一种结核杆菌最低抑菌浓度检测试剂盒及制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及快速准确检测结核杆菌药敏的液体培养基及制备方法及最低抑菌浓度检测方法，第一方面是提供一种结核分枝杆菌最低抑菌浓度(MIC)快速检测试剂盒；第二方面是提供一种制备结核分枝杆菌最低抑菌浓度(MIC)快速检测试剂盒方法；第三个方面是提供一种结核分枝杆菌最低抑菌浓度检测方法；本发明改进优化了培养基的配方组分，能更有效的促进结核分枝杆菌的快速生产；该培养基制作简单，使用新型的水溶性四唑盐变色剂更简化了实验步骤，培养基四大组分均为独立分装的液体试剂，增强了溶液组分抗杂菌污染能力，保证稳定性和灵敏性；本发明使得该技术操作简便、迅速，结核分枝杆菌生长更良好，缩短检测结果所用时间，可达到标准化生产。
【专利说明】一种结核杆菌最低抑菌浓度检测试剂盒及制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及结核分枝杆菌快速检测试剂盒及试剂盒的制备方法及结核分枝杆菌检测方法，特别是一种结核杆菌最低抑菌浓度检测试剂盒及制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]结核病是严重危害群众健康的呼吸道传染病，被列为我国重大传染病之一；我国结核病人数居世界第二位，十年来没有改变；据全国统计结果显示全国约有450万结核病患者，而结核病发病率年下降率仅为1% ;近年来世界各地结核分枝杆菌的多耐菌株逐渐增多，甚至引起暴发流行；据耐药基线调查，全国耐药率为8.32%，广泛耐药率为0.68 % ;我国结核病耐多药病人占全球约49万人的1/3-1/4 ;耐多药分枝杆菌(MDR-TB)对一线抗结核药物和二线抗结核药物不敏感，耐多药结核病的出现大大降低了现有标准治疗策略的疗效，亟需准确精细的药敏数据来支持临床实施个体化治疗；如何选择合适的药物治疗MDR-TB病人，临床上已是一个难题，因此结核杆菌最低抑菌浓度快速检测在临床上就有很大的价值，为疾病的前期诊断，治疗方案的制定具有指导意义；但是结核杆菌生长缓慢，无运动能力，性情懒惰，其最快分裂增殖速度为18小时一代，而大多数细菌都是几分钟或几十分钟便繁殖一代，这就为结核杆菌的快速鉴别带来了难度。
[0003]目前市面上出售的结核分枝杆菌药敏培养基主要是罗氏药敏培养基、基于Midddlebrook培养基系统的系列药敏培养基等，罗氏药敏培养基为传统培养基，现在临床普遍使用，但培养周期较长，其他产品存在培养基中污染率高，检测不准确，操作不方便，难以全面推广应用等问题；市场上一些基于耐药基因的快速检测技术虽然极大提高了耐药结核分枝杆菌的检测速度，但这些耐药基因与结核分枝杆菌的MIC值无明晰的对照关系，并且大多数的MIC检测方法药敏临界值的设置忽略结核分枝杆菌菌群差异对临界值的影响，也缺乏足够的样本量与传统检测方法相对比绘制特征曲线，得到一个与传统方法符合率最闻的临界值。
【发明内容】
[0004]针对现有结核杆菌最低抑菌浓度(MIC)快速检测试剂盒及制备方法及最低抑菌浓度检测方法存在的问题，本发明的目的就是提供一种快速，准确检测结核杆菌药敏的液体培养基，及制备方法及最低抑菌浓度检测方法。
[0005]本发明第一方面是提供一种结核分枝杆菌最低抑菌浓度(MIC)快速检测试剂盒，包括:
[0006]A、基础培养基:磷酸氢二钠2_3g、磷酸二氢钾0.5-1.5g、硫酸镁0.03-0.07g、L_谷氨酸钠0.3-0.7g、柠檬酸三钠2H200.01-0.08g、葡萄糖15_25g、两性霉素B5_15ug/ml、羧苄青霉素45-50ug/ml、多粘菌素B150_250ug/ml、乳酸增效磺胺15_25ug/ml、蛋白胨45_55g、吐温 800.3-0.7ml ；
[0007] B、培养基添加剂:亚油酸0.3-0.7g、叶酸0.003-0.007g、1.5ml甘油；
[0008]C、变色剂:噻唑蓝溶液100ml ；
[0009]D、药物储存液:64 μ g/ml异烟肼储存液、320 μ g/ml利福平储存液、640 μ g/ml乙胺丁醇储存液、640 μ g/ml链霉素储存液等四个药物溶液，以上四组分独立分装，用时按比例混合即可。
[0010]与其他同类上市的药敏培养基产品比较，培养基改进，优化了配方组分，能更有效的促进结核分枝杆菌的快速生产，培养基四大组分均为独立分装的液体试剂，使用时按一定的比例混合即可，增强了溶液组分抗杂菌污染能力，保证稳定性和灵敏性。
[0011]本发明第二方面是提供一种制备结核分枝杆菌最低抑菌浓度(MIC)快速检测试剂盒方法，包括以下步骤:
[0012]基础培养基的制备:
[0013]在10万级洁净度生产环境下，先将盐类成分:磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、L-谷氨酸钠、柠檬酸三钠2H20、葡萄糖加入到500ml灭菌蒸馏水中，充分搅拌溶解后，补充灭菌蒸馏水至800ml继续混合均匀，用121°C蒸汽灭菌，密闭待用；再将两性霉素B、羧苄青霉素、多粘菌素B、乳酸增效磺胺加入到50ml灭菌蒸馏水中混合搅拌至无色后，与蛋白胨、吐温80、150ml灭菌蒸馏水一起添加到上面混合好的待用溶液中，搅拌均匀，分装后用85°C灭菌I小时即可；
[0014]培养基添加剂的制备:
[0015]在10万级洁净度生产环境下，将亚油酸、叶酸加入到800ml灭菌蒸馏水中，用INHCL调节ph值6.6-6.7 ，添加1.5ml甘油，补充灭菌蒸馏水至1000ml，搅拌均匀后用0.22um的微孔滤膜进行过滤除菌，分装后用85°C灭菌I小时即可；
[0016]变色剂制备:
[0017]在10万级洁净度生产环境下，将水溶性四唑盐溶解于PBS (PH7.2)配置成5mg/ml的噻唑蓝溶液1000ml，用0.22um微孔滤膜滤过，分装后用85°C灭菌I小时，4°C避光保存；
[0018]药物储存液的制备:
[0019]在10万级洁净度局部万级的生产环境下，将量取好的异烟肼添加到灭菌蒸馏水中配制成64μg/ml，搅拌均匀分装用85°C灭菌I小时分装即可；将量取好的利福平添加到灭菌蒸馏水中配制成320 μ g/ml，搅拌均匀分装用85 °C灭菌I小时分装即可；将量取好的乙胺丁醇添加到灭菌蒸馏水中配制成640 μ g/ml，搅拌均匀用85°C灭菌I小时分装分装即可；将量取好的链霉素添加到灭菌蒸馏水中配制成640 μ g/ml，搅拌均匀后用85°C灭菌I小时分装即可。
[0020]该药敏培养基制备方法简单，便于操作，便于大规模生产。
[0021]本发明的第三个方面是提供一种结核分枝杆菌最低抑菌浓度检测方法，包括以下步骤:
[0022]步骤1:将基础培养基、培养基添加剂、变色剂按照(8.5-9.5): (0.9-1): (0.04-0.06)的质量份数比，优选 9: 0.95: 0.05 质量份数比配制，按每孔10ul加入96孔无菌微孔板，同时设置各浓度梯度药物，药物浓度梯度优选
0.0625ug/ml、0.125ug/ml、0.25ug/ml、0.5ug/ml、lug/ml、2ug/ml、4ug/ml、8ug/ml、16ug/ml、32ug/ml、64ug/ml、128ug/ml ；
[0023]步骤2:将试验菌株于罗氏培养基培养两周后,用液体培养基重悬,加入玻璃珠在漩涡震荡器上磨菌5~lOmin，取上层均匀的悬浊液用液体培养基比浊至0.5麦氏标准浊度待用；选取试验菌株对异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素用传统法检测药敏药敏背景清晰；
[0024]步骤3:在含药96孔板中，每孔加入5 μ I含有菌液的液体培养基，药物对照孔不加菌悬液，贴上封板膜，37°C培养，10~14d观察并记录结果；
[0025]与对照孔相比，待测培养孔颜色无明显变化的定为MIC值，MIC值>临界值，判断为耐药;MIC值〈临界值，判断为敏感，(MIC临界值为:异烟肼0.2 μ g/ml，利福平0.1yg/ml,乙胺丁醇2 μ g/ml,链霉素4 μ g/ml);采用上述同样试验方法,本产品对二线药物氧氟沙星、左氧氟沙星、卷曲霉素、阿米卡星、吡嗪酰胺、环丙沙星、紫霉素等进行耐药敏最低抑菌浓度(MIC)快速检测，结果总符合率为94.7% -100%，效果甚佳，并设置二线药物临界浓度:氧氟沙星1.0 μ g/ml、左氧氟沙星0.5 μ g/ml、卷曲霉素4.0 μ g/ml、阿米卡星1.0 μ g/ml、批嗪酰胺50.0 μ g/ml、环丙沙星1.0 μ g/ml、紫霉素2.0 μ g/ml。
[0026]MIC药敏临界值的测定方法
[0027]使用研发的微量显色法与传统的琼脂比例稀释法进行对比，ROC曲线分析，以确定临界浓度。
[0028]本试验采用变色培养基微量稀释法的原理是基于比色法的基础上，将最初单浓度的药敏检测发展为96微孔板孔多药敏浓度的MIC值快速分子检测技术，可以用分光光度计测定(波长为590nm)或者肉眼判读，运用更科学的药物代谢动力学和药效学模型原理设置临界值。
[0029]试验方法:以60株已知药敏结果的保存菌株作为实验菌株，根据已知药敏结果确定变色培养基微量稀释法MIC药敏判断界值，最后用80株连续时间段内收集的结核分枝杆菌临床分离株对变色培养基微量稀释法MIC药敏判断临界值进行验证和修正。
[0030]1.材料:
[0031]1.1菌株:60株已知药敏试验结果的结核分枝杆菌临床分离菌株，其中36株为四种药物全部敏感，6株为全部耐药,18株为不同耐药类型；80株未知药敏结果的结核分枝杆菌临床分离菌株。
[0032]1.2主要试剂与仪器:异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素购自美国sigma公司；7H9培养液；7H10培养基；比浊仪；培养箱；96孔板。
[0033]1.3药液配制:异烟肼、乙胺丁醇、链霉素均用去离子水溶解制成10mg/ml，利福平用二甲基甲酰胺溶解制成10mg/ml ;另用相应的溶剂配制异烟肼20g/ml溶液，利福平4000g/ml,乙胺丁醇200g/ml,链霉素400g/ml,所有备用药液均用0.22um无菌滤器过滤除菌，分装保存于4°C。
[0034]1.4MIC检测药物浓度设置:每种药物的终浓度分别为:异烟肼0.06~32g/ml，利福平 0.06 ~128g/ml,乙胺丁醇 0.25 ~32g/ml，链霉素 0.25 ~128g/ml。
[0035]1.5含药培养基的制备:L-J培养基按规程制备，在培养基凝固之前，每10ml加入Iml药物储备液，85~90°C血清凝固器中间歇灭菌2次，含药培养基于4°C冰箱中保存。
[0036]2.方法:
[0037]2.1MIC检测:试验前将10ul含药变色培养基加入96孔板中待用。将待测菌株于罗氏培养基培养两周后，用液体培养基重悬，加入玻璃珠在漩涡震荡器上磨菌5~lOmin，取上层均匀的悬浊液用液体培养基比浊至0.5麦氏标准浊度待用。在含药96孔板中，每孔加入5ul含有菌液的液体培养基，同时设生长对照和阴性对照，贴上封板膜，37°C培养，10~14d观察结果。
[0038]2.2间接比例法:于罗氏培养基培养两周后，用接种环刮取生长旺盛的菌落置于加有少许PBS缓冲液的磨菌管底部，磨菌，配成lmg/ml菌液，再将其进行1000倍稀释制备成10_3mg/ml菌液。以同样的方法再稀释100倍，得到10_5mg/ml菌液，2个浓度的菌液各取
0.01ml接种于对照培养基和含药培养基上。
[0039]2.3质量控制:每次实验均以卡介菌、耻垢杆菌为质控，0.1ml接种在生长对照孔。
[0040]3.结果读取:
[0041]3.1MIC结果读取:与阳性对照、阴性对照孔比较,观察颜色变化。
[0042]3.2间接比例法结果读取:
[0043]表1比例法菌落生长判读表
[0044]
【权利要求】
1.一种结核分枝杆菌最低抑菌浓度快速检测试剂盒，其特征在于包括: A、基础培养基:磷酸氢二钠2-3g、磷酸二氢钾0.5-1.5g、硫酸镁0.03-0.07g、L_谷氨酸钠0.3-0.7g、柠檬酸三钠2H200.01-0.08g、葡萄糖15_25g、两性霉素B5_15ug/ml、羧苄青霉素45-50ug/ml、多粘菌素B150_250ug/ml、乳酸增效磺胺15_25ug/ml、蛋白胨45_55g、吐温800.3-0.7ml ； B、培养基添加剂:亚油酸0.3-0.7g、叶酸0.003-0.007g、1.5ml甘油； C、变色剂:噻唑蓝溶液100ml； D、药物储存液:64μg/ml异烟肼储存液、320μ g/ml利福平储存液、640 μ g/ml乙胺丁醇储存液、640μ g/ml链霉素储存液四个药物溶液，所述组分为独立分装，用时按一定的比例混合即可。
2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌最低抑菌浓度快速检测试剂盒，其特征在于包括: A、基础培养基:磷酸氢二钠2g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.03g、L-谷氨酸钠0.3g、柠檬酸三钠2H200.01g、葡萄糖15g、两性霉素B5ug/ml、羧节青霉素45ug/ml、多粘菌素B150ug/ml、乳酸增效磺胺15ug/ml、蛋白胨45g、吐温800.3ml ；
B、培养基添加剂:亚油酸0.3g、叶酸0.003g、1.5ml甘油； C、变色剂:噻唑蓝溶液100ml； D、药物储存液:64μg/ml异烟肼储存液、320μ g/ml利福平储存液、640 μ g/ml乙胺丁醇储存液、640μ g/ml链霉素储存液等四个药物溶液。
3.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌最低抑菌浓度快速检测试剂盒，其特征在于包括: A、基础培养基:磷酸氢二钠3g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁0.07g、L-谷氨酸钠0.7g、柠檬酸三钠2H200.08g、葡萄糖25g、两性霉素B15ug/ml、羧苄青霉素50ug/ml、多粘菌素B250ug/ml、乳酸增效磺胺25ug/ml、蛋白胨55g、吐温800.7ml ； B、培养基添加剂:亚油酸0.7g、叶酸0.007g、1.5ml甘油； C、变色剂:噻唑蓝溶液100ml； D、药物储存液:64μg/ml异烟肼储存液、320μ g/ml利福平储存液、640 μ g/ml乙胺丁醇储存液、640 μ g/ml链霉素储存液等四个药物溶液。
4.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌最低抑菌浓度快速检测试剂盒，其特征在于包括: A、基础培养基:磷酸氢二钠2.5g、磷酸二氢钾lg、硫酸镁0.05g、L-谷氨酸钠0.5g、柠檬酸三钠2H200.04g、葡萄糖20g、两性霉素B10ug/ml、羧苄青霉素47ug/ml、多粘菌素B200ug/ml、乳酸增效磺胺20ug/ml、蛋白胨50g、吐温800.5ml ； B、培养基添加剂:亚油酸0.5g、叶酸0.005g、1.5ml甘油； C、变色剂:噻唑蓝溶液100ml； D、药物储存液:64μ g/ml异烟肼储存液、320 μ g/ml利福平储存液、640 μ g/ml乙胺丁醇储存液、640 μ g/ml链霉素储存液等四个药物溶液。
5.一种制备权利要求1、2、3或4所述的结核分枝杆菌最低抑菌浓度快速检测试剂盒的方法包括以下步骤:基础培养基的制备: 在10万级洁净度生产环境下，先将盐类成分:磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、L-谷氨酸钠、柠檬酸三钠2H20、葡萄糖加入到500ml灭菌蒸馏水中，充分搅拌溶解后，补充灭菌蒸馏水至800ml继续混合均匀后，用121°C蒸汽灭菌，密闭待用；再将两性霉素B、羧苄青霉素、多粘菌素B、乳酸增效磺胺加入到50ml灭菌蒸馏水中混合搅拌至无色后，与蛋白胨、吐温80、150ml灭菌蒸馏水一起添加到上面混合好的待用溶液中，搅拌均匀，分装后用85°C灭菌I小时即可； 培养基添加剂的制备: 在10万级洁净度生产环境下，将亚油酸、叶酸加入到800ml灭菌蒸馏水中，用IN HCL调节ph值6.6-6.7,添加甘油，补充灭菌蒸懼水至1000ml,搅拌均匀后用0.22um的微孔滤膜进行过滤除菌，分装后用85°C灭菌I小时即可； 变色剂制备: 在10万级洁净度生产环境下，将噻唑蓝溶液100ml直接分装后用85°C灭菌I小时即可； 药物储存液的制备: 在10万级洁净度局部万级的生产环境下，将量取好的异烟肼添加到灭菌蒸馏水中配制成64 μ g/ml，搅拌均匀分装后用85°C灭菌I小时即可；将量取好的利福平添加到灭菌蒸馏水中配制成320 μ g/ml，搅拌均匀分装后用85°C灭菌I小时即可；将量取好的乙胺丁醇添加到灭菌蒸馏水中配制成640 μ g/ml，搅拌均匀分装后用85°C灭菌I小时即可；将量取好的链霉素添加到灭菌蒸懼水中配制成640 μ g/ml,搅拌均匀分装后用85°C灭菌I小时即可。
6.一种以1、2、3或4所述的结核分枝杆菌最低抑菌浓度快速检测试剂盒为基础的结核分枝杆菌最低抑菌浓度的检测方法，包括以下步骤: 步骤1:将基础培养基、培养基添加剂、变色剂按照(8.5-9.5): (0.9-1): (0.04-0.06)的质量份数比配制，按每孔10ul加入96孔无菌微孔板，同时设置各浓度梯度药物平行对照孔； 步骤2:选取对异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素的药敏背景清晰的试验菌株于罗氏培养基培养两周后，用液体培养基重悬，加入玻璃珠在漩涡震荡器上磨菌5~lOmin，取上层均匀的悬浊液用液体培养基比浊至0.5麦氏标准浊度待用； 步骤3:在含药96孔板中，每孔加入5 μ I含有菌液的液体培养基，药物对照孔不加菌悬液，贴上封板膜，37°C培养，10~14d观察并记录结果，与对照孔相比，待测培养孔颜色无明显变化的定为MIC值，MIC值> 临界值，判断为耐药;MIC值〈临界值，判断为敏感，MIC临界值为:异烟肼0.2 μ g/ml，利福平0.1 μ g/ml,乙胺丁醇2 μ g/ml,链霉素4 μ g/ml。
7.根据权利要求6所述的结核分枝杆菌最低抑菌浓度的检测方法，其特征在于:将基础培养基、培养基添加剂、变色剂按照9: 0.95: 0.05的质量份数比配置。
8.根据权利要求6所述的结核分枝杆菌最低抑菌浓度的检测方法，其特征在于:平行对照孔浓度梯度设为 0.0625ug/ml、0.125ug/ml、0.25ug/ml、0.5ug/ml、lug/ml、2ug/ml、4ug/ml、8ug/ml、16ug/ml、32ug/ml、64ug/ml、128ug/ml0
【文档编号】C12Q1/20GK104073546SQ201410226302
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】齐伟 申请人:河南赛诺特生物技术有限公司