一种能提高蛹虫草感染寄主昆虫能力的蛹虫草工程菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种能提高蛹虫草感染寄主昆虫能力的蛹虫草工程菌。它其是转有冬虫夏草丝氨酸水解酶基因csp1或csp2，并能表达丝氨酸水解酶Csp1或Csp2的蛹虫草，所述的丝氨酸水解酶基因csp1，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述的丝氨酸水解酶基因csp2，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。转外源丝氨酸水解酶基因确实提高了蛹虫草感染大蜡螟的能力，本发明为提高蛹虫草侵染昆虫能力提供技术参考。
【专利说明】一种能提高蛹虫草感染寄主昆虫能力的蛹虫草工程菌
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种能提高蛹虫草感染寄主昆 虫能力的蛹虫草工程菌。
【背景技术】：
[0002] 昆虫致病真菌的丝氨酸蛋白水解酶一般都有降解昆虫表皮的功能（Joshi et al.，1995)，它是一类具有相同催化机制的蛋白酶家族，作用于大分子蛋白质中的肽键，使 之成为小分子蛋白质。丝氨酸蛋白水解酶催化激活是通过活性中心一组氨基酸残基变化 实现的。在酵母体系中表达的蛋白酶具有一定的翻译后加工能力，使收获的外源蛋白有一 定程度上的折叠加工和糖基化修饰，因此酵母体系表达的蛋白有一定的功能（王世华等， 2007)。来源于冬虫夏草的cspl和csp2基因是两个丝氨酸蛋白酶，可以水解昆虫角质层， 属于蛋白酶S8A亚家族成员；研究表明在酵母细胞中表达的冬虫夏草丝氨酸蛋白酶有降解 昆虫体壁的能力（Zhang et al·，2008b)。
[0003] 蛹虫草感染昆虫的能力是评价蛹虫草性状的一个重要指标。提高真菌感染寄主 能力的研究常见于生物防治真菌如白僵菌、绿僵菌中，主要是通过转一个相关基因到真菌 细胞中以提商其感染寄主昆虫能力。例如转Bt毒力基因、丝氣酸蛋白类基因、凝集素基因 (Callaghan et al.，2005 ;Lu et al.，2008 ;Fang et al.，2010)等有利于真菌加速入侵昆 虫体壁。本研究通过ATMT方法整合冬虫夏草的丝氨酸水解酶基因到蛹虫草基因组DNA中， 以期提高蛹虫草JM4菌株侵染大蜡螟的能力。
【发明内容】
：
[0004] 本发明的目的是提供一种能提高蛹虫草感染寄主昆虫能力的蛹虫草工程菌。
[0005] 本发明的能提高蛹虫草感染寄主昆虫能力的蛹虫草工程菌，是转有冬虫夏草丝氨 酸水解酶基因 cspl或csp2,并能表达丝氨酸水解酶Cspl或Csp2的蛹虫草，所述的丝氨酸 水解酶基因 cspl，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的丝氨酸水解酶基因 csp2,其核 苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0006] 本研究利用ATMT方法构建了转冬虫夏草丝氨酸水解酶基因（cspl，csp2以及两者 融合的基因 c0c2)蛹虫草JM4,获得的突变子可通过绿色荧光鉴定。通过RT-PCR、Southern blot、Western bolt和子实体培养等方法筛选到一批生长特征正常的突变子，进行大錯螟 末龄幼虫感染实验。大錯螟末龄幼虫感染实验发现，转cspl、csp2、c0c2的突变菌株对錯螟 末龄幼虫的致死能力显著提高，但是c〇c2(融合cspl和csp2两个基因）蛹虫草突变菌株 的昆虫感染能力并没有比单个基因（cspl或csp2)的突变菌株高。
[0007] 总之，转外源丝氨酸水解酶基因确实提高了蛹虫草感染大蜡螟的能力，本发明为 提1?蛹虫草侵染昆虫能力提供技术参考。
【专利附图】
【附图说明】：
[0008] 图 1 是 pKHt-gfp 载体图；
[0009] 图 2 是扩增 cspl、csp2、c0c2 基因片段；M :DL2000DNA Markerl :空白对照；2-5 : 分别是cspl、csp2、c0和c2的PCR产物；6-7 :PCR融合产物c0c2图3是大肠杆菌DH5 α / pKgc0c2 的菌落 PCR 鉴定，M :DL2000DNA Marker ;1-6 :以 cspl-F 和 csp2-R 引物对扩增 pKgc0c2菌落的PCR产物；
[0010] 图 4 是大肠杆菌 DH5 a /pKgcspl 和 pKgcsp2 的菌落 PCR 鉴定，M :DL2000DNA Marker ;1_6 :以cspl引物扩增pKgcspl菌落的PCR产物，7-12 :以csp2引物扩增pKgcsp2 菌落的PCR产物
[0011] 图 5 是 pKgcspl 和 pKgcsp2 质粒的 Hind III和 kpn I 双酶切鉴定，M :Wide Range DNA Marker (100-6000bp)，1-3 :pKgcspl 质粒的 Hind III和 Κρη I 双酶切结果，4-6 :pKgcsp2 质粒的Hind III和Kpn I双酶切结果；
[0012] 图 6 是 pKgc0c2 质粒的 Hind III和 Kpn I 双酶切鉴定，Μ : λ-Hind III digest DNA Marker ; 1-3 :pKgc0c2 质粒的 Hind III和 Kpn I 双酶切结果；
[0013] 图7是野生型蛹虫草JIM及几个突变子的总RNA，M :DL2000DNA Marker，1-11 :野 生型JM4及几个突变子的总RNA ;
[0014] 图8是3种蛹虫草转化子的PCR鉴定，M :DL2000DNA Marker，l-4 :PCR扩增pKg突 变子中lac-gfp基因，5-11 :PCR扩增pKgcspl突变子中cspl基因12-16 :PCR扩增pKgcsp2 突变子中csp2基因；
[0015] 图9是蛹虫草pKgc0c2转化子的PCR鉴定，M :DL2000DNA Marker，1、6 :分别扩增 野生型JM4的cspl和csp2基因的PCR产物，2-5 :扩增pKgc0c2突变子中cspl基因的PCR 产物；7-10 :扩增pKgc0c2突变子中csp2基因的PCR产物；
[0016] 图10是蛹虫草突变子的绿色荧光检测，CK:野生型JM4, Al-A3:pKg突变子， B1-B3 :pKgcspl 突变子，C1-C3 :pKgcsp2 突变子，D1-D3 :pKgc0c2 突变子；
[0017] 图11是转丝氨酸水解酶基因的蛹虫草子实体，CK :野生型JM4子实体A，B :转丝氨 酸水解酶基因突变子的子实体；
[0018] 图 12 是蛹虫草 JM4 基因组 DNA 提取，M. : λ-Hind III digest DNA marker，1 :野 生型JM4基因组DNA，2-4.转丝氨酸水解基因的蛹虫草突变子基因组DNA;图13是3个基 因的 PCR 纯化产物，M :DL2000DNA Marker，1 :gfp PCR 纯化产物，2 :csplPCR 纯化产物，3 : csp2PCR纯化产物；
[0019] 图14是探针灵敏性鉴定，1 :gfp探针，2 :cspl探针，3 :csp2探针；
[0020] 图15是蛹虫草转化子的southern blot鉴定（Hind III消化）；探针：DIG-标记的 gfp 片段；M :DNA Molecular-Weight Marker II DIG-LabeldeO. 12-23. 1Kb ;C :JM4 基因组 DNA 酶切产物；Cl :pMD-19+gfp+gpd 片段；C2 :pMD-19+gfp+cspl 片段，C3 :pMD-19+gfp+csp2 片段；1-3 :三个pKg转化子的基因组DNA酶切产物；4-6 :三个pKgcspl转化子的基因组DNA 酶切产物；7-9 :三个pKgcsp2转化子的基因组DNA酶切产物；10-12 :三个pKgc0c2转化子 的基因组DNA酶切产物。
[0021] 图16是Tail-PCR扩增部分转化子的侧翼序列；M :DL2000DNA Markerl-3:不同转 化子的第一、二、三轮Tail-PCR反应产物；
[0022] 图 17是pET-28a_cspl 和pET-28a_scsp2重组质粒的酶切鉴定；M :Wide Range DNA Marker(100-6000bp);l-2:pET-28a-cspl重组质粒Hindm和BamHI的酶切结果 ；3-4: pET_28a_scsp2重组质粒Hind III和BamH I的酶切结果；
[0023] 图 18 是 Cspl 和 Scsp2 蛋白的原核表达；M :Prestained Protein Ladder ;1, 3 :未诱导和已诱导的Transetta(DE3)/pET_28a_scsp2重组菌；2,4 :未诱导和已诱导的 Transetta(DE3)/pET-28a_cspl 重组菌；
[0024] 图 19 是纯化的 Cspl 和 Scsp2 蛋白浓度分析；M :Prestained Protein Ladder ; 1- 3 :分别是 1 μ g，2 μ g，3 μ g 的 BSA ;4-6 :分别是 0. 5 μ L，1 μ L，2 μ L 的 Cspl 蛋白；7-9 :分 别是 0· 5 μ L，1 μ L，2 μ L 的 Scsp2 蛋白；
[0025] 图20是蛹虫草转化子的全蛋白；M :Prestained Protein Ladderl :野生型JM4 ; 2- 4 :pKg 转化子的 2、34、35 号 5-7 :pKgcspl 转化子的 10、31、41 号；8-10 :pKgcsp2 转化子 的 18、29、33 号 11-13 :pKgc0c2 转化子的 3、17、21 号；
[0026] 图 21 是 Western blot 检测突变子中 Cspl 蛋白的表达；M :Prestained Protein Ladder C :阳性对照；1 :野生型 JM42 :pKg转化子；3-5 :pKgcspl 转化子（10、31、41 号）6-8 : pKgc0c2 转化子（3、17、21 号）；
[0027] 图 22 是 Western blot 检测突变子中 Csp2 蛋白的表达；M :Prestained Protein Ladder C :阳性对照；1 :野生型 JM42 :pKg转化子；3-5 :pKgcsp2转化子（18、29、33 号）6-8 : pKgc0c2 转化子（3、17、21 号）；
[0028] 图23是不同浓度的转丝氨酸水解酶基因蛹虫草分生孢子感染大蜡螟幼虫的7天 死亡率，CK :无菌水；JM4 :野生型蛹虫草；
[0029] 图24是不同浓度的转丝氨酸水解酶基因蛹虫草分生孢子感染大蜡螟幼虫的14天 死亡率，CK :无菌水；JM4 :野生型蛹虫草；
[0030] 图25是不同浓度的转丝氨酸水解酶基因蛹虫草分生孢子感染大蜡螟幼虫的21天 死亡率，CK :无菌水；JM4 :野生型蛹虫草。
【具体实施方式】：
[0031] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0032] 实施例1 :
[0033] 3. 3实验方法
[0034] 3. 3. 1转菌丝cspl、csp2、c0c2基因的JM4突变子库构建
[0035] 3. 3. 1. lpKgcspl、pKgcsp2、pKgc0c2 的载体构建
[0036] 以适合于真菌ATMT法的载体pKHt-gfp (简称pKg)为基础，进行丝氨酸水解酶基 因的质粒构建。pKHt-gfp载体的边界内从右到左包括如下元件：gpd启动子、MCS多克隆位 点、trpC终止子、cam抗性基因、ori复制子、hyg潮霉素抗性基因和gfp绿色突光蛋白基 因，其中hph+ptrpC命名为phyg。所有丝氨酸水解酶基因都是插入到MCS(限制性内切酶 Xba I -Κρη I )中，形成相应的载体。
[0037] 具体构建方法为：
[0038] 以pKHt载体为基本骨架进行改造，载体是kana抗性（Mullins et al.，2001)。
[0039] pKHt-gfp 载体：
[0040] 1、EcoR I单酶切pKHt载体，Qiangen公司的DNA回收试剂盒回收纯化并经 CIAP(TaKaRa)处理以防载体自连。经相同EcoR I单酶切的lacZ+gfp片段，回收纯化。
[0041] 2、处理过的pKHt载体0· 5 μ L和lacZ+gfp片段1 μ L连接，加入2X ligase buffer (promega) 2 μ L，最后补水 0· 5 μ L，16°C连接反应 2 小时。
[0042] 3、将4μ L连接产物与50μ L的E. coli DH5a感受态细胞混合后，冰浴30min。 42°C水浴热激动反应45s，然后冰上放置3min。加入LB培养基500 μ L，在37°C下250rpm 震摇45min。
[0043] 4、取200μ L的LB培养基细菌液，涂布kana抗性LB培养板上，在37°C下培养 16-20小时。黑暗下挑取呈绿色的阳性单克隆，提取质粒，进行测序分析。正确的克隆载体 命名为pKHtl。
[0044] 5、以 Expression vector (PAN2-4) DNA, 5760bp (GenBank: Z32750. 1)质粒为模板， trpC 引物（pst I kpn I -trpC-F:
[0045] GGGCTGCAGGGTACCGATCCACTTAACGTTACTGAAAT ；pst I -trpC - R ：GGGCTGCAGACTAG AAAGAAGGATTACCTCTA)，Pfu DNA polymerase、dNTP 和 PCR 反应液，扩增获得 trpC(729bp)。 pst I单酶切pKHtl载体，Qiangen公司的DNA回收试剂盒回收纯化并经CIAP(TaKaRa)处 理以防载体自连。经相同pst I单酶切的trpC片段，回收纯化，再与pst I单酶切pKHtl 载体连接，然后转入E. coli DH5a感受态细胞中。克隆和检测按3、4步骤进行。在pKHtl 插入trpC并且在上游带入一个kpn I的酶切位点。trpC的正确插入方向是kpn I位点靠 近pKHt载体右边界。正确的质粒命名为pKHt2。
[0046] 6、以 Expression vector(PAN2-4)DNA, 5760bp (GenBank:Z32750. 1)质粒为 模板，gpd 弓丨物（Hind III -gpd-F ：GGGAAGCTTCAATTCCCTTGTATCTCTACAC ；Xba I -gpd-R ： GGGTCTAGAGGTGATGTCTGCTCAAGCG), Pfu DNA polymerase、dNTP 和 PCR 反应液，扩增获得 gpd(2.3kb)。其 PCR 反应体系：10XPCR buffer5y 1，上游（Forward)和下游（Reverse)引 物各 1 y l，Expression vectorlOOng为模板，lOmM dNTPsl μ l，Pfu_Taq(lU/y 1)，最后补水 至50 μ 1。PCR反应条件：94°C热变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，共 进行30次循环；最后72°C延伸10min，得到gpd产物。
[0047] 7、Qiangen公司的DNA回收试剂盒回收纯化gpd产物，HindΠI和XbaI双酶切gpd 后再次回收2·3kb的片段。pMD19-gfp(gfp基因插入载体pMD19中）载体经Hindm和XbaI 双酶切后回收2692bp的载体片段。与Hind III和Xba I双酶切的gpd产物连接，再转化进 入E. coli DH5a感受态细胞中、克隆和检验按3、4步骤进行，pMD19-T抗性是ampicillin。 测序正确的载体命名为19T-gpd。
[0048] 8、19T-gpd和pKHt2经Hind III和kpn I酶切后，分别回收纯化2. 3kb的gpd片段 和pKHt2载体。再将两者连接、转化、克隆和检验按2、3、4步骤进行。正确的载体命名为 pKHt-gfpjKHt-gfp载体中引入多克隆位点包括：Xba I，BamH I，Sma I，Xma I 和Kpn I。 pKHt-gfp载体图如图1所示。
[0049] 9:所有丝氨酸水解酶基因都是插入到MCS(限制性内切酶Xba I -Kpn I )中，形 成相应的载体。
[0050] 1) cspl、csp2、c0c2 基因引物
[0051] 表 1
[0052]
【权利要求】
1. 一种能提高蛹虫草感染寄主昆虫能力的蛹虫草工程菌，其特征在于，其是转有冬虫 夏草丝氨酸水解酶基因 cspl或csp2,并能表达丝氨酸水解酶Cspl或Csp2的蛹虫草，所述 的丝氨酸水解酶基因 cspl，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的丝氨酸水解酶基因 csp2,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
【文档编号】C12N1/15GK104195058SQ201410218655
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年5月22日 优先权日:2014年5月22日
【发明者】江克清, 韩日畴 申请人:广东省昆虫研究所