长链非编码rna crym-as1的应用方法
【专利摘要】本发明公开了一种长链非编码RNA(long?no-coding?RNA,LncRNA)CRYM-AS1的应用方法，即用于制备胶质瘤患者的预后制剂，特别是制备出实时荧光定量分析法预测胶质瘤患者预后的试剂盒。通过研究证实LncRNA?CRYM-AS1在胶质瘤组织中表达上调，高表达LncRNA?CRYM-AS1的胶质瘤患者比低表达LncRNA?CRYM-AS1的胶质瘤患者预后差，因此，将Lnc?RNA?CRYM-AS1的表达用于胶质瘤患者的预后预测，可以为预测胶质瘤患者的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和推广性。
【专利说明】长链非编码RNA CRYM-AS1的应用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及LncRNA CRYM-ASl在制备胶质瘤患者预后试剂中的应用方法。
【背景技术】
[0002]胶质瘤起源于外胚层，约占神经系统肿瘤的40.49%，其发生部位，发病时间不受限制，可发生在中枢神经系统的任何部位，发病年龄从婴儿到老人均有。而且胶质瘤呈浸润性生长且与周围脑组织边界不清，即使是最先进的神经外科技术也难以做到病理学上的完全切除，因而胶质瘤术后复发率非常高，胶质瘤患者存活率低，平均存活时间3-5年。因此对胶质瘤患者进行预后判定，以便选择最佳治疗方案，显著提高患者生存率，成为神经外科领域亟待解决的重要课题。[0003]IncRNA是一类转录本长度大于200bp，具有相对较长的核苷酸链的非编码RNA，IncRNA具有类型多、作用模式多和数量多的“三多”特点，因此，它所蕴含的信息十分丰富，其参与表达调控的分子机制也多种多样，不仅可以通过直接与靶基因结合来激活或抑制靶基因的表达，还能通过参与组蛋白修饰或募集转录因子而参与基因的表达调控。近年来，随着对IncRNA的不断认识其在临床诊断、化疗敏感性和预后评价等方面的应用受到研究者的关注。有研究在尿液中发现IncRNA PCA3在前列腺癌中高度过表达，可为前列腺癌的诊断提供新的思路，研究发现HOTAIR在原发乳腺肿瘤中的表达增加，利用HOTAIR的表达水平可以用来有效预测癌转移和死亡。由此可见，IncRNA作为诊断、预后和治疗的分子标志物具有巨大潜力。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种LncRNA CRYM-ASl的应用方法，即LncRNACRYM-ASl (CRYM antisense RNAI)定位于染色体 16ρ12.2，GeneBank 登录号:NR_026675 倉泛作为胶质瘤预后的判断标准，用于制备胶质瘤患者的预后制剂，更进一步能够提供一种性价比高，易于推广应用的胶质瘤预后预测试剂盒。
[0005]长链非编码RNA CRYM-ASl的应用方法，所述的长链非编码RNA CRYM-ASl用于制备胶质瘤患者的预后制剂，该长链非编码RNA CRYM-ASl的序列见SEQ NO:1。
[0006]所述的用于制备胶质瘤患者的预后制剂包括实时荧光定量PCR检测试剂。
[0007]所述的实时荧光定量PCR检测试剂包括进行实时荧光定量PCR的特异性引物:
[0008]LncRNA CRYM-ASl 正向引物:5’ -CTGGAAGGCACGTAAGC-3’，
[0009]LncRNA CRYM-ASl 反向引物 5’ -GAGGCGGCGATGTATTG-3’。
[0010]所述的实时荧光定量PCR检测试剂为试剂盒，
[0011]该试剂盒包括:(I)从胶质瘤组织中抽提总RNA所用试剂，包括RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；(2)以总RNA为模板将LncRNA CRYM-ASl逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及LncRNA CRYM-ASl所用随机引物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括LncRNACRYM-ASl实时荧光定量PCR特异性引物、U6snRNA内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水；
[0012]LncRNA CRYM-ASl实时荧光定量PCR特异性引物:
[0013]LncRNA CRYM-ASI 正向引物:5’ -CTGGAAGGCACGTAAGC-3’，
[0014]LncRNA CRYM-ASl 反向引物 5’ -GAGGCGGCGATGTATTG-3’。
[0015]U6snRNA内参特异性PCR引物:
[0016]其正向引物为5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，
[0017]反向引物为5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
[0018]在前期研究工作中， 申请人:通过DIANA-LncBase软件分析与miR-101竞争性结合MRE序列的LncRNA时，发现了 LncRNA CRYM-ASl。 申请人:在胶质瘤组织中提取RNA，逆转录后进行实时荧光定量PCR分析LncRNA CRYM-ASl的表达，发现:LncRNA CRYM-ASl在胶质瘤中表达上调，与正常人脑组织中的表达差异显著。且LncRNA CRYM-ASl表达水平不同的胶质瘤患者中预后存在明显差异，经Kaplan-Meier生存分析发现LncRNA CRYM-ASl高表达的胶质瘤患者生存率明显低于低表达的患者；多因素Cox比例风险模型的预后分析发现LncRNACRYM-ASl的相对危 险度>1，表明LncRNA CRYM-ASl高表达的患者预后较低表达的患者预后差，所以LncRNA CRYM-ASl的高表达是胶质瘤患者预后风险预测的独立危险因素。据此， 申请人:提出利用LncRNA CRYM-ASl制备用于胶质瘤患者预后的制剂。
[0019]将LncRNA CRYM-ASl用于胶质瘤患者预后的检测方法:(I)收集待测个体术后切除的胶质瘤组织，抽提总RNA ；⑵以总RNA为模板将CRYM-ASl逆转录为cDNA ； (3)用CRYM-ASl特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，获得相对表达量2ΔΔετ，当2ΔΔετ>1.72时提示CRYM-ASl为高表达。
[0020]利用本发明的检测制剂可以检测LncRNA CRYM-ASl在胶质瘤患者中的表达水平，为胶质瘤患者预后预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。
【专利附图】
【附图说明】
[0021 ] 图1为实时荧光定量PCR分析LncRNA CRYM-ASl在胶质瘤组织与正常脑组织中的
表达差异;
[0022]图2为LncRNA CRYM-ASl与37例胶质瘤患者预后的关系；
【具体实施方式】
[0023]以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0024]在前期研究工作中， 申请人:通过DIANA-LncBase软件分析与miR-101竞争性结合MRE序列的LncRNA时，发现了 LncRNA CRYM-ASl。 申请人:在胶质瘤组织中提取RNA，逆转录后进行实时荧光定量PCR分析LncRNA CRYM-ASl的表达，发现:LncRNA CRYM-ASl在胶质瘤组织中表达上调，与正常人脑组织中的表达差异显著(P = 0.0025)(图1)。且LncRNA CRYM-ASl表达水平不同的胶质瘤患者中预后存在明显差异，经Kaplan-Meier生存分析发现LncRNA CRYM-ASl高表达的胶质瘤患者生存率明显低于低表达的患者(P =
0.0012)(图2)，多因素Cox比例风险模型的预后分析发现LncRNA CRYM-ASl的相对危险度>1 (RR = 1.017)，表明LncRNA CRYM-ASl高表达的患者预后较低表达的患者预后差，LncRNACRYM-ASl的高表达是胶质瘤患者预后风险预测的独立危险因素。
[0025]实施例1制备LncRNA CRYM-ASl用于胶质瘤患者预后的试剂盒(50次反应)
[0026]1.RNA 稳定溶液 50ml
[0027]2.异丙醇 100mL
[0028]3.三氯甲烷 100mL
[0029]4.Trizol50ml
[0030]5.无酶水 IOml
[0031]6.1 μΜ随机逆转录引物50 μ I
[0032]7.5Χ逆转录缓冲液200ml
[0033]8.1OmM三磷酸碱基脱氧核苷酸100 μ I
[0034]9.40U/ μ I RNA 酶抑制剂 500 μ I
[0035]10.200U/ μ I MMLV 逆转录酶 50 μ I
[0036]11.Premix Ex Taq50 μ I
[0037]12.10 μ M Lnc RNA CRYM-ASl 特异性引物 30 μ I
[0038]正向引物5’ -CTGGAAGGCACGTAAGC-3’，
[0039]反向引物5’ -GAGGCGGCGATGTATTG-3'。
[0040]13.10 μ M U6SnRNA 特异性引物 3O μ I
[0041 ]正向引物为 5’ -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’
[0042]反向引物为5’ -GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。
[0043]实施例2胶质瘤组织中Lnc RNA CRYM-ASl的检测
[0044]1、胶质瘤组织的保存:收集待测胶质瘤组织存放于盛有RNA稳定溶液的冻存管中，放至-80 0C冰箱备用。
[0045]2、组织中RNA的抽提:取适量标本于经180°C烘烤6_8h后的研钵中加入液氮研磨标本，研磨至粉末状后于研钵中加入1ml Trizol研钵标本,研磨成液体状后用移至tube管，加氯仿200μ 1/mlTrizol于Tube中，用手震荡15_30s，冰上放置5min，4°C 12000g离心15min ;小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0.5ml/mlTrizol混匀,_20°C冰箱静置20min，4°C 12000g离心10min ;弃上清，加入75% DEPC水稀释的乙醇l_2ml混匀，40C 7500g离心5min，尽量弃上清，室温干燥5_10min，加入DEPC水10-20 μ I溶解RNA。分光光度计测RNA的浓度及质量，0D260/280比值在1.8-2.0之间，_80°C保存。
[0046]3、LncRNA CRYM-ASl逆转录:使用Thermo公司的逆转录试剂盒。20 μ L逆转录反应的体系如下:
[0047]
【权利要求】
1.长链非编码RNACRYM-ASl的应用方法，其特征在于，所述的长链非编码RNACRYM-ASl用于制备胶质瘤患者的预后制剂，该长链非编码RNA CRYM-ASl的序列见SEQNO:1。
2.根据权利要求1所述的长链非编码RNACRYM-ASl的应用方法，其特征在于，所述的用于制备胶质瘤患者的预后制剂包括实时荧光定量PCR检测试剂。
3.根据权利要求2所述的长链非编码RNACRYM-ASl的应用方法，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR检测试剂包括进行实时荧光定量PCR的特异性引物:
LncRNA CRYM-ASl 正向引物:5’ -CTGGAAGGCACGTAAGC-3’，
LncRNA CRYM-ASl 反向引物 5’ -GAGGCGGCGATGTATTG-3’。
4.根据权利要求3所述的长链非编码RNACRYM-ASl的应用方法，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR检测试剂为试剂盒， 该试剂盒包括:(I)从胶质瘤组织中抽提总RNA所用试剂，包括RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；(2)以总RNA为模板将LncRNA CRYM-ASl逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及LncRNA CRYM-ASl所用随机引物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括LncRNACRYM-ASl实时荧光定量PCR特异性引物、U6snRNA内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水； LncRNA CRYM-ASl实时荧光定量PCR特异性引物: 正向引物:5’ -CTGGAAGGCACGTAAGC-3’， 反向引物:5’ -GAGGCGGCGATGTATTG-3’。 U6snRNA内参特异 性PCR引物: 正向引物为 5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'， 反向引物为 5' -GGMCGCTTCACGAATT TG-3'。
【文档编号】C12N15/11GK103981269SQ201410225249
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月26日 优先权日:2014年5月26日
【发明者】武明花, 刘长红, 余志斌, 徐刚, 李桂源 申请人:中南大学