一种用于基因工程的骨干质粒载体及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于基因工程的骨干质粒载体，所述骨干质粒载体中，向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框位于同一双元载体中，向导RNA表达框由水稻U6启动子，壮观霉素抗性基因、人工合成的sgRNA骨架序列和Poly-T终止子依次构成；Cas9核酸酶表达框由ZmUBI启动子，水稻偏好密码子改造后的Cas9编码序列和35s终止子依次构成。本发明还提供了利用所述质粒载体构建的含有靶标序列的重组载体，及其在水稻基因打靶中的应用。
【专利说明】—种用于基因工程的骨干质粒载体及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种用于植物基因打靶的基因工程载体及在水稻基因改造中的应用。
【背景技术】
[0002]水稻是世界上最主要的作物之一。水稻的生产与国民经济生活密切相关，持续不断的培育具有更加优良农艺形状的品种对于水稻生产至关重要。相对于传统育种方法，近十年内发展出的基因打靶技术为水稻产量、品质和抗性等关键形状的提升提供了便捷和高效的手段。传统的基因打靶方法包括同源重组技术、锌指核酸酶技术(ZFN)和类转录因子激活物技术(TALEN)，其中同源重组技术在植物中打靶效率极低，而ZFN和TALEN技术都存在基因工程载体构建复杂，周期长，成本高，不适于瞬时转化等技术问题，极大的限制了基因打靶技术在水稻育种改良过程中的实用性。
[0003]近2年发展出的CRISPR/Cas9技术为基因打靶提供了新手段。CRSIPR/Cas9系统是存在于细菌中的一种先天性免疫系统。CRSIPR RNA(crRNA)在与tracrRNA(trans-activation RNA)组装后，引导Cas9核酸酶切割与crRNA匹配的序列。利用这一原理，在真 核生物细胞中，通过人工合成包含crRNA和tracrRNA的单链向导RNA (SgRNA)，同样可以引导Cas9切割基因组中的靶点序列，在细胞启动DNA修复机制后，切割位点会出现随机的碱基插入或缺失，从而实现了位点特异性的基因打靶。目前，在酵母、人类细胞、小鼠、果蝇、大鼠、斑马鱼等物种中都已成功实现了基因组的CRISPR/Cas9定向基因打靶。
[0004]在植物中，也有利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑的研究。但是，目前有限的报道主要侧重于机理研究，尚没有对水稻基因工程载体进行优化，主要表现为现有载体使用的SgRNA和Cas9组合效率有限(Shan等，2013年Nature Biotechnology文章报道的通过稳定遗传转化法进行CRISPR/Cas9打靶效率仅为4.0%~9.4% );操作繁琐，需要分别构建SgRNA和Cas9两个载体共转化(Xie等,2013年Molecular Plant)或进行两次克隆才能将SgRNA和Cas9表达框整合到一个质粒上(Miao等,2013年，Cell Research);适用性单一，大多数现有植物CRISPR/Cas9系统载体是分子量过大不适于瞬时转化的稳定表达载体(Miao等,2013年,Cell Research),抑或是缺乏T-DNA边界不能用于农杆菌介导转化的瞬时载体；以及缺乏合适水稻内源启动子和适于水稻表达的编码方式等等问题(Mao等，2013年Molecular Plant)，极大的限制了 CRISPR/Cas9介导基因打靶技术的优势在水稻品种改良中的发挥。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种用于水稻基因打靶的基因工程骨干载体。
[0006]具体而言，一方面，本发明提供了一种用于基因工程的骨干质粒载体，包含向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述向导RNA表达框的核苷酸序列如Seq ID N0.1第107至1665位所示，所述Cas9核酸酶表达框的核苷酸序列如Seq ID N0.1第1708至8215位所示，
[0007]其特征在于，
[0008]a、所述向导RNA(SgRNA)表达框包括:水稻U6启动子，其核苷酸序列如Seq IDN0.1第107至352位所示；壮观霉素抗性基因(SpR)，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第412至1442位所示；人工合成的SgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第1574至1657位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第1658至1665位所示，
[0009]b、所述Cas9核酸酶表达框包括:玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第1708至3739位所示；水稻偏好密码子改造后的Cas9编码序列，其核苷酸序列如Seq IDN0.1第3758至7888位所示和35s终止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第7889至8215位所示。
[0010]优选地，所述骨干质粒载体还包括:c T-DNA的左、右边界序列，其中，所述左边界序列的核苷酸序列如Seq ID N0.1第10464至10487位所示，所述右边界序列的核苷酸序列如Seq ID N0.1第I至25位所示,所述向导RNA表达框和所述Cas9表达框位于所述左边界序列和所述右边界序列之间。
[0011 ] 优选地，在所述骨干质粒载体的骨架上具有卡那霉素抗性基因结构。
[0012]另一方面，本发明提供一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体的核苷酸序列如Seq ID N0.1所示，文中称为pHUN4cl6。
[0013]另一方面，本发明提供一种用于水稻目的基因打靶的重组载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤:
[0014]按照目的基因的编码序列，选择双链靶标片段，其中所述靶标片段位于所述目的基因上，所述双链靶标片段的一条链具有以下5’ _(N)x-NGG-3’结构，(N)x表示数目为X的
一条碱基序列(N1, N2......Nj ,N1, N2......Nx中的每一个表不碱基A、G、C、T中的任意一个,NGG
中的N也代表碱基A、G、C、T中的任意一个(优选地，X为19或20)；
[0015]将所述靶标片段整合到上述的骨干质粒载体中，与SgRNA骨架序列连接形成带有所述标靶片段的向导RNA。
[0016]优选地，所述载体构建包括，
[0017]按照靶标序列的核酸排列顺序，分别合成具有5’ -TGTG-(N)X_3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’ -AAAC-(NJ )x-3’特征的反向寡核苷酸链，其中正向寡核苷酸链中的(N)x和反向寡核苷酸中的(N’)x具有反向互补特征；用BsaI内切酶切开所述骨干质粒载体，将所述正向寡核苷酸链和所述反向寡核苷酸链退火后形成的双链核苷酸替换壮观霉素抗性基因，通过卡那霉素正向选择和壮观霉素负向选择，筛选形成用于水稻目的基因打靶的重组载体。
[0018]另一方面，本发明提供一种上述重组载体在水稻基因打靶中的应用，其特征在于，包括步骤如下，
[0019]将所述重组载体转入水稻细胞，使所述水稻细胞同时含有针对靶标基因的向导RNA和Cas9核酸酶；在向导RNA和Cas9核酸酶的共同作用下，剪切目的基因的双链靶标片段，诱发所述水稻细胞自身的DNA修复功能，实现目的基因中靶标片段的随机插入和/或随机缺失。[0020]优选地，所述转入水稻细胞是指将所述重组载体经原生质体瞬时转化或农杆菌介导稳定转化到水稻细胞或组织中。
[0021]优选地，所述应用用于获得在靶标片段上具有随机插入和/或随机缺失的水稻植株。
[0022]另一方面，本发明提供一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含上述的重组载体。
[0023]本发明所述的基因工程骨干载体是包含T-DNA边界序列的双元载体，在T-DNA左右两个边界内，包含2个表达框:Cas9基因表达框和向导RNA表达框，还可以包括潮霉素抗性基因表达框。在T-DNA边界外的载体骨架序列中，可以包含卡那霉素抗性基因等结构(图1)。
[0024]在本发明中，SpR基因两端分别存在反向排列的BsaI内切酶识别位点(剪切位点如Seq ID N0.1第349位和1547位所示)，用于插入靶标片段。
[0025]本发明还提供包含携带所述重组载体的转化子，其中，所用宿主为微生物，具体的为大肠杆菌和农杆菌。 [0026]本发明的一个目的是应用所述重组载体，实现目的基因靶标片段的随机插入和/或随机缺失。具体而言，是通过重组载体转入水稻细胞，使细胞同时含有针对靶标基因的向导RNA和Cas9核酸酶；在向导RNA和Cas9核酸酶的共同作用下，目的基因的双链靶标片段被剪切，诱导水稻细胞自身的DNA修复功能，最终实现目的基因中靶标片段的随机插入和/或随机缺失。
[0027]所述应用中，向导RNA由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和SgRNA骨架片段连接而成，所述sgRNA骨架片段可与Cas9核酸酶结合。所述向导RNA中能与所述靶标片段互补结合的RNA片段为能与所述5’ _(N)x-NGG-3’中(N)x互补结合的RNA片段。
[0028]所述向导RNA中sgRNA骨架片段由SEQ ID N0.1中第1574至1657位核苷酸所示DNA转录出来的RNA片段。所述Cas9核酸酶由SEQ ID N0.1中第3758至7888位核苷酸所示DNA转录的RNA片段翻译而成的蛋白质。
[0029]所述重组载体转入水稻细胞的方法为:向植物细胞直接导入重组载体的DNA序列，具体如PEG介导的原生质体瞬时转化或农杆菌介导的愈伤组织稳定转化。
[0030]所述再生植株，由转化的水稻细胞或组织，如原生质体或愈伤组织分化再生而来。所述应用可获得带有目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的水稻植株。
[0031 ] 为了提高水稻的打靶效率，在本发明中，采用了水稻U6启动子表达sgRNA (采用该启动子，在水稻中的表达效率显著高于其它启动子)和ZmUBI启动子驱动水稻偏好密码子化改造的Cas9基因的组合，本申请的发明人发现，这种组合能够显著提高对靶标序列剪切的稳定性和效率，经实验证明，其达到了目前已知在水稻内最为稳定高效的对靶标序列的剪切的目的。同时，本发明预先将sgRNA表达框和Cas9表达框预置与同一质粒骨架上，同时在靶标序列插入位置预置了壮观霉素抗性基因，在重组载体构建过程中，仅需一次酶切连接，在壮观霉素反向筛选和骨干质粒载体的骨架上的卡那霉素正向筛选的作用下，可以高效简洁的获得完整的打靶重组载体。从而，简化了针对某一基因构建重组打靶载体的流程，相对于目前部分采用两个分别转化包含SgRAN表达框和Cas9表达框载体的打靶方法，也具有能更高效向水稻细胞内导入完整CRISPR/Cas9系统的特点。[0032]在一种实现方式中，本发明的骨干质粒载体的核苷酸序列如下(与序列表中SEQID N0.1 相同):
【权利要求】
1.一种用于基因工程的骨干质粒载体，包含向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述向导RNA表达框的核苷酸序列如Seq ID N0.1第107至1665位所示，所述Cas9核酸酶表达框的核苷酸序列如Seq ID N0.1第1708至8215位所示， 其特征在于， a、所述向导RNA表达框包括:水稻U6启动子，其核苷酸序列如SeqIDN0.1第107至352位所示；壮观霉素抗性基因，其核苷酸序列如Seq IDN0.1第412至1442位所示；人工合成的SgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第1574至1657位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第1658至1665位所示， b、所述Cas9核酸酶表达框包括:玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如SeqID N0.1第1708至3739位所示；Cas9编码序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第3758至7888位所示和35s终止子，其核苷酸序列如Seq IDN0.1第7889至8215位所示。
2.根据权利要求1所述的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体还包括:c、T-DNA的左、右边界序列，其中，所述左边界序列的核苷酸序列如Seq ID N0.1第10464至10487位所示,所述右边界序列的核苷酸序列如Seq ID N0.1第I至25位所示,所述向导RNA表达框和所述Cas9表达框位于所述左边界序列和所述右边界序列之间。
3.根据权 利要求1所述的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体还包括潮霉素抗性基因表达框。
4.一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体的核苷酸序列如 Seq ID N0.1 所示。
5.一种用于水稻目的基因打靶的重组载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤: 按照目的基因的编码序列，选择双链靶标片段，其中所述靶标片段位于所述目的基因上，所述双链靶标片段的一条链具有5’ _(N)x-NGG-3’结构，(N)x表示数目为X的一条碱基序列(N1, N2......Nx}，N1, N2......Nx中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，NGG中的N也代表碱基A、G、C、T中的任意一个； 将所述靶标片段整合到权利要求1-4中任意一项所述的骨干质粒载体中，与SgRNA骨架序列连接形成带有所述标靶片段的向导RNA。
6.根据权利要求5所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括:按照靶标序列的核酸排列顺序，分别合成具有5’ -TGTG-(N)x-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’ -AAAC-(N’)x-3’特征的反向寡核苷酸链，其中正向寡核苷酸链中的(N)x和反向寡核苷酸中的(N’)x具有反向互补特征；用BsaI内切酶切开所述骨干质粒载体，将所述正向寡核苷酸链和所述反向寡核苷酸链退火后形成的双链核苷酸替换壮观霉素抗性基因，通过卡那霉素正向选择和壮观霉素负向选择，筛选形成用于水稻目的基因打靶的重组载体。
7.—种权利要求6所述的重组载体在水稻基因打靶中的应用，其特征在于，包括步骤如下， 将所述重组载体转入水稻细胞，使细胞同时含有针对靶标基因的向导RNA和Cas9核酸酶；在向导RNA和Cas9核酸酶的共同作用下，剪切目的基因的双链靶标片段，诱发所述水稻细胞自身的DNA修复功能，实现目的基因中靶标片段的随机插入和/或随机缺失。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述转入水稻细胞是指将所述重组载体经原生质体瞬时转化或农杆菌介导稳定转化到水稻细胞或组织中。
9.根据权利要求7或8的应用，其特征在于，所述应用用于获得在靶标片段上具有随机插入和/或随机缺失的水稻植株。
10.一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含权利要求5所述的重组载体。
【文档编号】C12N1/21GK103981215SQ201410225911
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月23日 优先权日:2014年5月23日
【发明者】秦瑞英, 杨剑波, 李莉, 魏鹏程, 李 浩, 杨亚春, 倪大虎, 倪金龙, 宋丰顺, 陆徐忠, 马卉 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所