhfl转化子进行子实体培养时，其原基诱发时间推 迟或者没有原基形成，无法形成子实体。
[0013]补偿g38突变子的Rhfl基因表达时，气生菌丝有不同程度的恢复，分枝变少。同时，在38-0ERhfl转化子进行子实体培养时，其原基诱发时间比g38有所推迟，推迟的程度与Rhfl基因补偿的程度成正比，但子实体与g38的收获时间相差不多。补偿Rhfl基因的g38突变子，其生长形态介于野生型和g38之间。
[0014]结果证明:Rhfl基因参与蛹虫草的菌丝分枝、分生孢子梗分化、原基分化及子实体形态建成等功能。在蛹虫草中，Rhfl基因表达量与菌丝分枝成负相关，表达量越低分枝越多；Rhfl基因表达量与分生孢子梗分化成正相关，表达量提高使梗的分化变复杂，延迟分生孢子的形成；Rhfl基因表达量与原基分化速度成负相关，Rhfl基因表达量越小蛹虫草的原基分化越快；Rhfl基因表达量与子实体的粗细成负相关，表达量越小子实体越粗壮。
[0015]因此，本发明的第一个目的是提供一种菌丝分裂蛋白基因(Rhfl)失活的蛹虫草工程菌，失活菌丝分裂蛋白基因(Rhfl)能够使菌丝分支繁多、菌球生物量增多、原基分化提前、子实体粗壮，从而使子实体收获时间缩短以及子实体产量增加。
[0016]所述的菌丝分裂蛋白基因(Rhfl)失活的蛹虫草工程菌可以是本发明的蛹虫草突变子g38，其Rhfl基因的第684bp后面插入T-DNA，并且其Rhfl基因的第685_723bp缺失。本发明的第二个目的是提供核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的菌丝分裂蛋白基因在控制菌丝分枝、分生孢子梗分化、原基分化速度、子实体的粗细、缩短栽培时间和/或提高子实体产量中的应用。
[0017]本发明筛选得到一株菌丝分支繁多、菌球生物量增多、原基分化提前、子实体粗壮、子实体收获时间缩短以及子实体干重增加的蛹虫草突变子g38。经过实验发现，其是由于菌丝分裂蛋白基因插入失活，进一步，本发明证实，菌丝分裂蛋白基因与菌丝分枝、分生孢子梗分化、原基分化速度、子实体的粗细或子实体产量相关。因此，本发明为在蛹虫草的栽培过程中，缩短栽培时间、提高子实体产量等提供了一条解决途径。
【专利附图】
【附图说明】:[0018]图1是菌丝生长图；A:JM4生长4周；B:g38生长4周；
[0019]图2是菌丝生长速度JM4和g38生长4周的菌丝直径柱形图；柱形图上不同字母表不差异显著(ρ〈ο.0oi)；
[0020]图3是液体培养的菌球图，A:液体PPDA培养的菌球；Β:液体培养的菌球形状；C:冷冻干燥后菌球形状；
[0021]图4是液体培养的菌球干重图，JM4和g38的菌球干重，柱形图上不同字母表示差异显著(ρ〈0.05)；
[0022]图5是PPDA液体培养7天的菌丝图，液体培养7天的蛹虫草JM4和g38的菌丝，标尺=50 μ m ；
[0023]图6是液体培养7天的孢子浓度JM4和g38孢子浓度柱形图，柱形图上不同字母表不差异显著(ρ〈ο.0oi)；
[0024]图7是蛹虫草JM4和g38原基分化和子实体生长的差异图，A:接种14天后，JM4完全没有原基诱发，而g38原基分化完成；B:接种21天后，JM4没有原基诱发，而g38已经有子实体生长接种后，22 C黑暗的条件下培养7天完成囷丝生长，然后在12:12小时光暗条件下进行子实体生长；
[0025]图8是蛹虫草JM4和g38的子实体图，g38的子实体比野生型JM4的粗壮；
[0026]图9是蛹虫草JM4和g38的产量图，相同处理条件下，g38的子实体产量稍高于JM4 ;柱形图上不同字母表示差异显著(p〈0.05)；
[0027]图10是蛹虫草JM4和g38子实体含水量图，相同条件下，野生型JM4子实体的含水量高于g38;柱形图上不同字母表示差异显著(p〈0.05)；
[0028]图11是TAIL-PCR扩增g38转化子的侧翼序列，M:ffide Range DNAMarker (100-6000) ；M1:DL2000DNA Marker ;L1_L3:左边界第一、二、三轮 TAIL-PCR 反应产物；R1_R3:第一次右边界的第一、二、三轮TAIL-PCR反应产物；R4_R6:第二次右边界的第一、二、三轮TAIL-PCR反应产物；
[0029]图12是蛹虫草JM4中Rhfl基因的southern blot鉴定；探针:DIG_标记的Rhf 1-NG片段；C:阳性对照 1T-Rhfl-NG 质粒；1-3 AIijSXba I，Sal I，Bgl II 酶切的 JM4 基因组DNA产物；
[0030]图13是RT-PCR分析不同培养时间的野生型JM4和g38中Rhfl基因的表达情况，JM4-7:野生型JM4培养7后Rhfl基因的表达；g38_7:g38培养7天后Rhfl基因的表达；JM4-14:野生型JM4培养14后Rhfl基因的表达；g38_14:g38培养14天后Rhfl基因的表达;
[0031]图14是过表达质粒图谱；
[0032]图15 是 OE 载体双酶切鉴定；M:ffide Range DNA Marker (100-6000) ； 1-4 =BamHI 和EcoRI双酶切OE载体的结果；
[0033]图16 是 XbaI 酶切 OE 载体和 Rhfl 基因，M:ffide Range DNA Marker (100-6000)，1-2 =Rhfl片段和OE载体的XbaI酶切结果；
[0034]图17 是 OERhfl 重组质粒酶切鉴定；M:ffide Range DNA Marker (100-6000)，1-4:XbaI酶切鉴定OERhfl重组质粒；
[0035]图18是RNAi表达质粒图谱；[0036]图 19 是 RNAi 载体双酶切鉴定；M:ffide Range DNA Marker (100-6000)，1-6:Kpn I和Pst I双酶切鉴定RNAi载体；
[0037]图20 是 Kpn I 和 XbaI 酶切 Rhf 1-5 片段和 RNAi 载体，M:ffide Range DNAMarker (100-6000)，1-2:Kpn I 和 XbaI 双酶切 Rhf 1-5 片段和 RNAi 载体；
[0038]图21 是 iRhfl 重组质粒酶切鉴定，M:ffide Range DNA Marker (100-6000)，1-5:Kpn I和XbaI酶切鉴定iRhfl重组质粒；
[0039]图22是JM-1RhfI突变子的筛选，1-10:JM_iRhfI突 变子；
[0040]图23是JM-OERhfl突变子的筛选，1-10 =JM-OERhfl突变子；
[0041]图24是38-0ERhfl突变子的筛选，1-10:38_0ERhfl突变子；
[0042]图25是JM4，g38和JM_iRhf I突变子的菌丝形状；
[0043]图26是JM-1Rhf I突变子的原基分化，JM-1Rhf突变子的原基分化比野生型JM4早，比g38的晚；
[0044]图27是JM-1Rhfl突变子的子实体培养，JM-1Rhf突变子的子实体比野生型的粗短；
[0045]图28是JM-1Rhfl突变子的子实体形状；
[0046]图29是液体培养7天后，JM4和JM-OERhfl突变子的菌丝生长；
[0047]图30是液体培养10天后，JM-OERhfl的分生孢子梗成熟,分裂成分生孢子，A:成熟的分生孢子梗从菌丝脱落；B:分生孢子梗分裂出分生孢子(bar = 20ym)；
[0048]图31是液体培养10天后，JM-OERhfl的菌丝；
[0049]图32是JM4和JM-OERhfl的液体培养7天后的产孢情况(bar = 5 μ m)；
[0050]图33是JM4和JM-OERhfl的液体培养10天后的产孢情况(bar = 5 μ m)；
[0051]图34是JM-OERhfl突变子的原基分化，JM-OERhf突变子的原基分化比野生型JM4迟而且少；
[0052]图35是JM-OERhfl突变子的子实体培养，JM-OERhf突变子只有徒长的菌丝和极少的原基；
[0053]图36是JM-OERhfl突变子的子实体，JM-OERhfl突变子没有子实体形成；
[0054]图37是JM4，g38和38_0ERhf I突变子的菌丝形状；
[0055]图38是38-0ERhfl突变子的原基分化；38_0ERhf突变子的原基分化时间处于野生型JM4和g38突变子之间；
[0056]图39是38-0ERhf I突变子的子实体培养；随着Rhfl基因补偿程度越高，38-0ERhf突变子的子实体越细长；
[0057]图40是38-0ERhfl突变子的子实体形状。
【具体实施方式】:
[0058]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0059]本发明中如无特殊说明，JM4指的是蛹虫草JM4 ；g38指的是蛹虫草突变子g38。
[0060]实施例1:
[0061]一、实验材料和方法
[0062]1.菌株培养[0063]农杆菌AGL-1培养:LB培养基，28°C黑暗培养。
[0064]E.coli DH5 α培养:LB培养基，37°C下黑暗培养。
[0065]蛹虫草培养:PPDA培养基，22_23°C温度下培养。
[0066]2.基因组 DNA 的小量提取(Ε.Z.N.A HP Fungal DNA Kit)
[0067]3.蛹虫草总RNA提取
[0068]用TRizol 法提取总 RNA，
[0069]4.蛹虫草菌的农杆菌介导(ATMT)转化
[0070]5.蛹虫草菌JM4和蛹虫草突变子g38分生孢子的收集
[0071]野生型的蛹虫草JM4和突变子g38蛹虫草菌分生孢子的收集:以接种针直接挑取菌丝体涂板于固体PPDA培养基中，于23°C黑暗培养，7-10天后以1mL无菌超纯水从平板中洗下分生孢子，三层无菌擦镜纸过滤后2次。以血球计数板计数，并用无菌水稀释孢子浓度为15个/mL。
[0072]6.农杆菌的预培养 和菌液浓度的测定
[0073]I)从LB固体平板(含50 μ g/mL卡那霉素)上挑选一个新鲜培养的农杆菌AGL-1单菌接种于5mL LB液体培养基(含50 μ g/mL卡那霉素)，200rpm，28 °C过夜培养；
[0074]2)第二天将200 μ L培养液转移到5mL含50 μ g/mL卡那霉素的頂诱导液体培养基中，28°C培养5-6h使0D600达到0.5-0.6。其中頂培养基不含乙酰丁香酮(AS)。
[0075]7.农杆菌和分生孢子的共培养
[0076]取100 μ L诱导好的农杆菌AGL-1菌液和100 μ L稀释好(15个/mL)的蛹虫草菌分生孢子悬浮液混合，混合液(200μ?均匀涂于铺在CO-1M培养基平板上的硝酸纤维素膜(121°C高压消毒30min)表面，CO-頂平板含200 μ mol/L乙酰丁香酮(AS)。23°C共培养2天。
[0077]蛹虫草突变子g38已经带有hyg基因，在Rhfl恢复突变时不能以潮霉素抗性筛选。因些在恢复试验中，共培养的蛹虫草突变子g38孢子浓度稀释为13个/mL，每次取混合液100 μ L涂板，平均每个平板可以长50个菌落。根据菌落的生长情况进行第一次筛选。
[0078]8.潮霉素抗性选择培养
[0079]将上面的硝酸纤维素膜转移到含潮霉素与抗生素的PPDA固体平板上，平板含1000 μ g/mL 潮霉素(hygromycin B), 200 μ g/mL 头孢霉素(cefotaxime), 60 μ g/mL 链霉素(str印tomycin)，将培养皿置于23°C环境下培养2天，直到转化子出现。
[0080]9.转化子的挑取和保存
[0081]一般2天后，选择平板上可长出单孢子菌落的转化子，用无菌镊子将转化子接种至含有200 μ g/mL头孢霉素和60 μ g/mL链霉素PPDA固体培养基的24孔板内。24孔板在230C培养5-7天后，挑取转化子的菌丝体保存在40 %甘油的PPDA液体培养基，充分混匀，贮藏于_80°C冰箱。
[0082]10.TAIL-PCR
[0083]TAIL-PCR扩增蛹虫草突变子g38中T-DNA插入位置，以ADl为兼并引物，参照Mullins等(2001)发表的文章，扩增T-DNA左右边界的序列。左右边界扩增的序列拼接出来的基因长度有284Ibp包括从N端开始的937个氨基酸序列，但是并没有完全包括该基因的全长。从已知的序列设计出Rhfl-Gl，Rhfl-GSPl, Rhfl-NGSPl弓丨物，以ADl为兼并引物，继续TAIL-PCR扩增C端的约407个氨基酸序列。
[0084]TAIL-PCR所用引物如下:
[0085]
【权利要求】
1.一种蛹虫草工程菌，其特征在于，其是将蛹虫草的菌丝分裂蛋白基因失活后获得的工程菌。
2.根据权利要求1所述的蛹虫草工程菌，其特征在于，所述的蛹虫草工程菌是在其菌丝分裂蛋白基因的第684bp后面插入了 T-DNA序列，并且其Rhfl基因的第685_723bp缺失。
3.核苷酸序列如SEQID N0.1所示的菌丝分裂蛋白基因在控制菌丝分枝、分生孢子梗分化、原基分 化速度、子实体的粗细、缩短蛹虫草栽培时间和/或提高蛹虫草子实体产量中的应用。
【文档编号】C12N1/15GK104031850SQ201410217012
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】江克清, 韩日畴 申请人:广东省昆虫研究所