一种葡萄糖氧化酶突变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种葡萄糖氧化酶突变体，是氨基酸序列为SEQ?ID?NO：1的葡萄糖氧化酶的第172位氨基酸由Asn变为Arg，第525位氨基酸由Cys变为Asn。上述葡萄糖氧化酶突变体的氨基酸序列为SEQ?ID?NO：3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ?ID?NO：4。本发明的葡萄糖氧化酶突变体的最适作用pH值为6.0，在pH4.0-6.0范围内均很稳定，pH耐受性与野生型差别不大；突变体的最适作用温度为40℃，且在60℃、65℃和70℃条件下分别处理1h后，仍能保持78.1％、47.7％和15.9％的残余酶活，耐热性远远高于野生型，从而说明突变导致葡萄糖氧化酶的耐热性得到大幅提升，这一特性使突变体GODP-2H比野生型更适合在工业生产中的应用。
【专利说明】一种葡萄糖氧化酶突变体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于功能基因改造【技术领域】，具体涉及一种新型的葡萄糖氧化酶突变体及其应用。
【背景技术】
[0002]葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能专一地氧化β -D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶通常与过氧化氢酶组成一个氧化还原系统，在分子氧存在下氧化β -D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸内酯，同时消耗氧生成过氧化氢。过氧化氢酶将过氧化氢分解生成水和1/2氧，而后水又与葡萄糖酸内酯结合产生葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶对β-D-批喃葡萄糖表现出 强烈的特异性，葡萄糖分子Cl上的羟基对酶的催化活性至关重要，且羟基处于β位时要比在α位时高160倍。葡萄糖氧化酶对L-葡萄糖和2-0-甲基-D-葡萄糖完全没有活性。
[0003]由于葡萄糖氧化酶的除氧和抗氧化作用，使其在食品、医药、饲料等方面应用非常广泛。在食品工业中，葡萄糖氧化酶作为一种食品保鲜剂，在防止啤酒老化、保持产品原有风味、延长保质期方面有显著效果，还可作为面粉改良剂和面包品质改良剂提高食品质量。在医药领域，我国医院普遍采用葡萄糖氧化酶电极法、葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法等检测血液、血清中葡萄糖含量。作为一种新型的饲料添加剂，葡萄糖氧化酶能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。
[0004]葡萄糖氧化酶广泛分布于动物、植物及微生物体内，工业上主要利用黑曲霉菌或青霉菌进行生产，但是常出现酶活力不高、稳定性差、杂蛋白污染以及分离纯化繁琐等问题。因此目前普遍采用基因工程方法构建更优良的菌株生产葡萄糖氧化酶。Silvia等人将来源于青霉的葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母X33中进行表达，3L发酵罐酶活为50U/mL ;母敬郁等人利用瑞氏木霉表达重组的黑曲霉葡萄糖氧化酶，通过基因重组和诱变筛选使瑞氏木霉突变株的葡萄糖氧化酶发酵酶活达25U/mL ；Zhaowei Gao等人在毕赤酵母中表达来源于点青霉的葡萄糖氧化酶，经密码子偏好性优化的基因在3L发酵罐中酶活达到615U/mL，410%高于未经优化的基因(148U/mL)。但目前构建得到的基因工程菌株对葡萄糖氧化酶的表达能力尚不能满足工业生产的要求，导致该酶的生产成本还是居高不下，制约了该酶的广泛应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种新型葡萄糖氧化酶突变体及其应用。本发明通过将来源于斜卧青霉(Penicillum decumbens)的葡萄糖氧化酶进行蛋白质工程改造,获得了耐热性提高的突变体蛋白，并通过将该突变体基因转化入毕赤酵母中，构建得到重组表达工程菌株。所述葡萄糖氧化酶产量高，PH稳定性和热稳定性好，有利于其在食品和饲料领域的广泛应用。
[0006] 申请人:对斜卧青霉的葡萄糖氧化酶进行突变，经过大量的筛选，发现N172R，C525N这两个突变位点能引起葡萄糖氧化酶耐热性的改变，从而促成本发明。
[0007]本发明一方面提供了一种葡萄糖氧化酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶的第172位氨基酸由Asn变为Arg，第525位氨基酸由Cys变为Asn。
[0008]上述葡萄糖氧化酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其一种编码基因的核酸序列为 SEQ ID NO:4o
[0009]本发明另一方面提供了一种表达载体，其包含上述编码氨基酸序列为SEQ IDNO:3的葡萄糖氧化酶突变体的核苷酸。
[0010]本发明提供了一种重组宿主细胞，其携带有表达编码序列为SEQ ID NO:3的葡萄糖氧化酶突变体基因的表达载体。
[0011]上述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)。
[0012]本发明还提供了上述葡萄糖氧化酶在食品中的应用。
[0013]本发明所述葡萄糖氧化酶突变体的最适作用pH值为6.0，在pH4.0-6.0范围内均很稳定，pH耐受性与野生型差别不大；突变体的最适作用温度为40°C，且在60°C、65°C和70°C条件下分别处理Ih后，仍能保持78.\%Λ?.7%和15.9%的残余酶活，耐热性远远高于野生型，从而说明突变导致葡萄糖氧化酶的耐热性得到大幅提升，这一特性使突变体G0DP-2H比野生型更适 合在工业生产中的应用。本发明所述葡萄糖氧化酶G0DP-2H能显著增强面团的筋力，从而有效地改善面团的操作性能，面团不粘，有弹性；醒发后面团表面白而且光滑、细腻；烘烤后面包体积膨大，比容大，且皮质细致，无斑点，不起泡，气孔细密均匀，内部组织纹理结构好，白度高。所述葡萄糖氧化酶可广泛应用于面粉及其制品加工领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1:毕赤酵母G0DP-2H发酵上清液SDS-PAGE电泳检测图。
[0015]图2:葡萄糖氧化酶突变体G0DP-2H和野生型G0DP_2pH-相对酶活曲线图。
[0016]图3:葡萄糖氧化酶突变体G0DP-2H和野生型G0DP_2pH稳定性比较图。
[0017]图4:葡萄糖氧化酶突变体G0DP-2H和野生型G0DP-2作用温度-相对酶活曲线图。
[0018]图5:葡萄糖氧化酶突变体G0DP-2H和野生型G0DP-2耐热性比较图。
【具体实施方式】
[0019]以下实施例是为了更好地说明阐述本
【发明内容】
，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。
[0020]实施例1葡萄糖氧化酶突变体基因的合成及扩增
[0021]为了提高来源于斜卧青霉的葡萄糖氧化酶G0DP_2(氨基酸序列为SEQ ID NO:1)的耐热性，通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR引物G0DP-2-F、G0DP-2-R 如下:
[0022]G0DP-2-F:GGCGAATTCTACTTGCCAGCACAGCAAATTGATGT (下划线为限制性内切酶EcoR I识别位点)
[0023]G0DP-2-R:ATAGCGGCCGCTTAAGCAGACTTGGCGTAGTCATCC (下划线为限制性内切酶Not I识别位点)
[0024]以G0DP-2野生型基因为模板，以上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，回收PCR产物的经EcoR1、NotI酶切处理后与经同样酶切后的pET-2 Ia载体连接，转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37 °C倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入500 μ L含有0.01mM IPTG的LB+Amp培养基，370C 220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有葡萄糖氧化酶的大肠杆菌细胞裂解液。
[0025]分别取出10 μ L裂解液至两块新的96孔板，其中一块于70°C处理5min后，两块96孔板都加入40 μ L底物，于30°C反应30min后，DNS法测定生成的还原糖，计算高温处理的酶液相比于未处理酶液的相对酶活。不同的突变子高温处理后保持的活性不同。有些突变子葡萄糖氧化酶的耐热性与野生型相比没有明显变化，有的突变子耐热性降低，筛选出耐热性提高的突变子进行DNA测序，最终， 申请人:找到了能提高葡萄糖氧化酶耐热性的突变组合N172R和C543N。
[0026]含N172R和C543N两点突变的葡萄糖氧化酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:4由上海捷瑞生物公司合成。
[0027]将合成的葡萄糖氧化酶突变体基因命名为G0DP-2H，用引物G0DP_2_F、G0DP-2-R进行PCR扩增，引物两端引入EcoR1、NotI位点。PCR反应条件为:94°C变性5min ;然后94°C变性30s，56°C复性30s，72°C延伸1.5min, 30个循环后，72°C保温lOmin。琼脂糖凝胶电泳结果显示，基因为大小约ISOObp的片段。
[0028]通过上述同样的PCR方法扩增得到野生型葡萄糖氧化酶G0DP-2的基因片段SEQID NO:2。
[0029]实施例2毕赤酵母工程菌株的构建
[0030]将上述克隆得到的葡萄糖氧化酶G0DP-2H片段，通过EcoRI和NotI位点与表达载体pPIC9K相连接，构建表达载体pPIC9K-P2H。
[0031]将表达质粒pPIC9K-P2H用SalI进行线性化，线性化片段通过电穿孔法转化毕赤酵母GSl 15，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-P2H，并用不同浓度遗传霉素的YPD平板筛选高拷贝转化子。
[0032]将其中一个转化子命名为毕赤酵母G0DP-2H(Pichia pastoris G0DP-2H)，转接于BMGY培养基中，30°C、250rpm振荡培养Id ;再转入BMMY培养基中，30°C、250rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4d ;离心去除菌体，得到含葡萄糖氧化酶突变体G0DP-2H的发酵上清液；将其进行SDS-PAGE电泳检测分析，结果如图1所示，箭头所指处的蛋白条带即为毕赤酵母G0DP-2H重组表达的葡萄糖氧化酶突变体，但其比突变体的理论分子量(64.SkDa)略大，可能是由于糖基化作用使重组表达的蛋白偏大。
[0033]通过上述同样的方法构建得到重组表达野生型葡萄糖氧化酶基因G0DP-2的毕赤酵母工程菌，命名为毕赤酵母G0DP-2 (Pichia pastoris G0DP-2)。采用上述同样的方法进行G0DP-2的发酵和处理，得到含重组野生型葡萄糖氧化酶G0DP-2的发酵上清液。
[0034]实施例3发酵验证
[0035]在IOL发酵罐上分别进行毕赤酵母G0DP-2和毕赤酵母G0DP-2H的发酵，发酵使用的培养基配方为:硫酸钙1.lg/L、磷酸二氢钾5.5g/L、磷酸二氢铵55g/L、硫酸钾20.3g/L、硫酸镁16.4g/L、氢氧化钾1.65g/L、消泡剂0.05%。
[0036]发酵工艺:pH值5.0、温度30°C、搅拌速率300rpm、通风量1.0-1.5 (v/v)、溶氧控制在20%以上。
[0037]整个发酵过程分为三个阶段:第一阶段为菌体培养阶段，按7%比例接入种子，30°C培养24_26h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80%以上表明该阶段结束，为期约30-60min ;第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20%以上，培养时间在150-180h之间。发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。
[0038]葡萄糖氧化酶酶活测定方法
[0039]将粗酶液直接用缓冲液稀释至约10U/mL。
[0040]取4支150*15的试管，加入2ml缓冲液、0.3ml葡萄糖、0.4ml苯酚、0.1ml4-氨基安替吡啉、0.1ml辣根过氧化物酶，30°C预热5min。向其中一管加入0.1ml蒸馏水，作为空白调零。水浴锅放在分光光度计旁以方便操作，向样品管中加入0.1ml样品溶液，此时开始计时，涡旋混匀后立 即在500nm波长处用Icm比色杯比色。读取0.5min时吸光度值为AO’再反应Imin后，读取吸光度值Al，得出ΛΑ500 =Al-AO0
[0041]酶活计算公式:
[0042]试样中酶活力Xl (U/mL或U/g)按照如下公式计算:
[0043]Xl= ΔA500Xf XBX 1000/(887XtXAXd) = 33.82X ΛA500Xf
[0044]式中:
[0045]f---------------------酶液稀释倍数
[0046]B--------------------反应液体积(3ml)
[0047]1000----------------消光系数单位转换系数
[0048]887-----------------消光系数(L.mol_l.cm-1)
[0049]t---------------------反应时间(min),即读数Al与AO之间的时间差值lmin。
[0050]A--------------------加入样品体积(0.1ml)
[0051]d--------------------比色皿的厚度(cm)
[0052]每个试样应取二份平行样进行分析测定，相对偏差不超过8%。
[0053]按照上述方法测定重组表达野生型葡萄糖氧化酶的毕赤酵母G0DP-2最终的发酵酶活为3024U/mL，而重组表达葡萄糖氧化酶突变体的毕赤酵母G0DP-2H最终的发酵酶活高达3930U/mL，比野生型提高了 30%。
[0054]实施例4葡萄糖氧化酶的酶学性质测定
[0055]1、最适作用pH和pH稳定性分析
[0056]采用pH 值分别为 2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0 的
磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在30°C下对实施例3所述发酵粗酶液进行葡萄糖氧化酶活力测定，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图2所示，野生型葡萄糖氧化酶G0DP-2与突变体G0DP-2H的最适作用pH值都为6.0,且在不同pH条件下的相对酶活水平差别不大。
[0057]采用pH值分别为4.0、5.0、6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，将上述粗酶液稀释至约100U/mL，30°C处理5h后，测定酶活，以未处理样品的酶活为100%，计算残余酶活。结果如图3所示，野生型葡萄糖氧化酶G0DP-2和突变体G0DP-2H的酶活水平在pH4.0-6.0之间均很稳定，两者的残余酶活水平差别不大，从而说明突变并未导致葡萄糖氧化酶的PH耐受性发生改变。
[0058]2、最适反应温度和热稳定性分析
[0059]分别在20 0C >25 0C >30 °C >35 °C >40 °C >45 °C >50 °C >55 °C >60 °C >65 °C >70 °C >75 V，
PH5.0条件下，对实施例3所述粗酶液进行葡萄糖氧化酶酶活测定，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图4所示，野生型葡萄糖氧化酶G0DP-2的最适作用温度为30°C;而葡萄糖氧化酶突变体G0DP-2H的最适作用温度为40°C，且在30-65°C范围内能保持70%以上的酶活力。与野生型相比，突变体的温度-相对酶活曲线整体向温度升高方向移动。
[0060]将上述粗酶液用pH6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释后，在60°C、65°C和70°C条件下分别处理Ih后，测定酶活，以未处理样品的酶活为100%，计算残余酶活。结果如图5所示，60°C、65°C和70°C处理后，葡萄糖氧化酶突变体的残余酶活均显著高于野生型。其中，野生型葡萄糖氧化酶在60°C处理后残余酶活为52.9%，但在65°C处理后酶活仅剩17.7%,70°C处理后酶活几乎全部失活；而葡萄糖氧化酶突变体在60°C处理后能保持约78.1%的酶活，在65°C处理后能保持47.7%的酶活，70°C处理后还有15.9%的酶活残留，从而说明突变导致葡萄糖氧化酶的耐热性得到大幅提升，这一特性使突变体G0DP-2H比野生型更适合在工业生产中的应用，因 而市场前景广阔。
[0061]实施例5葡萄糖氧化酶突变体在面团烘培中的应用
[0062]5.1面包制作方法
[0063]1、控制室温、面粉温度和水温在25°C左右，同一人操作；
[0064]2、将称量好的水、鸡蛋、糖放入搅拌缸内搅拌均匀；
[0065]3、加入预先混合好的面包专用粉、酵母、葡萄糖氧化酶G0DP-2H(酶活5000U/mL)，搅拌4分钟，加入盐，搅拌3分钟，加入奶油，搅拌5分钟，面粉、酵母、水、糖、盐、奶油、鸡蛋和葡萄糖氧化酶G0DP-2H的质量比分别为100:1:51:18:1:8:5:0.1，面团温度为26-28。。。以不添加酶制剂的面粉作为空白对照组，进行上述同样操作。
[0066]4、面团松弛5分钟，分割成60g面团数个，将其搓圆，继续松弛面团15分钟；
[0067]5、成型为面包，置于醒发箱醒发(温度36°C、相对湿度85%)，时间约为90-150分钟，面团醒发至八成入炉；
[0068]6、烘烤:上火180°C /下火180°C，15分钟。
[0069]5.2评价指标
[0070]1、面包重量、体积、高径比
[0071]面包出炉5分钟后，称量其质量，用菜籽置换法测定体积，分别用g和mL表示。使用游标卡尺，分别用cm表示，测量面包底部直径和高度。取3个实验样品的算术平均值作为测定结果。
[0072]2、面包外部与内部特征评价
[0073]面包在室温下冷却Ih后，放入消毒柜中保存。4h后对面包外部和内部特性进行感官评定，主要包括以下内容:面包外观、包芯色泽、包芯质地和纹理等。评定时先对外观进行评分，切开面包，按面包芯色泽、质地和纹理结构的顺序进行评定。[0074]5.3实验结果
[0075]
【权利要求】
1.一种葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的葡萄糖氧化酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶的第172位氨基酸由Asn变为Arg，第525位氨基酸由Cys变为Asn。
2.如权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的突变体的氨基酸序列为 SEQ ID NO:3o
3.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求2所述的葡萄糖氧化酶突变体。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQID Ν0:4。
5.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体携带有编码权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体的核苷酸。
6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述的核苷酸的序列为SEQID Ν0:4。
7.—种重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞为转化/转染有权利要求5所述的表达载体的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母。
9.权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体在食品领域中的应用。
【文档编号】C12R1/80GK103981159SQ201410247771
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】付娟, 肖志壮 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司