一种具有唾液酸水解酶活性的蛋白质及其应用的制作方法

一种具有唾液酸水解酶活性的蛋白质及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有唾液酸水解酶活性的蛋白质及其应用。本发明所提供的蛋白质，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是SEQ?ID?No.2的蛋白质；b)氨基酸序列是SEQ?ID?No.4的蛋白质；c)将SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白质；d)将SEQ?ID?No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白质。实验证明，本发明的Cce?sia-1具有明显的高比唾液酸水解酶酶活，可以催化神经节苷脂作生产单唾液酸四己糖神经节苷脂。
【专利说明】一种具有唾液酸水解酶活性的蛋白质及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】中一种具有唾液酸水解酶活性的蛋白质及其应用。
【背景技术】
[0002]单唾液酸四己糖神经节苷脂(GMl)被证明具有显著的神经修护及再生活性，是神经退行性疾病或神经损伤的良好的治疗药物，目前已被应用于阿尔茨海默症、帕金森症等疾病的治疗中。由于生产技术的制约，GMl的价格非常昂贵，而在神经系统疾病中，GMl用药周期较长，一个疗程最少也要三个月，如此一来，治疗费用大幅增加，导致GMl普遍应用受到限制。
[0003]目前，GMl的生产主要是从动物脑组织，如猪脑、牛脑中进行提取。提取时用到大量的氯仿、甲醇等有机试剂，造成了环境污染。此外，由于猪脑组织的神经节苷脂(gangliosides,GLS)中，GMl的含量较低，仅为10-20%，大部分是多唾液酸神经节苷脂，如⑶la、⑶lb、⑶3和GTlb等。直接提取时大部分的多唾液酸神经节苷脂被当作废弃物丢弃掉，最后提取得到的GMl还不到神经节苷脂总脂的10%，一方面造成了猪脑原材料的浪费，另一方面也增加了成本。
[0004]猪脑中多唾液酸神经节苷脂⑶la、⑶Ib和GTlb的含量占总神经节苷脂的50-60%。对比各种神经节苷脂的结构可知，GMl可通过水解⑶la，⑶Ib和GTlb的唾液酸残基得到。以往，有研究者通过部分酸水解猪脑神经节苷脂(gangliosides，GLS)来制备GMl0但酸水解的稳定性差，不同批次之间质量不稳定。此外，酸水解的专一性差，容易产生副产物，造成了 GMl产率偏低，且后续的产品分离纯化比较困难。也有研究者利用GLS作为诱导剂，与唾液酸水解酶产生细菌共同培养，通过这些细菌分泌的唾液酸水解酶来生物转化GLS，制备GM1。生物转化与酸水解相比，具有条件温和、专一性好等优越性。但是由于细菌分泌的唾液酸水解酶一般是诱导酶，即使用GLS进行诱导，分泌的唾液酸水解酶的量也非常少，造成了这一生物转化过程的效率很低，这一生产过程不适合放大，不适用于工业规模的应用。此外，细菌菌种容易出现退化、变异等问题，给生产过程增添了不稳定性。现在急需通过基因工程的手段，直接克隆和表达所需要的酶的基因，实现GMl的稳定制备。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是提供一种具有唾液酸水解酶活性的蛋白质及其编码基因与相关生物材料。该蛋白质不但具有较高的唾液酸水解酶活性，而且能将GLS转化为GMl。
[0006]本发明所提供的蛋白质，名称为Cce sia-Ι,来源于纤维菌(Cellulosimicrobiumsp.) 21，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质:
[0007]a)氨基酸序列是SEQ ID N0.2的蛋白质；
[0008]b)氨基酸序列是SEQ ID N0.4的蛋白质；
[0009] c)将SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白质；[0010]d)将SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白质。
[0011]其中，SEQ ID N0.2由703个氨基酸残基组成，是天然唾液酸水解酶Cce sia-Ι (名称为N Cce sia-Ι)的氨基酸序列；SEQ ID N0.4由724个氨基酸残基组成，是重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι (名称为R Cce sia-Ι)的氨基酸序列；SEQ ID N0.4是在SEQ ID N0.2的氨基末端添加氨基酸序列:MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM得到的氨基酸序列。
[0012]上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ IDN0.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上SEQ ID N0.1所示的信号肽的编码序列得到。上述d)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述d)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ IDN0.3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上SEQ ID N0.3所示的His-Tag的编码序列得到。
[0013]与Cce sia-Ι相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
[0014]本发明所提供的与Cce sia-Ι相关的生物材料，为下述BI)至B16)中的任一种:
[0015]BI)编码Cce sia-Ι的核酸分子； [0016]B2)含有BI)所述核酸分子的表达盒；
[0017]B3)含有BI)所述核酸分子的重组载体；
[0018]B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0019]B5)含有BI)所述核酸分子的重组微生物；
[0020]B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
[0021]B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0022]B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
[0023]B9)含有BI)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
[0024]B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
[0025]Bll)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
[0026]B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
[0027]B13)含有BI)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0028]B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0029]B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0030]B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
[0031]其中，所述核酸分子可以是DNAjB cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以是RNA,如mRNA或hnRNA等。
[0032]上述生物材料中，BI)所述核酸分子具体可为如下I)或2)或3)或4)或5)所示的核酸分子:
[0033]I)编码序列是序列表中SEQ ID N0.1的第106-2217位核苷酸的DNA分子或cDNA分子;
[0034]2)核酸序列是序列表中SEQ ID N0.1的第1-2217位核苷酸的DNA分子；[0035]3)编码序列是序列表中SEQ ID N0.3的第1-2175位核苷酸的DNA分子或cDNA分子;
[0036]4)与I)或2)或3)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码Ccesia-Ι的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0037]5)在严格条件下与I)或2)或3)限定的核苷酸序列杂交，且编码Cce sia-Ι的cDNA分子或基因组DNA分子。
[0038]其中，SEQ ID N0.1由2217个核苷酸组成，SEQ ID N0.1的第1-105位核苷酸编码信号肽，SEQ ID N0.1的第106-2217位核苷酸编码SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。纤维菌(Cellulosimicrobium sp.)21中的Cce sia_l基因的基因组基因编码SEQ ID N0.2的蛋白质。SEQ ID N0.3由2175个核苷酸组成，编码SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列，SEQ ID N0.3的第1-63位核苷酸为pET-28a(+)载体上的序列，SEQ ID N0.3的第13-30位核苷酸编码His-Tag, SEQ ID N0.3的第64-2175位核苷酸编码SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
[0039]本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码Cce sia-Ι的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的Cce sia-Ι的核苷酸序列70%或者更高同一'丨生的核苷酸,只要编码Cce sia-1且具有唾液酸水解酶活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0040]这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高，或85 %或更高，或90 %或更高，或95 %或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相 关序列之间的同一性。
[0041]上述生物材料中，所述严格条件是在2X SSC，0.1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5XSSC，0.1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每次 15min。
[0042]上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0043]上述生物材料中,B2)所述的含有编码Cce sia-Ι的核酸分子的表达盒(Cce sia-1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达Cce sia-Ι的DNA，该DNA不但可包括启动Ccesia-Ι基因转录的启动子，还可包括终止Cce sia_l基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
[0044]可用现有的表达载体构建含有所述Cce sia-Ι基因表达盒的重组载体。
[0045]上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
[0046]上述生物材料中，B5)_B8)所述的微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如大肠杆菌。
[0047]上述生物材料中，B9)_B12)所述的转基因植物细胞系和转基因动物细胞系不包括繁殖材料。所述转基因动物细胞系可为昆虫细胞。
[0048]在本发明的一个实施方式中，Cce sia-Ι的编码基因通过含有Cce sia-Ι的编码基因的表达盒的重组载体导入大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)中。所述重组载体为用SEQ ID N0.1的第106-2217位所示的DNA分子替换pET_28a(+)的Nde I和BamH I识别位点间的片段得到的重组载体pET_28a/Cce sia-lo
[0049]Cce sia-1在作为唾液酸水解酶中的应用也属于本发明的保护范围。[0050]Cce sia-1或上述BI)至B16)任一种与Cce sia-Ι相关的生物材料在制备唾液酸水解酶中的应用，也属于本发明的保护范围。
[0051]扩增编码Cce sia-Ι的核酸分子全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围，如扩增SEQ ID N0.1的第106-2217位核苷酸的引物对。
[0052]实验证明，本发明的Cce sia-Ι蛋白具有明显的高比唾液酸水解酶酶活，比野生型菌株提高了 10-100倍，其比活力达42IU/mg蛋白。可以利用Cce sia_l作为唾液酸水解酶，以神经节苷脂作为底物进行催化反应得到单唾液酸四己糖神经节苷脂(GMl)。利用本发明的Cce sia-Ι制备单唾液酸四己糖神经节苷脂，反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效、专一的选择性，且转化率高，达到95%，生物转化速率快，在2h内即可完成，此法生产GMl无副产物产生，纯化方便。反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，绿色环 保，并实现了 GMl的稳定制备，解决了传统的生物转化与酸水解制备单唾液酸四己糖神经节苷脂的产量低、原料浪费、成本高、质量不稳定等问题。本发明提供的蛋白质在制备单唾液酸四己糖神经节苷脂中具有较强的实用性。
[0053]牛物材料保藏说明
[0054]生物材料的分类命名:纤维菌(Cellulosimicrobium sp.)
[0055]生物材料的菌株编号:21
[0056]生物材料的保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0057]生物材料的保藏单位简称:CGMCC
[0058]生物材料的保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101
[0059]生物材料的保藏日期:2013年05月14日
[0060]生物材料的保藏中心登记入册编号=CGMCC N0.7587
【专利附图】

【附图说明】
[0061]图1为Cce sia-Ι基因的PCR琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道I为DNA marker,泳道2为Cce sia-Ι基因的PCR扩增产物。
[0062]图2为重组载体pET-28a/Cce sia-1的Nde I和BamH I双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道I为pET-28a(+)的Nde I和BamH I双酶切产物，泳道2为DNAmarker，泳道3为pET-28a/Cce sia-1的Nde I和BamH I双酶切产物。
[0063]图3为蛋白诱导表达的聚丙酰胺凝胶电泳图。其中，泳道I为蛋白质分子量marker，泳道2为重组菌pET_28a/E.co I i BL21 (DE3)诱导前总蛋白溶液；泳道3为重组菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)诱导后总蛋白溶液;泳道4为重组菌pET_28a/Cce sia-1/E.coli BL21 (DE3)诱导前总蛋白溶液；泳道5为重组菌pET_28a/Cce sia-l/E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导后总蛋白溶液；泳道6为Ni柱纯化后的Cce sia-Ι蛋白。
[0064]图4为重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι水解猪脑神经节苷脂GLS的反应产物的HPLC-氨基柱分析图谱。其中，曲线a为神经节苷脂标准品图谱；曲线b为神经节苷脂GLS图谱；曲线c为神经节苷脂GLS转化2h后的图谱。
[0065]图5为重组表达载体pET_28a/Cce sia-1的构建示意图。
[0066]图6为重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι的生物学特性。其中，a为最适pH曲线；b为pH稳定性曲线；c为最适温度曲线；d为温度稳定性曲线。
【具体实施方式】
[0067]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0068]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0069]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0070]纤维菌(Cellulosimicrobium sp.) 21由东北师范大学从土壤中筛选得到，于2013年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.7587。
[0071]实施例1、唾液酸水解酶重组载体的构建
[0072]将来自纤维菌(Cellulosimicrobiumsp.) 21 (保藏号为 CGMCC N0.7587)的唾液酸水解酶的多核苷酸(SEQ ID N0.1)通过PCR的方式获得，克隆到表达载体pET_28a中，得到可以表达唾液酸水解酶的重组质粒。具体步骤包括:
[0073]I)纤维菌(Cellulosimicrobium sp.) 21基因组DNA的提取:将纤维菌(Cellulosimicrobium sp.) 21在LB琼脂培养基上，37 V活化12h。活化的菌种接一环至LB液体培养基中，37 °C、200rpm振荡培养12h。6000rpm、4 V离心10min收集菌体，用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，按照说明书提取纤维菌(Cellulosimicrobium sp.) 21 基因组 DNA。
[0074]2) Cce sia-Ι 基因的扩增:
[0075]以纤维菌(Cellulosimicrobium sp.) 21的基因组DNA为模板进行PCR,扩增Ccesia-Ι 基因。扩增引物为:Primer-FS' -GGAATTCCATATGCACCACACGACCCTCGCCCCC-3' ；Primer-R5' -CGGGATCCTCATCAGGACCAGTCGGTCGCCA-3'。扩增条件为:98°C预变性30s ;98°C 10s，65°C40s，72°C lmin，30个循环；72°C延伸lOmin。I %琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，如图1所示。对获得的片段进行测序，测序结果表明获得的片段含有SEQ IDN0.1所示的DNA分子，SEQ ID N0.1所示的DNA分子是天然唾液酸水解酶Cce sia-Ι的编码序列，编码SEQ ID N0.2所示的唾液酸水解酶Ccesia-1，将该天然唾液酸水解酶Cce sia-Ι命名为N Cce sia-lo
[0076]3)重组载体 pET_28a/Cce sia-1 的构建
[0077]如图5所示，用PCR产物纯化试剂盒回收PCR产物。用限制性内切酶Nde I和BamHI (New England Biolabs)酶切回收的 PCR 产物与 pET~28a (+)载体(Novegan)(图 2),酶切结束后用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司，DP209)回收酶切产物。胶回收试剂盒回收的经过相同酶切处理的pET-28a (+)载体与PCR产物在T4DNA连接酶(TAKARA, 2011A)的作用下连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)中，筛选阳性克隆并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，验证序列的正确性。将用SEQID N0.1的所示Cce sia-Ι基因替换pET_28a(+)的Nde I和BamH I位点间的片段(保持pET-28a (+)的其它序列不变)得到的重组载体命名为pET-28a/Ccesia-l。将含有pET_28a/Cce sia-1重组表达载体的阳性克隆命名为重组菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)。重组菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)表达SEQ ID N0.4所示的重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι，将该重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι命名为R Cce sia-l0 SEQ ID N0.4的第22-724位氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。pET-28a/Cce sia-1中含有SEQ ID N0.4第1-2175位核苷酸所示的重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι的编码基因。
[0078]将空载体一pET_28a(+)载体导入Ε.coll BL21 (DE3)得到含有pET_28a(+)的重组菌pET-28a/E.coli BL21 (DE3)，作为空载体对照菌。
[0079]实施例2、重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι的制备
[0080]1、将实施例1 的重组菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)接种于含 50 μ g/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37 °C培养过夜。挑一环接种到60ml含有50 μ g/ml卡那霉素的LB与I %甘油的液体培养基中，37°C、200rpm培养至0D600为2.0 (以含有50 μ g/ml卡那霉素的LB与1%甘油的液体培养基为空白对照)，即为种子液。将种子液按照1:50的比例接种到3L发酵培养基中(发酵培养基的溶剂为水，其溶质及浓度为:1% (质量百分比浓度)胰蛋白胨、0.5% (质量百分比浓度)酵母提取物、1% (质量百分比浓度)NaCl、I %(体积百分比浓度)甘油、0.14% (质量百分比浓度)磷酸二氢钾、0.24% (质量百分比浓度)磷酸氢二钾、0.25% (质量百分比浓度)硫酸镁，ρΗ7.0)，在宝兴FUS-5L发酵罐中进行发酵。培养温度37°C，空气流量3L/min，压力0.05MPa,转速160rpm，氨水调pH，使发酵过程中PH保持在7.2。发酵过程中溶氧上升时开始补料，补料培养基的溶剂为水，其溶质及浓度为:35% (体积百分比浓度)甘油、5% (质量百分比浓度)蛋白胨和2% (质量百分比浓度)酵母抽提粉。待0D600到达18-20(以发酵培养基为空白对照)时降温至25°C，并加
0.4mM IPTG诱导12h。诱导结束后，5000rpm离心10min收集菌体，用PBS洗菌体I次后重新悬浮在IL的PBS缓冲液中，超声破碎细胞，15000g、4°C离心30min，收集上清液，上清液即为重组菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液。同时取诱导前的重组菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21菌体，用PBS洗菌体I次后重新悬浮在IL的PBS缓冲液中，超声破碎细胞，15000g、4°C离心30min，收集上清液，得到重组菌pET_28a/Cce sia-1/
E.coli BL21 (DE3)的诱导前总蛋白溶液。
[0081]2、按照本实施例中步骤I的方法，将实施例1的重组菌pET-28a/Cce sia-1/
E.coli BL21 (DE3)替换为重组菌pET_28a/E.coli BL21 (DE3)，其它步骤不变，分别得到重组菌 pET-28a/E.coli BL21 (DE3)的诱导后总蛋白溶液和重组菌 pET_28a/E.coli BL21 (DE3)的诱导前总蛋白溶液。
[0082]3、重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι的纯化
[0083]在重组菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)的诱导后总蛋白溶液中加入咪唑使其终浓度为10mM，得到总蛋白的咪唑溶液，将总蛋白的咪唑溶液与20ml的Ni Sepharosefastflow凝胶(GE healthcare)在4°C条件下缓慢振荡30min,得到蛋白-凝胶混合物,将蛋白-凝胶混合物装入直径为1.6cm、高IOcm的玻璃层析柱中。然后用2倍层析柱体积的IOmM咪唑/PBS溶液洗脱，再用5倍层析柱体积的250mM的咪唑/PBS溶液洗脱。收集250mM咪唑洗脱的级分，得到含有重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι的酶液，用截留分子量为IOkDa的超滤膜(Millipore公司产品)除去酶液中的咪唑,得到纯化的重组唾液酸水解酶Cce sia-lo
[0084] 4、将重组菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液、重组菌 pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的诱导前总蛋白溶液、重组菌 pET_28a/E.coliBL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液、重组菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的诱导前总蛋白溶液和纯化的重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图3所示，表明只有重组菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液和纯化的重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι和重组菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)的诱导前总蛋白溶液中有75kDa的蛋白(即Cce sia-Ι)条带，重组菌pET_28a/E.coli BL21 (DE3)的诱导后总蛋白溶液和重组菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的诱导前总蛋白溶液均没有该75kDa的蛋白(即 Cce sia-Ι)条带。
[0085]用考马斯亮蓝G-250法测定重组菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)诱导后总蛋白溶液的蛋白含量为39.9mg/ml。
[0086]5、重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι活性的测定
[0087]I)以突光底物 2 ' -(4-Methylumbelliferyl)- a -D-N-acetylneuraminicacid sodium salt hydrate (4_MU_NeuAc)检测重组唾液酸水解酶Cce sia-1和野生型菌株唾液酸水解酶的酶活力。唾液酸水解酶酶活力测定体系为:100 μ I反应体系中，依次加入10μ I适当稀释的重组菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液或重组菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白溶液或野生型菌株纤维菌(Cellulosimicrobium sp.) 21 的总蛋白溶液，10 μ 14_MU_NeuAc (ImM)和 80 μ I Tris-HCl 缓冲液(50mM, ρΗ7.5)，37°C反应10min后，加入100 μ IlM NaOH终止反应。参照4-MU标准曲线计算唾液酸水解酶的酶活。
[0088]唾液酸水解酶的酶活单位(IU)定义为每分钟催化底物生成I μ mol4_MU所需要的酶量为1IU。
[0089]根据检测的结果计算得到的重组菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)的诱导后总蛋白中唾液酸水解酶的酶活为17IU/mg总蛋白，重组菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白并无唾液 酸水解酶酶活。实验结果表明Cce sia-Ι蛋白具有唾液酸水解酶酶活，证明Cce sia-Ι蛋白为唾液酸水解酶。
[0090]重组菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)的诱导后总蛋白中唾液酸水解酶的酶活为17IU/mg总蛋白，野生型菌株纤维菌(Cellulosimicrobium sp.) 21总蛋白中唾液酸水解酶酶活为0.25IU/mg总蛋白，表明重组菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的诱导后总蛋白中唾液酸水解酶的酶活是野生型菌株总蛋白中唾液酸水解酶的酶活的68倍，说明重组菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的诱导后的总蛋白具有更高的唾液酸水解酶酶活。其中，总蛋白含量均用用考马斯亮蓝G-250法测定。
[0091]2)将纯化的重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι按照上本实施例中步骤5中I)的测定酶活的方法测定唾液酸水解酶酶活，结果表明纯化的重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι的唾液酸水解酶比活力为42IU/mg蛋白。
[0092]实施例3、重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι的生物学特性
[0093]1、温度对重组唾液酸水解酶活力的影响
[0094]在20_80°C水浴中，以4-MU-NeuAc为底物，按照实施例2中步骤5中的I)的方法测定纯化的重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι的酶活力。实验结果表明，重组唾液酸水解酶Ccesia-Ι的最适反应温度为45°C (图6中b)。
[0095]2、pH对重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι活力的影响
[0096]将适当稀释的纯化的重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι与底物4-MU_NeuAc在不同PH值的缓冲液中，37 °C条件下反应lOmin，测定重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι在不同pH条件下的酶活力。采用的缓冲液分别为:50mM NaAc-HAc缓冲液，pH2.0-6.0 ；50mMNa2HPO4-NaH2PO4 缓冲液，pH6.0-7.5 ；50mM Tris-HCl 缓冲液，pH7.5-9.0 ；50mM Gly-NaOH 缓冲液，pH9.0-11.0。实验结果表明，重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι的最适pH值为5.0 (图6中a) ο
[0097]3、温度对重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι稳定性的影响
[0098]将纯化的重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι分别在20、30、35、40、45、50、60°C的水浴中保温Ih测定酶活力。以未处理的纯化的重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι作为对照(酶活为100% )。实验结果发现，纯化的重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι分别在20、30、35、40、45、50、60°C保温Ih后，其残余酶活力分别为73%、82%、66%、6.2%,3.5%,4.0%,6.4% (图6中d)。
[0099]4、pH对重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι稳定性的影响
[0100]将10 μ I适当稀释的纯化的重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι酶液与50 μ I浓度为IOOmM的各种不同pH值(4.0-11.0)的缓冲液混合(采用的缓冲液分别为:50mMNaAC-HAC缓冲液，ρΗ4.0-6.0 ；50mM Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液，pH6.0-7.5 ；50mM Tris-HCl 缓冲液，ρΗ7.5-9.0 ；50mM Gly-NaOH 缓冲液，pH9.0-11.0)，分别在 4°C冰箱中保温 Ih 后，取 10 μ I 保温后的酶液测定残余酶活。对照组为10 μ I适当稀释的酶液与50 μ I去离子水混合(酶活为100% )，结果表明重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι在ρΗ4.0-11.0范围内保温Ih后，仍保留60%以上的酶活力(图6中c)。
[0101]5、金属离子或化学试剂对重组唾液酸水解酶Cce Sia-1活性的影响
[0102]将金属离子K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、Cu2+、Hg2+、Ba2+和Mn2+分别与适当稀释的纯化的重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι酶液混合,每种金属离子的终浓度均有两种,分别为5mM和50mM。在4°C保温Ih后，以4-MU-NeuAc作为底物，测定重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι的残余的酶活力。将常用化学试剂DTT、EDTA和SDS分别与适当稀释的纯化的重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι酶液混合，每种化学试剂的终浓度均有两种，分别为5mM和50mM，在4°C保温Ih后，以4-MU-NeuAc作为底物，测定重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι的残余的酶活力。在测定金属离子或化学试剂对重组唾液酸水解酶活性的影响中，均将未处理的纯化的重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι酶液的酶活设定为100%，实验结果见表1。实验结果表明，5mM K+、5mM Hg2+、5mM Ba2+、5mM Mn2+和 5mM DTT对重组唾液酸水解酶Cce sia-1 有激活作用，50mM K+、50mM Ca2+、50mM Mg2+、和50mM Ba2+部分抑制了重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι的酶活，5mM Fe3\50mMFe3\50mM Cu2\50mM Hg2+、5mM SDS和50mM SDS严重抑制了重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι的酶活，其余金属离子Ca2+、Na+、Mg2+、Cu2+和化学试剂EDTA对重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι的酶活抑制程度较轻或几乎无影响。 [0103]表1、不同金属离子和化学试剂对重组唾液酸水解酶Cce sia-Ι酶活的影响
【权利要求】
1.蛋白质，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质: a)氨基酸序列是SEQID N0.2的蛋白质； b)氨基酸序列是SEQID N0.4的蛋白质； c)将SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白质； d)将SEQID N0.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述BI)至B16)中的任一种: BI)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子； B2)含有BI)所述核酸分子的表达盒； B3)含有BI)所述核酸分子的重组载体； B4)含有B2)所述表达盒的重组载体； B5)含有BI)所述核酸分子的重组微生物； B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物； B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物； B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物； B9)含有BI)所述核酸分子的转基因动物细胞系； BlO)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系； Bll)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系； B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系； B13)含有BI)所述核酸分子的转基因植物细胞系； B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系； B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系； B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于:所述核酸分子为如下I)或2)或3)或4)或5)所示的核酸分子:1)编码序列是序列表中SEQID N0.1的第106-2217位核苷酸的DNA分子或cDNA分子； 2)核酸序列是序列表中SEQID N0.1的第1-2217位核苷酸的DNA分子；3)编码序列是序列表中SEQID N0.3的第1-2175位核苷酸的DNA分子或cDNA分子； 4)与I)或2)或3)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子； 5)在严格条件下与I)或2)或3)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.权利要求1所述的蛋白质在作为唾液酸水解酶中的应用。
5.权利要求2所述的生物材料在制备唾液酸水解酶中的应用。
6.扩增编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子片段的引物对。
【文档编号】C12N1/19GK104004728SQ201410254880
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月9日 优先权日:2014年6月9日
【发明者】高娟, 周义发, 胡彦波, 勾东霞, 郭特, 台桂花 申请人:东北师范大学