参与枇杷果实木质素合成调控的转录因子EjMYB1及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一个参与枇杷果实木质素合成调控的转录因子EjMYB1。以拟南芥中特异调控木质素合成的AtMYB58氨基酸序列为参考序列，利用蔷薇科数据库，通过同源克隆获得。EjMYB1的表达量在枇杷不同组织、不同处理中与木质素的积累呈正相关；EjMYB1可正向调控木质素合成基因EjPAL1、Ej4CL1和Ej4CL5的启动子活性；EjMYB1在烟草中瞬时过量表达时，可极显著提高其叶片木质素含量。
【专利说明】参与枇杷果实木质素合成调控的转录因子及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一个参与枇杷果实木质素合成调控的转录因子心￥7沒7。
【背景技术】
[0002]MYB是一类存在于真核生物中的功能多样的转录因子。MYB含有高度保守的DNA结构域，称为MYB结构域，是由52个氨基酸组成的4个不完全重复氨基酸序列，根据MYB结构域数量的不同可以分为几类，其中R2R3-MYB为在植物中研究十分广泛的一类，在拟南芥中有126个R2R3-MYB成员，并细分为22个亚家族。R2R3-MYB参与植物特异的生长过程，初生和次生代谢、细胞建成、发育过程和响应生物与非生物胁迫等。
[0003]木质素是芳香族类的杂聚物，是次生细胞壁的主要组成之一。木质素可参与植株机械支持、维管系统中的水分和溶质运输、防御病虫害等生命活动。然而，在有些植物中，木质素却是影响其品质的主要因素之一，例如，作为生物能源的柳枝稷，次生细胞壁的另两个组成成分纤维素、木聚糖是作为发酵的主要碳源，而木质素则会影响其生物转化过程；作为果蔬类的枇杷、山竹、竹笋、芹菜等，木质化则严重影响了其食用品质与贮藏品质。
[0004]枇杷(iZr1AoirjaLindl.)属于蔷薇科,为非跃变型果实,可分为红肉和白肉两大类型。与其他果实采后出现软化的现象不同，红肉枇杷果实在采后会出现木质化现象，使果实硬度上升，粗糙少汁，风味变淡，商品价值下降。因此，分析木质化产生的调控机制，在枇杷果实木质 化研究中具有重大意义。在转录调控水平上，多个MYB成员是在木质素合成途径中起转录激活的作用。拟南芥中先后发现参与次生细胞壁的形成，AtMYB58、AtMYB63为特异参与木质素的合成调控。另外，木本植物中，火炬松的PtMYBl、PtMYB4、PtMYB8,桉树的汾#7似、杨树的PtrMYB3、PtrMYB20都参与木质素单体的合成。果树研究上，并未涉及类似MYB的研究，枇杷作为木质化现象典型的果实开展此类研究的是十分必要和重要的。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一个参与枇杷果实木质素合成调控的MYB转录因子其核苷酸序列编号为:SEQ ID NO:1。其与拟南芥中特异调控木质素合成的相似度高，基因表达模式与枇杷木质素的合成呈正相关，可正向诱导木质素合成基因EJ4CL1取Ej4CL5的启动子活性。转录因子具体通过以下步骤获得:
以拟南芥中特异调控木质素合成的氨基酸序列为参考序列，在蔷薇科数据库中(http://www.rosaceae.0rg)进行比对,选择匹配度最高的三条序列，MDP0000133542 (chr5:11008894..11011881), MDP0000435315(chr3:7586759..7588715)和 MDP0000230141(chr3:7611165..7613121)，根据这三条序列在苹果基因组上的位置，获得相应核苷酸序列；根据这三条序列设计引物，以枇杷cDNA为模板，获得以MDP0000230141 (chr3:7611165..7613121)为序列的枇杷序列SEQ:N0.\，命名为EjMYBl。[0006]为了进一步确定序列SEQ:N0.1的编码区，对其进行RACE扩增。根据SEQ:N0.1序列设计RACE引物SEQ:N0.2-5,以枇杷RACE cDNA作为模板，参照SMART RACE cDNAAmplificat1n (Clontech)说明，进一步确定枇杷上此序列的编码区,获得包含非翻译区的SEQ:N0.6。
[0007]1.EjMYBl表达量与枇杷木质素合成呈正相关:
根据已获得的包含非翻译区的SEQ:N0.6设计实时定量荧光PCR引物(SEQ:N0.7-8),产物长度为89bp，其特异性经熔点曲线以及测序结果验证。分析枇杷不同组织(茎、叶、果实)以及不同处理果实(0°C，热激，程序降温)的木质素含量，并提取样品总RNA经TURBODNase 处理后合成 cDNA (RevertAid ? First Strand cDNA, Fermates)。以批杷 cDNA 为模板，参照 LightCycler FastStart DNA Masterpius SYBR Green I (Roche),利用 LightCycler1.5定量PCR仪(Roche)进行实时定量PCR分析。结合各样品中木质素含量分析，结果显示在木质素含量高的枇杷组织中，^7及招7的表达量同样较高；经01:处理的枇杷果实木质素积累增加，同时的表达被迅速强烈诱导；而热激和程序降温处理后果实中木质化进程延缓，且EjMYBl的表达被缓慢诱导。
[0008]所述的实时定量PCR 参数为:5 X LightCycler FastStart DNA Master?5 SYBRGreen I Master Mix 2 μ I,上下游引物(10 “]\0各0.5 yl，cDNA 模板 I yl，PCR 级别的水6 μL，共10 μ I体系。反应条件为95°C预变性5min;95°C变性5 sec，60°C退火5 sec，45个热循环；熔解曲线分析65°C到95°C，每5sec升高1°C，结束。
[0009]2.EjMYBl可正向调控木质素合成基因启动子活性:
(X)EjMYBl的表达载体构建:
根据确定的心*^7的全长序列(SEQ:N0.1)设计全长引物(SEQ:N0.9_10)，以枇杷 cDNA 为模板，参照 FastStart High Fidelity PCR System (Roche)进行 PCR 扩增，产物回收连接到PGEM-T easy载体转化到大肠杆菌DH5 α，进行测序确定。确定后将质粒经Not\、Spel双酶切,连接到表达载体pGreen SK。重组质粒经测序验证,进而电转到农杆菌GV3101::pSoup中，以甘油菌形式保存于_80°C。
[0010](2)EjMYBl转录调控启动子活性分析:
设计引物(SEQ:N0.11-28),以 GenomeWalker ? Universal Kit 试剂盒(Clontech,USA)制备的枇杷DNA为模板，扩增枇杷木质素合成基因^/Π、和的启动子序列(SEQ:N0.29-37)，分别重组到pGreen LUC表达载体上，重组质粒经测序验证。将含有 pGreen SK、pGreen UjMYBl、pGreen UiC-EjPALU pGreen UiC-Ej4CLs 和 pGreenLUCiyC^s启动子的重组质粒的甘油农杆菌分别划线于含25 μg/ml庆大霉素和50 μ g/ml卡那霉素的LB培养基上培养48 h后，刮取部分农杆菌涂布到相同的培养基上过夜培养。收集农杆菌到渗透液中(10 mM MES，1mMMgCl2,150 mM乙酰丁香酮，pH 5.6)，并调整OD6tltl到
0.75。将 pGreen SK 和 pGreen UjMYBl 分别与 pGreen UiC-EjPALl^reen UiC-Ej4CLs,pGreen UiC-EjCADs以10:1的比例混合注射到约4周大小的本氏烟叶片上。3 d后，进行双荧光素酶检测，即检测叶片中REN和LUC的荧光值，计算LUC/REN的比值判断是否具有调控木质素合成基因和启动子活性的效应。结果显示-.EjMYBl可正向诱导EjPALl、Ej4CLl和启动子的活性，进而增强枇杷木质素的积累。
[0011]所述的双突光素酶检测方法为:应用Dual_Luciferase?Reporter Assay System(Promega)和荧光检测仪分析LUC和REN的表达。用半径2 mm的打孔器在注射口附近取样，放在100 μ I PBS缓冲液中磨碎，吸取上清液50 μ I,加入50 μ I Luciferase Assay Buffer避光反应1min后检测LUC荧光发光信号值，再加入50 μ I Stop & Glo Buffer避光反应1min后检测REN荧光发光信号值。
[0012]本发明的另一个目的是提供所述MYB转录因子在调控采后枇杷果实木质化中的应用。以烟草为例，瞬时过量表达时显著提高烟草叶片木质素含量，可增强烟草叶片木质素合成，证实其参与木质素合成的调控，同时为枇杷果实木质化这一产业问题提供理论基础。具体通过以下步骤实现:
将含pGreen SK或pGreen HjMYBl重组质粒的甘油农杆菌分别划线于含25 μ g/ml庆大霉素和50 μ g/ml卡那霉素的LB培养基上培养48 h，刮取部分农杆菌到新的培养基上过夜培养。收集农杆菌到渗透液中(10 mM MES, 10 mM MgCl2,150 mM乙酰丁香酮，pH 5.6)，并调整OD6tltl到0.75。将含pGreen SK或pGreen UjMYBl的农杆菌分别注射到约4周大小的普通烟草相同叶片的两边。5 d后，取注射的叶片冻于液氮中用于后续的木质素含量的测定。结果显示:瞬时过量表达的烟草叶片中木质素含量极显著高于对照叶片，证实EjMYBl在烟草体内具有生物活性，参与了木质素的合成过程。
[0013]现有延缓枇杷果实木质素合成的技术，多集中在不同储藏条件的尝试上，工作量大，经济效益低。而本发明提供一个正向参与枇杷果实木质素合成调控的转录因子及其调控机制，结 果显示，抑制表达的储藏条件即可显著抑制或延缓枇杷果实木质素的合成。本发明结果可有效指导枇杷果实的采后储藏，为解决枇杷果实木质化这一产业问题提供有力的理论支撑。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是枇杷不同组织中木质素含量与表达量的变化。
[0015]图2是不同处理中枇杷果实木质素含量的变化。
[0016]图3是不同处理中枇杷果实EjMYBl表达量的变化。
[0017]图4是EjMYBI调控木质素合成基因启动子活性分析。
[0018]图5是EjMYBl调控木质素合成的功能验证。
【具体实施方式】
[0019]下面结合附图和实施例对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。
[0020]实施例1 'EjMYBl全长序列的获得 (一)实验方法
1.序列查找:在蔷薇科(http://www.rosaceae.0rg)的 Apple Genome V1.0 predictedpeptides数据库中，应用blastp算法，以的氨基酸序列进行查找；选择匹配度最高的前三条序列:MDP0000133542 (chr5:11008894..11011881),MDP0000435315 (chr3:7586759..7588715) ,MDP0000230141 (chr3:7611165..76131 21)，根据这三条序列在苹果基因组上的位置，获得相应核苷酸序列，设计引物，以枇杷cDNA为模板，获得了以MDP0000230141(chr3:7611165..7 613121)为参考序列的枇杷序列 SEQ:N0.12.EjMYBl序列扩增:根据查找到的核苷酸序列扩增获得一条序列SEQ:N0.1，命名为EjMYBl。以枇杷cDNA为模板，应用SEQ:N0.9_10为引物扩增，参照FastStart HighFidelity PCR System (Roche)进行 PCR 扩增。PCR 反应条件为 94°C预变性 5 min ;94°C变性30 s，58°C退火30 s，72°C延伸90 S，35个循环；最后72°C延伸lOmin。PCR产物回收连接到pGEM-T easy载体转化到大肠杆菌DH5 α，进行测序确定。
[0021]3.EjMYBl 非编码区序列扩增:参照 SMART RACE cDNA Amplificat1n(Clontech)说明，设计RACE引物SEQ:N0.2_5。以枇杷RACE cDNA作为模板，以ExTaq聚合酶(Takara)进行PCR扩增，进行2次PCR。第一次PCR反应条件为:反应条件为94°C预变性5 min ；94°C变性 30 S，72。。，150 S，5 个循环;94°C变性 30 s，68°C退火 30 s，72°C延伸 150 S，5 个循环；94°C变性30 s，65°C退火30 s，72°C延伸150 S，25个循环；最后72°C延伸10 min。第二次反应以第一次反应的产物为模板进行，参数为:10 XExBuffer 2 μ L，2.5mmol/L dNTPs 1.6μ I,内测引物NUP 2 yL,10 μ mol/L特异内测引物0.5 μ 1，ExTaq聚合酶0.1 yL，加灭菌的双蒸水至20 μ L。94°C预变性5 min ； ;94°C变性30 s，58°C退火30 s，72°C延伸90 s，35个循环；最后72°C延伸10 min。PCR产物回收连接到pGEM_T easy载体转化到大肠杆菌DH5 α ,进行测序确定。
[0022](二)实验结果
获得了 EjMYBl的序列SEQ:Ν0.1，进一步通过RACE扩增，得到了该序列的5’、3’末端的非翻译区，即SEQ:N0.6，其中SEQ:N0.1 % EjMYBl的编码区。
[0023]实施例2 'EjMYBl在枇杷不同组织以及不同处理的果实中的表达模式分析 (一)实验方法
1.样品处理
成熟度一致，大小均匀，无病虫害的枇杷果实进行以下处理:0°c，即直接将果实贮藏在(TC环境；热激处理，即40°C处理4 h后，再贮藏到0°C环境；程序降温处理，即5°C下放置6d以后，再贮藏在0°C环境。果肉切成块状后迅速放在液氮中，之后放在_80°C保存。叶片、茎组织用液氮冻后，放在_80°C保存。
[0024]2.总 RNA 提取
分别称取存放在_80°C的枇杷叶片、茎各0.2 g，果实I g，按以下步骤提取总RNA:样品在液氮中充分研磨，加入到65°C预热的装有4 ml CTAB/80 μ I β -巯基乙醇提取缓冲液的10 ml离心管中，涡旋混合放到65°C加热2 min ;再向离心管中加入4 ml氯仿:异戊醇(24:I)抽提液，涡旋混合；15°C 1000rpm离心10 min，吸取上清到新的1ml离心管中，再次加Λ 4 ml氯仿:异戊醇(24:1)抽提液，涡旋，10000 rpm离心10 min,吸取上清到新的10 ml离心管中；加入1/4体积的10 mol/1的LiCl2，放置在4°C冰箱过夜。次日，4°C 10000 rpm离心30 min，倒上清，用枪头轻轻吸去残余的液体，加入400 μ I 65°C预热的SSTE溶液，溶解沉淀；再加入500 μ I氯仿:异戊醇(24:1)抽提液，涡旋混合，将液体全部转移到1.5 ml离心管中，10000 rpm离心10 min,吸取上清至新的1.5 ml的离心管中，加入2倍体积-201^?冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，-80°C放置30 min以上；4°C 10000 rpm离心25 min,倒掉上清液，用枪头轻轻吸去残余的液体，加入20 μ I DEPC水溶解沉淀。即为总RNA。
[0025]3.基因表达模式分析
将提取的总RNA用TURBO DNase去除其中的DNA后，参照Fermates公司提供的RevertAid ? First Strand cDNA 合成试剂盒合成 cDNA。使用 LightCycler FastStart DNAMaster?5 SYBR Green I染料试剂盒说明书，应用LightCycler 1.5定量PCR仪用内参基因ACT将各个模板浓度调整到相对一致水平Ct=22~23左右。调整后的cDNA作为模板，用EjMYBl实时定量引物SEQ:N0.7_8和内参基因ACT进行荧光定量PCR，得到相应的Ct值。不同组织的表达量采用绝对定量的方法计算，即2_ΛΜ，其中Λ Ct为Ct {EJMYB1、与Ct (ACT)之差。三个处理的表达量用相对定量的计算方法，即，即Λ Ct为Ct {EJMYB1、与Ct(ACT)之差，ΔΔ Ct为Λ Ct (某天处理值)与Λ Ct (第O天值)之差。
[0026](二)实验结果
在不同组织中，木质素含量高的组织中，表达量也较高(附图1)。0°C处理过程中随着木质素含量上升，迅速响应，表达量上升，而热激和程序降温处理可以减缓果实木质素含量的升高(附图2)，并抑制表达的上升趋势(附图3)。EjMYBl的表达量与木质素含量的变化呈正向相关，由此推测参与枇杷木质素的合成。
[0027]实施例3..EjMYBl转录调控木质素合成基因启动子活性分析 (一)实验方法
1.枇杷木质素合成基因启动子载体构建
设计引物(SEQ:N0.11-28), VX Genomeffalker? Universal Kit 试剂盒(Clontech,USA)制备的枇杷DNA为模板，使用Platinum? Taq DNA Polymerase体系进行2轮PCR,扩增枇杷木质素合成基因万H,EJ4CLs和的启动子序列(SEQ:N0.29-37)。第一轮进行PCR反应程序为 94°C变性 25s，72。。，3 min，7 个循环；94°C变性 25s，67。。，3 min, 32 个循环；67°C延伸7min。以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增，反应程序为94°C变性25 s,72°C，3min，7个循环； 94°C变性25 s，67°C，3 min，32个循环；671:延伸7 1^11。回收后连接到pGEM-T easy载体并转化到大肠杆菌DH5 α，进行测序确定。
[0028]用Sal/Nco\双酶切已连到pGEM-T easy载体上的启动子，连接到pGreen LUC载体上。转化到大肠杆菌DH5ci，进行测序确定。将启动子的重组质粒电转到农杆菌GV3101中，挑取阳性克隆，并保存在75%甘油中。
[0029]2.注射烟草
将含有 pGreen SK、pGreen UjMYBl、pGreen UiC-EjPAL1、pGreen UiC-Ej4CLs 和pGreen UiC-EjCADs启动子的重组质粒的甘油农杆菌分别划线于含25 μ g/ml庆大霉素和50 μ g/ml卡那霉素的LB培养基上培养48 h后，刮取部分农杆菌涂布到相同的培养基上过夜培养。收集农杆菌到渗透液中(10 mM MES，10 mM MgCl2,150 mM乙酰丁香酮，pH5.6)，并调整 OD6tltl 到 0.75。将 pGreen SK、pGreen UjMYBl 分别与 pGreen UiC-EjPAL1、pGreenLUC-^/mi,pGreen LUC-^/^α^以10:1的比例混合注射到约4周大小的本氏烟叶片上，每株注射三片叶子。生长3 d后进行荧光值检测。
[0030]3.双荧光素酶检测分析
用半径2 _的打孔器在注射口附近取样，每片叶子取2个圆片，一共6个圆片。圆片放在100 μ I PBS缓冲液中磨碎，吸取上清液50 μ I,加入50 μ I Luciferase Assay Buffer避光反应1min后检测LUC荧光发光信号值，再加入50 μ I Stop & Glo Buffer避光反应1min后检测REN荧光发光信号值。通过比较pGreen HjMYBI和阴性对照pGreen SK的LUC/REN比值，判断是否具有调控启动子活性的效应。[0031](二)实验结果
EjPAL, EJ4CL, EjCAD是枇杷木质素合成的关键结构基因，在基因家族中^/况17和EJ4CL5两个成员参与木质素的合成。本发明结果证实EjMYBl可增强EjPALl ,EJ4CL1和启动子的活性分别达到3倍，14倍和4倍(附图4)，进而参与枇杷木质素的合成调控。
[0032]实施例4 'EjMYBl调控木质素合成的功能验证 (一)实验方法
1.烟草注射
将含pGreen SK或pGreen UjMYBl重组质粒的甘油农杆菌分别划线于含25 μ g/ml庆大霉素和50 μ g/ml卡那霉素的LB培养基上培养48 h后，刮取部分农杆菌到涂布到相同的培养基上过夜培养。收集农杆菌到渗透液中(10 mM MES, 10 mM MgCl2,150 mM乙酰丁香酮，PH 5.6)，并调整0D_到0.75。使用无针头注射器将菌液注射到约4周大小的普通烟的叶片上，每株植株注一片叶子，在同一片叶子的两侧分别注射含pGreen SK或pGreen UjMYBl重组质粒的农杆菌菌液。生长5 d后，取注射过的叶片进行木质素含量的测定。
[0033]2.木质素含量测定
样品的洗涤:烟草叶片冻样置于液氮中磨成粉末，装入到5 mL洗液(100 mM的K2HPO4/KH2PO4,0.5% Triton X-100,0.5% PVP，pH 7.8)中，在室温下振荡洗涤 30 min, 10000 g，20 min 离心，用洗液重悬浮沉淀，重复洗两次，再用100%甲醇洗4次，每次洗的时间均为0.5 h，同样10000 g，20 min离心。沉淀在80°C烘箱中烘干过夜。木质素含量的测定:精确称取10 mg的经洗涤烘干后的粉末于10 mL的带盖的管子，加入I mL的2 M HCl和0.1 mL的巯基乙酸，沸水浴8 h后置冰上冷却，15000 g，4°C离心20 min ;沉淀用蒸馏水清洗、过夜烘干后重悬浮于2 mL的I M的NaOH中，室温下轻微振荡反应18 h，再用15000 g,离心20 min ;取0.5 mL的上清液于新的试管中，加入100 μ L的浓盐酸，置4°C下4 h以沉淀巯基乙酸结合的木质素，用15000 gdO离心20 min,沉淀溶于I mL的I M的NaOH。经过适当稀释后,用紫外-可见分光光度计测定280 nm处的吸光值。以NaOH溶液为空白对照。单位为X 13 A280/kg FW，重复3次。
[0034](二)实验结果
注射含PGreen SK表达载体的农杆菌烟草叶片中木质素含量为3.01 X 13 A280/kg Fff,而注射含pGreen UjMYBl重组质粒的农杆菌烟草叶片的木质素含量达到了 3.74X103A280/kg Fff,极显著地高于阴性对照(附图5)。本发明结果证实了，反具有调控木质素合成的功能。
[0035]对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【权利要求】
1.参与枇杷果实木质素合成调控的转录因子，其特征在于，该转录因子的核苷酸序列为:SEQ IDNO =10
2.根据权利要求1所述的参与枇杷果实木质素合成调控的转录因子其特征在于，所述转录因子通过以下步骤获得:以拟南芥中特异调控木质素合成的氨基酸序列为参考序列，查找蔷薇科植物中的同源序列，首先在蔷薇科数据库网站进行比对，选取匹配度最高的前三个序列，设计引物，获得序列SEQ:N0.1的转录因子^/￥7价。
3.根据权利要求1所述的参与枇杷果实木质素合成调控的转录因子在调控采后枇杷果实木质化中 的应用。
【文档编号】C12N15/84GK104031922SQ201410230291
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】殷学仁, 徐倩, 李鲜, 陈昆松 申请人:浙江大学