T细胞受体的制作方法
【专利摘要】一种T细胞受体(TCR)，其具有结合gp100YLEPGPVTA肽-HLA-A2复合物的特性并包含TCRα可变域和/或TCRβ可变域，其特征在于：相对于具有胞外α和β链序列SEQ?ID?No：2和3的TCR，所述TCR在SEQ?ID?No：2所示其α链可变域氨基酸1到109和/或在SEQ?ID?No：3所示其β链可变域氨基酸1到112发生突变，且所述TCR对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合亲和力和/或结合半衰期是参比TCR的至少两倍，所述参比TCR具有胞外α链序列SEQ?ID?No:45和胞外β链序列SEQ?ID?No:46。还描述了此类TCR在过继性治疗中的应用，和此类TCR与治疗剂的融合体。
【专利说明】T细胞受体
[0001]本发明专利申请是国际申请号为PCT/GB2010/001277，国际申请日为2010年7月I日，进入中国国家阶段的申请号为“201080035140.2”，发明名称为“T细胞受体”的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及结合YLEPGPVTA肽(衍生自gplOO蛋白)的T细胞受体(TCR)，所述肽以肽-HLA-A2复合物呈递，相对于天然gplOOTCRa和/或β可变域，所述TCR发生突变并且对所述复合物的结合亲和力和/或结合半衰期至少是参比gplOOTCR的两倍。
[0003]发明背景
[0004]YLEPGPVTA(SEQ ID No:1)肽对应于人糖蛋白100 (gplOO)的氨基酸残基号280-288。GplOO在黑色素瘤癌细胞上广泛而显著地过量表达。例如，一项研究(Trefzer等.，(2006)Melanoma Res.16(2): 137-45)发现28位黑色素瘤患者的192例黑色素瘤转移灶中有82%表达gplOO。几项研究报道了黑色素瘤组织中gplOO表达水平较高(Hofbauer等.,(2004) J Immunother.27 (I): 73-8, Barrow 等.,(2006) Clin Cancer Res.12:764-71)。YLEPGPVTA (SEQ ID No:1)肽由 gp100+/HLA-A2 癌细胞上的 I 类 HLA 分子呈递。(Salgaller等.，(1996)Cancer Res56:4749-4757)。
[0005]因此，YLEPGPVTA HLA-A2复合物提供本发明TCR能靶向的癌症标记物。例如，本发明TCR可用于将细胞毒性剂递送至癌细胞的目的，或可转化入T-细胞，从而使得它们能破坏呈递HLA复合物的肿瘤细胞，以便在称为过继性治疗的治疗过程中给予患者。然而，为前一目的，如果TCR具有 较高的亲和力和/或较慢的解离速率，从而该TCR能长期驻留在所靶向的肿瘤细胞上，则是理想的。为后一目的，如果TCR对肽-HLA复合物相比于具有该复合物特异性的天然TCR具有较高的亲和力和/或较低的解离速率，但不如前一目的的亲和力那样高，则是理想的。亲和力的急剧增加与TCR基因-修饰的CD8T细胞中抗原特异性丧失相关，从而能导致这些TCR-转染⑶8T细胞的非特异性激活，因此中等亲和力TCR是过继性治疗所优选的(参见 Zhao 等.，(2007) J Immunol.179:5845-54 ；Robbins 等.，(2008) JImmunol.180:6116-31 ;还参见公布的W02008/038002)。本发明提供此类TCR。
[0006]采用国际免疫遗传学(MGT) TCR命名法描述TCR，将其与TCR序列的MGT公开数据库相关联。天然α-β异源二聚TCR具有α链和β链。广义上，各链包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区，但该多变区常视作连接区的一部分。各可变区包含嵌合在框架序列中的3个CDR(互补决定区)，其中一个是称为⑶R3的超变区。根据框架、⑶Rl和⑶R2序列以及部分确定的⑶R3序列，α链可变(Va)区可分成几类，β链可变(νβ)区可分成几类。在IMGT命名法中，通过唯一的TRAV编号指代V a类型。因此，“TRAV17”限定了具有独特框架及⑶Rl和⑶R2序列和⑶R3序列的TCRVa区，所述⑶R3序列部分由TCR之间保守性的氨基酸序列确定，但其还包含TCR之间不同的氨基酸序列。“TRBV19”以相同方式限定了具有独特框架及⑶Rl和⑶R2序列的TCRV β区，但仅包含部分确定的⑶R3序列。[0007]通过独特的MGT TRAJ和TRBJ命名法类似地确定TCR的连接区，通过MGT TRAC和TRBC命名法确定恒定区。
[0008]IMGT命名法通过缩写TRBD指代β链多变区，如上所述，连锁的TRBD/TRBJ区常一起视作连接区。
[0009]a i3TCR的α和β链常视作各自具有两个“结构域”，即，可变域和恒定域。可变域由连锁的可变区和连接区构成。因此，在本申请的说明书和权利要求书中，术语“TCRa可变域”指连锁的TRAV和TRAJ区，术语TCR α恒定域指胞外TRAC区或C-末端截短的TRAC序列。类似地，术语“TCR β可变域”指连锁的TRBV和TRBD/TRBJ区，术语TCR β恒定域指胞外TRBC区或C-末端截短的TRBC序列。
[0010]TCR领域的工作人员广为知晓并可得到IMGT命名法确定的独特序列。例如，可在IMGT公开数据库中找到。“《Τ细胞受体手册(Τ cell receptor Factsbook)》，，, (2001),LeFranc 和 LeFranc,学术出版社(Academic Press), ISBN0-12-441352-8 还公开了 IMGT 命名法确定的序列，但由于其公布日期和随后的时间滞后，有时需要参考IMGT数据库验证其中的信息。
[0011]我们证实了天然gplOOTCR克隆具有以下α链和β链V、J和C基因应用:
[0012]α 链-TRAV17/TRAJ29/TRAC (天然 gplOOTCR α 链的胞外序列见 SEQ ID No: 2) ?
[0013]β 链:-TRBV19*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2(天然 gplOOTCRβ 链的胞外序列见SEQ ID No:3)。(注意:TRBV19序列具有3个等位基因变体，在IMGT命名法中分别称为TRBV19*01、*02和*03 ，上述天然gplOOTCR克隆具有*01变异。同样，TRBJ2-7序列具有两个已知的变异，上述TCR克隆中存在的是*01序列。还应注意，缺乏限定符表不相关序列仅已知一种等位基因。)
[0014]术语“野生型TCR”、“天然TCR”、“野生型gplOOTCR”和“天然gplOOTCR”在文本同义使用，指代具有胞外α和β链SEQ ID Νο:2和3的该天然产生的TCR。
【发明内容】
[0015]本发明提供具有结合YLEPGPVTA (SEQ ID No: 1)HLA_A2复合物特性的包含TCRa可变域和/或TCRii可变域的T细胞受体(TCR)，其特征在于所述TCR(i)相对于具有胞外α和β链序列SEQ ID No:2和3的天然gplOOTCR，在其α链可变域(SEQ ID No:2的氨基酸1-109)和/或其β链可变域(SEQ ID No:3的氨基酸1-112)中发生突变；和(ii)对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合亲和力和/或结合半衰期是参比gplOOTCR的至少两倍，所述参比gplOOTCR具有胞外α链序列SEQ ID No:45和胞外β链序列SEQ ID No:46。
[0016]注意，SEQ ID No:45是天然α链胞外序列ID No: 2，除了 C157取代了 T157 (即，TRAC的T48)和K113取代了 N113。类似地，SEQ ID No:46是天然β链胞外序列IDNo:3，除了 C169 取代了 S169(即，TRBC2 的 S57)，A187 取代了 C187，D201 取代了 N201。相比于天然α和β链胞外序列，这些半胱氨酸取代能形成稳定重折叠的可溶性TCR的链间二硫键，即，通过重折叠胞外α和β链形成的TCR。利用稳定的二硫键连接的可溶性TCR作为参比TCR能更方便地评估结合亲和力和结合半衰期。与天然α和β链SEQ ID No:2和3相比，α链SEQ ID No:45和β链SEQ ID No:46中的其它突变是“沉默突变”，意味着相对于天然序列，它们不影响结合亲和力或结合半衰期。因此，如果本发明TCR对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合亲和力和/或结合半衰期是参比gplOOTCR的至少两倍,其还隐含符合上述天然gplOOTCR克隆的那些标准。
[0017]下文中“具有胞外α链序列SEQ ID No:45和胞外β链序列SEQ ID No:46的参比gplOOTCR” 与“参比 TCR” 或“参比 gplOOTCR” 同义。
[0018]可通过任何合适的方法测定结合亲和力(与平衡参数Kd成反比)和结合半衰期(表示为τ72)。应该了解，TCR的亲和力翻倍导致Kd减半。τ72计算为1η2除以解离-速率U。因此，TV2翻倍导致U减半。TCR的Kd和Iitjff值通常检测为TCR的可溶性形式，即，截短以除去疏水性跨膜结构域残基的那些形式。因此，应该了解，给定的TCR符合以下要求，即，其对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物具有结合亲和力和/或结合半衰期，如果可溶形式的该TCR符合该要求的话。优选采用相同的试验方案检测给定TCR的结合亲和力或结合半衰期数次，例如3次或更多次，取结果的平均值。在优选的实施方式中，采用本文实施例3的表面等离振子共振(BIAcore)方法进行这些检测。该方法检测到参比gplOOTCR的Kd约为 19μΜ, kQff 约为 Isl SP，TV2 约为 0.7s)。
[0019]如本文所述，YLEPGPVTA是在HLA A2复合物中呈递的天然gplOO 280_288肽。然而，众所周知，略作修饰形式的该肽(YLEPGPVTV(SEQ ID No:6))显示对HLA-A2的结合增强，从而增加了肽-HLA 复合物的稳定性(Salgaller 等.(1996) Cancer Res56:4749-57)。因此，变体YLEPGPVTV肽-HLA-A2复合物更适于评估能结合YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的潜在TCR的试验工作。此类TCR结合两类肽HLA复合物的Kd和T72和基本上相似。
[0020]本发明TCR对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的亲和力和/或结合半衰期是参比gplOOTCR的至少两倍，同时保留了可接受的YLEPGPVTA-HLA-A2复合物特异性，例如，与参比gplOOTCR相似。通常，相比于参比gplOOTCR，需要作为靶向剂以便将治疗剂，例如细胞毒性或免疫效应剂递送至呈递HLA复合物的细胞的TCR对所述YLEPGPVTA-HLA-A2复合物应具有高很多的亲和力和/或长很多的结合半衰期。如果TCR需要为过继性治疗转染T-细胞，通常要求，例如较低的亲和力和/或较短的结合半衰期(虽然仍分别是参比TCR那些值的至少两倍)。
[0021]例如，本发明的TCR对复合物的Kd可以是≤8μΜ、≤5 μ Μ、≤I μ Μ、≤0.1 μ Μ、(Ο.ΟΙμΜ、≤Ο.ΟΟΙμΜ或≤0.ΟΟΟΙμΜ和/或对复合物的结合半衰期(TV2)可以为^ 1.5s、> 3s、> 10s、> 20s、> 40s、> 60s> ^ 600s 或> 6000s。
[0022]出于本发明的目的，TCR是具有至少一个TCR α和/或TCRP可变域的部分。它们通常同时包含TCRa可变域和TCRii可变域。它们可以是α β异源二聚体或是单链形式。为用作靶向剂以便将治疗剂递送至抗原呈递细胞，α β异源二聚TCR可以是可溶形式(SP，不具有胞质结构域的跨膜区)。对于稳定性而言，此类可溶性TCR优选在各恒定域的残基之间引入二硫键，例如W003/020763中所述。可在一个或多个C末端截短本发明α β异源二聚体中存在的一个或两个恒定域的，例如最多15、或最多10或最多8个或更少的氨基酸。为用于过继性治疗，可将α β异源二聚TCR，例如，作为具有胞质和跨膜结构域的全长链转染。如果需要，各恒定域的残基之间可存在引入的二硫键(参见，例如W02006/000830)。为用作靶向剂将治疗剂递送至抗原呈递细胞，可溶性TCR可以是单链形式。这些可包括V a -L-V β ,V β -L-Va ,Va -Ca -L-V β 或Va-L-V^-CP 类型的 a PTCR 多肽，其中 V a 和Υβ分别是TCRα和β可变区，Ca和Ci3分别是TCRa和β恒定区，L是接头序列。过继性治疗可利用全长TCR序列，其掺入跨膜域同时作为天然二硫键和引入的二硫键形式，或作为单链TCR构建物；或/和与其相似的变化形式。
[0023]无论何种形式，与具有胞外α和β链序列SEQ ID No:2和3的天然gplOO TCR相t匕，本发明TCR在其α可变域(从SEQ ID No:2的SI延伸到Α109)和/或β可变域(从SEQ ID No:3的Dl延伸到Tl 12)发生突变。天然gplOOTCR或参比gplOOTCR可用作模板，其中引入各种突变导致本发明TCR与YLEPGPVTA-HLA-A2复合物之间相互作用的亲和力高和/或解离速率慢。本发明的实施方式包括与从SEQ ID No:2的SI延伸到A109的α链可变域和/或从SEQ ID Νο:3的Dl延伸到Τ112的β链可变域相比，在至少一个互补决定区(CDR)和/或可变域框架区中突变的TCR。
[0024]可采用任何合适的方法进行突变，包括但不限于依据聚合酶链式反应(PCR)的那些、依据限制性酶的克隆或不依赖连接的克隆(LIC)方法。许多标准分子生物学教材详述了这些方法。聚合酶链式反应(PCR)诱变和依据限制性酶的克隆的更多细节可参见Sambrook 和 Russell, (2001)《分子克隆-实验室手册(Molecular Cloning - A LaboratoryManual)》(第3版)CSHL出版社。LIC方法的更多信息可见(Rashtchian, (1995) Curr OpinBiotechnol6(I):30-6)。
[0025]产生本发明的高亲和力gplOOTCR的一种方法是从展示此类TCR的噬菌体颗粒的多样性文库中选择，例如W02004/044004所公开的。
[0026]应该注意，包含与参比gplOOTCR相似的Va和νβ基因使用和由此的可变域氨基酸序列的任何α β TCR均可制备方便的模板TCR。然后可以在编码模板α β TCR的一个或两个可变域的DNA中引入产生本发明的突变型高亲和力TCR所需的改变。本领域技术人员不难了解，可通过许多方法，例如定点诱变来引入必需的突变。 [0027]本发明的优选TCR包括其α可变域与SEQ ID No:2的氨基酸序列1_109具有至少90% (例如，至少93%和优选至少94% )序列相同性(即，不到10% (或不到7%或优选不到6% )的天然V α结构域的残基发生改变)，和/或其β可变域与SEQ ID No:3的氨基酸序列1-112具有至少90% (例如，至少93%和优选至少94% )序列相同性(即，不到10% (或不到7%或优选不到6%)的天然Vi3结构域的残基发生改变)的那些。单个改变包括单个插入、缺失或突变。可通过，例如手工或利用计算机程序进行序列比对来测定序列相同性。
[0028]在一些实施方式中，本发明TCR具有从SEQ ID No:2的SI延伸至Α109的α链可变域，除了 94D、97L、98V或102G位中一个或多个的氨基酸残基发生突变，和/或具有从SEQID No:3 的 Dl 延伸至 T112 的 β 链可变域，除了 27L、28N、29H、30D、31A、50Q、511、52V、53N、54D、61A、94S、951、96g、97G、98P或100E位中一个或多个的氨基酸残基发生突变。例如，本发明的TCR可具有α链可变域氨基酸残基94S、94T、94R、97M、98M、98Q、98G、98S、98A或102D中的一个或多个(利用SEQ ID No:2所示编号)和/或β链可变域氨基酸残基271、28F、29Q、30K、31K、50W、51A、51G、52Q、52Y、52T、53G、53F、54N、54H、61T、94L、95Y、95H、95W、95F、95S、95V、96C、97E、97A、98G、100Q 或 100P 中的一个或多个(利用 SEQ ID No:3 所示编号)。
[0029]本发明的特异性TCR包括含有α链可变域氨基酸序列SEQ ID No:7、8和9之一和/ 或 β 链可变域氨基酸序列 SEQ ID No:10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35之一的那些。因此，含有野生型α链的可变域序列(SEQ ID Νο2的S1-A109)的TCR可与具有SEQ ID No: 10-35之一的β链结合。或者，具有SEQ ID No:7-9之一的α链可与野生型β链的可变域序列(SEQ ID Νο3的Dl-Tl 12)结合。或者具有SEQ ID No:7-9之一的α链可与具有SEQ ID No: 10-35之一的β链结合。
[0030]就靶向应用，主要是它们的高亲和力和缓慢解离速率(即，长半衰期)而言，目前优选的可溶性TCR是包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID No: 8 (X = S或A或G)和β链可变域氨基酸序列SEQ ID No:27的那些。此类优选的TCR宜是α β异源二聚体形式，即，包含TRAC和TRBC结构域。如本文所述，可在一个C-末端或两个C-末端截短此类TRAC和TRBC结构域。例如，可通过删除最多15，或最多10或最多8或更少的氨基酸来截短参比TCRa链的恒定域的C-末端。
[0031]上述TCR的表型沉默变体也构成本发明的一部分。术语“表型沉默变体”所指TCR的序列与本发明TCR相同，除了在恒定和/或可变域中掺入改变，但所述改变不会改变与肽-HLA复合物相互作用的亲和力和/或解离速率。此类变体的一个例子是本发明TCR，其中采用SEQ ID NO:2的编号，该TCRa恒定域含有取代130丝氨酸(S)氨基酸残基的苯丙氨酸(F)氨基酸残基。 [0032]如上所述，本发明的α β异源二聚TCR可在它们的恒定域之间引入二硫键。该类型的优选TCR包括具有TRAC恒定域序列和TRBCl或TRBC2恒定域序列的那些，除了 TRAC的Thr48和TRBCl或TRBC2的Ser57被半胱氨酸残基替代，所述半胱氨酸在TCR的TRAC恒定域序列和TRBCl或TRBC2恒定域序列之间形成二硫键。
[0033]含或不含上文所述的引入的链间键，本发明的α β异源二聚TCR均可具有TRAC恒定域序列和TRBCl或TRBC2恒定域序列，TCR的TRAC恒定域序列和TRBCl或TRBC2恒定域序列可通过TRAC的外显子2的Cys4和TRBCl或TRBC2的外显子2的Cys2之间的天然二硫键相连。
[0034]如本文所述，本发明的可溶性TCR可与可检测标记物(为诊断目的，其中所述TCR用于检测呈递YLEPGPVTA HLA-A2复合物的细胞的存在)；治疗剂；PK修饰部分(例如，通过PEG化)；或以上的组合结合(共价或其它方式)。
[0035]用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于:荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI或CT造影剂、或产生可检测产物的酶。
[0036]可与本发明TCR结合的治疗剂包括但不限于:放射性化合物、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺钼)、毒素(例如，假单胞菌外毒素，如ΡΕ38、卡西霉素(calcimycin)或白喉毒素)、免疫调节抗体片段(例如抗-CD3或抗-CD16)、或免疫调节细胞因子(例如，IL-2)。为确保在所需位置施加毒性效应，毒素可以在连接于TCR的脂质体内，从而使该化合物缓慢释放，或者通过不稳定的接头将毒素偶联于TCR。如此可防止在体内转运期间的破坏作用，确保TCR与相关抗原呈递细胞结合后毒素具有最大作用。
[0037]其它合适的治疗剂包括:
[0038]?小分子细胞毒性剂，即，能杀伤哺乳动物细胞、分子量低于700道尔顿的化合物。此类化合物还能含有能具有细胞毒性效应的毒性金属。此外，应该了解，这些小分子细胞毒性剂还包含前药，即，在生理条件下分解或转化以释放细胞毒性剂的化合物。此类试剂的例子包括顺钼、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡奇霉素、多西他赛、依托泊式、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、卟吩姆钠(sorfimer sodium)光敏素
I1、替莫唑胺、拓扑替康、葡糖醛酸三甲曲沙、耳他汀(auristatin)E、长春新碱和阿霉素；
[0039]?肽细胞毒素，即，能杀伤哺乳动物细胞的蛋白质或其片段。例如，蓖麻毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌细菌内毒素A、DNA酶和RNA酶；
[0040]?放射性核素，即，元素的不稳定同位素，其在衰减的同时发出一种或多种的α或β粒子，或Y射线。例如，碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213;可利用螯合剂促进这些放射性核素与高亲和力TCR或它们的多聚体的结合；
[0041]?免疫刺激剂，即，刺激免疫应答的免疫效应分子。例如，细胞因子，如IL-2和IFN-Y ；
[0042]?超抗原及其突变体；
[0043].TCR-HLA融合体，其中所述HLA决定免疫原性抗原；
[0044]?趋化因子，例如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白，等；
[0045]?抗体或其片段，包括抗-T细胞或NK-细胞决定抗体(例如，抗-⑶3或抗-⑶28或抗-CD16)；
[0046]?补体激活物；
[0047]?异种蛋白结构域、同种异体蛋白质结构域、病毒/细菌蛋白结构域、病毒/细菌肽。
[0048]一个优选的实施方式是与抗-CD3抗体或所述抗-CD3抗体的功能片段或变体结合的本发明TCR。适用于本文所述组合物和方法的抗体片段和变体/类似物包括但不限于:小抗体(minibody)、Fab片段、F(ab’)2片段、dsFv和scFv片段、或其它抗体支架蛋白，例如Nanobodies?(由比利时阿比林公司(Ablynx)投入市场的这些构建物包含源自骑科动物(例如骆驼或美洲驼)抗体的合成单一免疫球蛋白可变重链结构域)、结构域抗体(由比利时多曼提斯公司(Domantis)投入市场,包含亲和力成熟的单一免疫球蛋白可变重链结构域或免疫球蛋白可变轻链结构域)、UniBodies (由金迈公司(Genmab)投入市场,UniBodies是修饰的全人IgG4抗体，其中删除了该抗体的绞链区)、三功能抗体(具有两种不同抗原的结合位点的单克隆抗体)、Affibodies (由昂飞公司(Affibody)投入市场，Affibodies依据58-氨基酸残基的蛋白质结构域，其为一个三螺旋束结构域，源自葡萄球菌A蛋白的IgG-结合域之一)、抗脂质运载蛋白(从人脂质运载蛋白合成的抗体模拟物，其还能构建成双靶向蛋白质，即，所谓的双脂质运载蛋白(Duocalins))或DARPins (设计的锚蛋白重复蛋白)(其是依据重复蛋白，例如锚蛋白或富含亮氨酸重复蛋白的抗体模拟物的另一例子，它们是普遍存在的结合分子)。
[0049]更具体的本发明TCR-抗⑶3融合体包括选自下组的TCRa链氨基酸序列:
[0050]⑴TCR α链序列SEQ ID No:45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No:8替代，其中I位的氨基酸是S ；
[0051](ii)TCRa链序列SEQ ID No:45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No:8替代，其中I位的氨基酸是A ;
[0052](iii)TCRa链序列SEQ IDNo:45，其中氨基酸1-109被序列SEQ IDNo:8替代，其中I位的氨基酸是G ;[0053](iv) TCRa链序列SEQ ID No:45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No:8替代，其中I位的氨基酸是S，依据SEQ ID No:45的编号，该a链的C-末端从F196到S203截短8个氨基酸(包括端点)；
[0054](V) TCR a链序列SEQ ID No:45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No:8替代，其中I位的氨基酸是A，依据SEQ ID No:45的编号，该a链的C-末端从F196到S203截短8个氨基酸(包括端点)；
[0055](vi)TCRa链序列SEQ ID No:45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No:8替代，其中I位的氨基酸是G，依据SEQ ID No:45的编号，该a链的C-末端从F196到S203截短8个氨基酸(包括端点)；
[0056]和选自下组的TCR β链-抗-⑶3氨基酸序列:
[0057](vii)TCRP链-抗-CD3序列SEQ IDNo:36，其中I和2位的氨基酸分别是D和I ;
[0058](viii)TCRP链-抗-CD3序列SEQ ID No:36，其中I和2位的氨基酸分别是A和I ;
[0059](ix) TCR β链-抗-CD3序列SEQ ID No:36，其中I和2位的氨基酸分别是A和Q ;
[0060](X)TCRP链-抗-CD3序列SEQ ID No:36，其中I和2位的氨基酸分别是D和I，108-131 位的氨基酸被 RTSGP⑶GGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG (SEQ ID No: 44)替代，254-258 位的氨基酸被 GGEGGGSEGGGS (SEQ ID No: 47)替代； [0061](xi)TCRP链-抗-CD3序列SEQ IDNo:36，其中I和2位的氨基酸分别是D和I，257位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；
[0062](xii)TCRP链-抗-CD3序列SEQ IDNo:36，其中I和2位的氨基酸分别是D和I，256位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；
[0063](xiii)TCRP链-抗-CD3序列SEQ ID No:36，其中I和2位的氨基酸分别是D和I，255位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ;
[0064](xiv)具有序列SEQ ID No:36的TCR β链-抗-⑶3，其中I和2位的氨基酸分别是A和Q，257位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；
[0065](XV)具有序列SEQ ID No:36的TCR β链-抗-CD3，其中I和2位的氨基酸分别是A和Q，256位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；
[0066](xvi)具有序列SEQ ID No:36的TCR β链-抗-⑶3，其中I和2位的氨基酸分别是A和Q，255位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；
[0067](xvii)具有序列SEQ IDNo:36的TCR^链-抗-⑶3，其中I和2位的氨基酸分别是A和I，257位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ;
[0068](xviii)具有序列SEQ ID No:36的TCR^链-抗-CD3，其中I和2位的氨基酸分别是A和I，256位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；
[0069](xix)具有序列SEQ ID No:36的TCR β链-抗-⑶3，其中I和2位的氨基酸分别是A和I，255位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ；
[0070]此类TCR-抗⑶3融合体的例子是
[0071]如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(vii)；[0072]如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(X);
[0073]如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(ix);
[0074]如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(V)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(viii)；
[0075]如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(vii)；
[0076]如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xi)；
[0077]如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xii);
[0078]如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xiii)；
[0079]如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xiv)；
[0080]如权利要求 18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(XV)；
[0081]如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xvi)；
[0082]如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(V)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xvii)；
[0083]如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(V)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xviii)；
[0084]如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(V)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xix)；
[0085]如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xi)；
[0086]如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xii);和
[0087]如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xiii)。
[0088]由于本发明的α β异源二聚TCR可用于过继性治疗，本发明还包括呈递本发明TCR的分离细胞，特别是T-细胞。有许多方法适合于用编码本发明的高亲和力TCR的DNA或 RNA 转染 T 细胞。(参见，例如 Robbins 等.，(2008) J.1mmunol.180:6116-6131))。表达本发明的高亲和力TCR的T细胞适用于gp100+HLA-A2+癌症的基于过继性治疗的治疗。本领域技术人员已知进行过继性治疗的许多合适方法。(参见,例如Rosenberg等.，(2008)Nat Rev Cancer8(4):299-308)。
[0089]为某些目的，本发明的TCR可多聚成包含数个TCR的复合物以形成多价TCR复合物。有许多人蛋白含有可用于产生多价TCR复合物的多聚结构域。例如，利用p53的四聚结构域产生scFv抗体片段的四聚体，与单体scFc片段相比，其显示血清持久性增加和解离速率显著降低。(Willuda 等.(2001) J.Biol.Chem.276 (17) 14385-14392)。血红蛋白也具有可能用于此类应用的四聚结构域。与非多聚野生型或本发明的T细胞受体异源二聚体相t匕，本发明的多价TCR复合物对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合能力可增强。因此，本发明TCR的多价复合物也属于本发明。本发明的此类多价TCR复合物尤其可用于体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，也可用作产生具有此类应用的其它多价TCR复合物的中间体。
[0090]由转染的T细胞表达时，打算用于过继性治疗的本发明TCR被糖基化。本领域熟知，可通过转染基因的突变来修饰转染TCR的糖基化模式。
[0091]为给予患者，本发明的TCR和本发明TCR转染的T细胞可与药学上可接受的载体一起在药物组合物中提供。本发明的治疗性或成像TCR、多价TCR复合物和细胞通常作为无菌药物组合物的一部分提供，所述组合物通常包含药学上可接受的载体。该药物组合物可以是任何合适的形式(取决于给予患者的所需方法)。其可采用单位剂型提供，通常在密封的容器中提供，可作为试剂盒的一部分提供。此类试剂盒通常(但非必需)包括使用说明书。其可包括多个所述单位剂型。
[0092]可改进药物组合物以便通过任何合适的途径给予，优选胃肠外(包括皮下、肌肉内，或优选静脉内)途径 。可通过药学领域已知的任何方法制备此类组合物，例如在无菌条件下将活性成分与一种或多种载体或赋形剂混合。
[0093]根据所治疗的疾病或病症、所治疗个体的年龄和情况等，本发明物质的剂量可在很宽范围内变化，最终由医师决定所用的合适剂量。
实施例
[0094]以下实施例进一步描述了本发明，其中参考了以下附图。
[0095]图1A和2A分别显示具有TRAV17/TRAJ29/TRAC基因使用的天然gplOOTCR α链的胞外氨基酸序列，除了 Κ113取代Ν113(即，TRAC的Ν4)，和具有TRBV19*01/TRBDI/TRBJ2-7*01/TRBC2基因使用的天然gplOOTCRβ链的胞外氨基酸序列(分别是SEQ ID No:2和3)。其中，图1A所示为野生型gplOO-特异性TCRTRAV17/TRAJ29/TRACa链氨基酸序列，但含Kl 13取代NI 13 (即，TRAC恒定区的N4) (SEQ ID No: 2);图2A所示为野生型gplOO-特异性 TCR TRBV19*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2 β 链氨基酸序列(SEQ ID No: 3) ?
[0096]图1B和2Β分别显示编码可溶性野生型gplOOTCRa和β链(也称为参比gplOOTCR α和β链)的DNA序列。这些序列包含额外的半胱氨酸残基以形成非天然二硫键。阴影部分标出了编码额外的半胱氨酸残基的突变密码子。下划线标出NdeI和HindIII限制性酶识别序列。其中，图1B所示为参比TCRa链(参见图1C)DNA序列(SEQ ID No:4)(引入的半胱氨酸以阴影显示)；图28所示为gplOO-特异性TCRii链野生型DNA序列(SEQID No:5)(引入的半胱氨酸以阴影显示)。
[0097]图1C和2C分别显示分别从图1B和2B所示DNA序列产生的可溶性野生型gplOOTCR或参比gp TCRa和β链胞外氨基酸序列(分别是SEQ ID No:45和46)，但不含为在细菌中有效表达而插入的引入前导甲硫氨酸。引入的半胱氨酸以黑体字和下划线显示。其中，图1C所示为参比TCRa链-野生型gplOO-特异性TCR TRAV17/TRAJ29/TRAC a链氨基酸序列，但含半胱氨酸(黑体字和下划线显示)取代T157(即，TRAC恒定区的Τ48)(SEQ ID No:45)和Κ113取代Ν113 ;图2C所示为参比TCRP链——野生型gplOO-特异性TCR TRBV19*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2^链氨基酸序列，但含半胱氨酸(黑体字和下划线显示)取代S169(即，TRBC2恒定区的S57)和A187取代C187和D201取代N201 (SEQ IDNo:46)。
[0098]图3A-C显示高亲和力gplOOTCR变体的a链可变域氨基酸序列。突变的残基以黑体字和下划线显示。其中，图3A所示为高亲和力gplOO-特异性TCRa链可变域氨基酸序列(SEQ ID No:7);图38所示为高亲和力8?100-特异性1'0^链可变域氨基酸序列(SEQID No:8);图3(:随时为高亲和力8?100-特异性1'0^链可变域氨基酸序列(SEQ ID No:9)。
[0099]图4A-Z显示高亲和力gplOOTCR变体的β链可变域氨基酸序列。突变的残基以黑体字和下划线显示。其中，图4Α所示为高亲和力gplOO-特异性TCRii链可变域氨基酸序列(SEQ ID No: 10);图4B所示为高亲和力gplOO-特异性TCRP链可变域氨基酸序列(SEQ IDNo: 11);图4(:所示为高亲和力gplOO-特异性TCRii链可变域氨基酸序列(SEQ ID No: 12)；图4D所示为高亲和力gplOO-特异性TCRii链可变域氨基酸序列(SEQ ID No: 13);图4E所示为高亲和力gplOO-特异性TCRii链可变域氨基酸序列(SEQIDNo:14);图4?所示为高亲和力gplOO-特异性TCRii链可变域氨基酸序列(SEQ ID No: 15);图4G所示为高亲和力gplOO特异性TCRii链可变域氨基酸序列(SEQ ID No: 16);图4H所示为高亲和力gplOO-特异性TCR^链可变域氨基酸序列(SEQ ID No: 17);图41所示为高亲和力gplOO-特异性TCRi^链可变域氨基酸序列(SEQ ID No: 18);图4J所示为高亲和力gplOO特异性TCRP链可变域氨基酸序列(SEQ ID No: 19);图41(所示为高亲和力gplOO-特异性TCRP链可变域氨基酸序列(SEQ ID No:20);图4L所示为高亲和力gplOO-特异性TCRP链可变域氨基酸序列(SEQ IDNo: 21);图411所示为高 亲和力gplOO-特异性TCRii链可变域氨基酸序列(SEQ ID No: 22)；图4N所示为高亲和力gplOO-特异性TCR β链可变域氨基酸序列(SEQ ID No: 23);图40所示为高亲和力gplOO-特异性TCRii链可变域氨基酸序列(SEQ ID No:24);图4P所示为高亲和力gplOO-特异性TCRii链可变域氨基酸序列(SEQ ID No:25);图4Q所示为高亲和力100特异性TCRii链可变域氨基酸序列(SEQ ID N26);图4R所示为高亲和力gplOO-特异性TCR^链可变域氨基酸序列(SEQ ID No: 27);图4S所示为高亲和力gplOO-特异性TCRβ链可变域氨基酸序列(SEQIDNo:28);图41'所示为高亲和力gplOO-特异性TCRP链可变域氨基酸序列(SEQ ID No: 29);图仙所示为高亲和力gplOO特异性TCRP链可变域氨基酸序列(SEQ IDNo: 30);图4V所示为高亲和力gplOO-特异性TCR β链可变域氨基酸序列(SEQ IDNo: 31);图41所示为高亲和力gplOO-特异性TCRii链可变域氨基酸序列(SEQ ID No: 32)；图4X所示为高亲和力gplOO-特异性TCR β链可变域氨基酸序列(SEQ ID No: 33);图4Υ所示为高亲和力gplOO-特异性TCRii链可变域氨基酸序列(SEQ ID No:34);图4Z所示为高亲和力gplOO-特异性TCRii链可变域氨基酸序列(SEQ ID No:35)。
[0100]图5A显示借助高亲和力gplOOTCR作T2细胞体外染色的流式细胞术数据，该细胞用YLEPGPVTV (SEQ ID NO: 6)变体gplOO肽脉冲。即，图5A所示为通过流式细胞术评估利用高亲和力的体外细胞染色gplOOTCR。
[0101]图5B显示借助高亲和力gplOOTCR作T2细胞染色的显微图像，该细胞用YLEPGPVTV(SEQ ID NO:6)变体gplOO肽脉冲。即，图5B所示为通过显微术评估利用高亲和力gplOOTCR的体外细胞染色。
[0102]图6显示通过接头GGGGS SEQ ID No:48(下划线显示)在gplOOTCR β链的N-末端融合的抗-⑶3scFv抗体片段(黑体字)的氨基酸序列。所述gplOOTCRii链含有可变区SEQ ID No:27o 即，图6所示为SEQ ID Νο36:-通过接头，即GGGGS (下划线显示)融合于gplOOTCRβ链的N-末端的抗-⑶3scFv抗体片段(黑体字)的氨基酸序列。所述gplOOTCRβ 链含有可变区 SEQ ID No:27。
[0103]图7是显示在非放射性细胞毒性试验中，抗-⑶3scFV-gp100高亲和力TCR使得T细胞重定向以杀伤黑色素瘤细胞系Mel526的应答曲线。即，图7所示为测试抗-⑶3sCFv-gp100高亲和力TCR使得T细胞(PBMC群内)重定向为杀伤黑色素瘤细胞系Mel526 (非放射性细胞毒性试验)。
[0104]图8A显示用于转导T-细胞的野生型gplOO-特异性TCR基因(含猪捷申病毒(Teschovirus)-1 2A序列的野生型(WT) α链-2A-WT β链构建物，黑体字和下划线显示)的DNA序列。即，图8Α所示为含猪捷申病毒-1 2Α序列(黑体字和下划线显示)的野生型gplOO 特异性 TCR WT α 链-2A-WT β 链的 DNA 序列(SEQ ID No: 37)。
[0105]图8Β显示从图8Α所示DNA序列产生的用于T-细胞转导的野生型gplOO-特异性TCR的氨基酸序列。猪捷申病毒-12A序列以黑体字和下划线显示。即，图SB所示为含猪捷申病毒-12A序列(黑体字和下划线显示)的野生型gp 100-特异性TCR WTa链-2A-WT β链氨基酸序列(SEQ ID No:38)。
[0106]图9a和9b显示在ELISP0T试验中，gplOOTCR-转导的T-细胞对一系列靶细胞起反应而释放IFN-Y。这些附图显示与用天然gplOOTCR转导的T细胞相比，用高亲和力gplOOTCR转导的T细胞的特异性激活增加。其中，图9所示为与野生型亲和力TCR-转导的T细胞相比，gplOO亲和力提高的TCR转导的T细胞对肿瘤细胞系起反应的激活增加。
[0107]图10显示TCR-pMHC亲和力增加的不同gplOOTCR-抗_CD3scFv融合体激活的⑶8+T细胞释放IFN- Y。即，图10所示为具有不同TCR-pMHC亲和力的gplOOTCR-抗-CD3scFv融合体所致的CD8+T细胞激活。
[0108]图11显示不同gplOOTCR-抗-⑶3scFv融合体激活的⑶8+T细胞释放IFN-Y。即，图11所示为检验高亲和力gplOOTCR-抗-CD3融合体的效力的T-细胞重定向试验。
[0109]图12显示体内模型中平均肿瘤体积的进展情况，该模型利用含人黑色素瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠，并检验gplOO高亲和力TCR-抗-CD3SCFV融合蛋白的抗肿瘤效力。即，图12所示为Mel526效力模型。
[0110]实施例1
[0111]将参比gplOOTCRa和β链可变区序列克隆入基于pGMT7的表达质粒
[0112]从gplOOT细胞克隆分离的总cDNA中PCR扩增参比gplOOTCR可变α和TCR可变β结构域。在α链的 情况中，利用α链可变区序列特异性寡核苷酸Al (ggaattccatatgagtcaacaaggagaagaagatcc SEQ ID No: 39)和 α 链恒定区序列特异性寡核苷酸 Α2 (ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg SEQ ID No:40)扩增α链可变区，前者编码限制性位点Ndel，为在细菌中有效启动表达而引入的甲硫氨酸，后者编码限制性位点Sail。在β链的情况中，利用β链可变区序列特异性寡核苷酸BI (tctctcatatggatggtggaattactcaatccccaa SEQ ID No:41)和 β 链恒定区序列特异性寡核苷酸 Β2 (tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc SEQ ID No:42)扩增β链可变区，前者编码限制性位点Ndel，为在细菌中有效启动表达而引入的甲硫氨酸，后者编码限制性位点Agel。
[0113]通过《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(第三版，Sambrook和Russell)中描述的标准方法将α和β可变区克隆入含有Ca或的基于PGMT7的表达质粒。利用应用生物系统公司(AppliedBiosystems)的3730x1 DNA分析仪测序质粒。
[0114]将NdeI和SalI切割的编码TCRa链的DNA序列连接入用NdeI和XhoI切割的PGMT7+C α载体。将NdeI和AgeI切割的编码TCRP链的DNA序列连接入也用NdeI和AgeI切割的不同pGMT7+Ci3载体。
[0115]连接
[0116]将连接的质粒转化入感受态大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株XLl-蓝色细胞，接种在含有100μ g/ml氨苄西林的LB/琼脂板上。37°C温育过夜后，挑取单个菌落，37°C，在含有100 μ g/ml氨苄西林的IOmL LB中振荡生长过夜。利用恰根公司的迷你制备试剂盒(Miniprep kit, Qiagen)纯化克隆的质粒,利用百灵技术公司(LarkTechnologies)的自动DNA测序仪测序插入物。
[0117]图1C和2C分别显示分别从图1B和2B所示DNA序列产生的可溶性二硫键-连接的参比gplOOTCRa和β链胞外氨基酸序列，但不含为在细菌中有效表达而插入的引入前导甲硫氨酸(分别为SEQ ID NO:45和46)。应注意，半胱氨酸被取代入α和β链的恒定区以在重折叠时提供 人工链间二硫键，从而形成异源二聚TCR。引入的半胱氨酸以阴影部分显示。图1B和2Β所示DNA序列中的限制性酶识别序列以下划线显示。
[0118]实施例2
[0119]可溶性参比gplOOTCR的表达、重折叠和纯化
[0120]将实施例1中分别制备的含有TCR a -链和β -链的表达质粒各自转化入大肠杆菌菌株Rosetta (DE3) pLysS, 37°C下将单氨节西林耐受性菌落在TYP (氨节西林100 μ g/ml)培养基中培养至0D_约为0.6-0.8，然后用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达。诱导后3小时用Beckman J-6B以4000rpm离心30分钟收获细胞。在有MgCljP DNA酶I存在下，用25ml BugBuster (诺瓦金公司(NovaGen))裂解细胞沉淀物。用Beckman J2-21离心机以13000rpm离心30分钟以回收包涵体沉淀物。然后进行三次洗涤剂洗涤以除去细胞碎片和膜组分。每次先将包涵体沉淀物在曲通(Triton)缓冲液(50mM Tris-HCI pH8.0, 0.5%曲通-XIOO, 200mMNaCI, IOmM NaEDTA)中匀浆再以4，OOOrpm离心15分钟使之沉淀。然后利用以下缓冲液作类似的洗涤以除去洗涤剂和盐:50mM Tris-HCl, ImM NaEDTA, pH8.0。最终，将包涵体分成30mg等份试样，_70°C冷冻。用6M胍-HCl溶解包涵体蛋白产物对其定量，利用日立(Hitachi)U-2001分光光度计检测0D。然后利用消光系数计算蛋白质浓度。
[0121]从冷冻储备物中解冻约30mg TCRP链和60mg TCRa链溶解包涵体，用15ml胍溶液(6M 胍-盐酸，50mM Tris HCl pH8.1, IOOmM NaCl, IOmM EDTA, IOmM DTT)稀释以确保完全的链变性。然后将含有完全还原和变性的TCR链的胍溶液注射入以下的I升重折叠缓冲液:IOOmM Tris pH8.1, 400mM L-精氨酸，2mM EDTA, 5M脲。加入氧化还原对(盐酸半胱胺和二盐酸胱胺)至终浓度分别为6.6mM和3.7mM,约5分钟后加入变性的TCR链。溶液静置约I小时。5°C ±3°C下，用透析管状纤维素膜(西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich);产品编号D9402)和IOL H2O对重折叠的TCR透析18-20小时。然后，将透析缓冲液更换为新鲜的IOmM Tris pH8.1 (IOL)两次，在5°C ±3°C下继续透析约8小时。
[0122]将透析的重折叠物加载于P0R0S50HQ阴离子交换柱，利用Akta纯化仪(GE保健公司(GEHealthcare))用IOmM Tris pH8.1配制的0-500mM NaCl梯度洗脱结合的蛋白质6个柱体积以上，从而将可溶性TCR与错误折叠的、降解产物和杂质分开。将蛋白酶抑制剂的混合物(卡尔生物化学公司(Calbiochem))加入峰组分。将诸组分保存于4°C，通过考马斯-染色的SDS-PAGE分析，然后合并、浓缩。最后，利用在PBS缓冲液(西格玛公司(Sigma))中预平衡的GE保健公司的Superdex75HR凝胶过滤柱纯化并表征可溶性TCR。合并、浓缩在相对分子量约为50kDa洗脱的峰，然后通过BIAcore表面等离振子共振分析进行表征。
[0123]实施例3
[0124]结合表征 [0125]BIAcore 分析
[0126]可利用表面等离振子共振生物传感器(BIACOre3000TM)分析可溶性TCR与其肽-MHC配体的结合。产生能固定于链霉亲和素包被结合表面(传感器芯片)的可溶性生物素化肽_HLA( “pHLA”)复合物有助于该分析。所述传感器芯片包含能同时检测T细胞受体与4个不同pHLA复合物结合的4个独立流动小室。手工注射pHLA复合物易于操控固定的I类分子的精确水平。
[0127]体外重折叠含有亚单位蛋白组分和合成肽的细菌表达包涵体中生物素化I类HLA-A*02分子，然后纯化并在体外进行酶促生物素化(O’ Callaghan等(1999)Anal.Biochem.266:9-15)。表达的HLA_A*02_重链具有C-末端生物素化标签，其在合适的构建物替代了该蛋白质的跨膜区和胞质结构域。获得的包涵体表达水平约75mg/升细菌培养物。还在大肠杆菌中从合适构建物表达了作为包涵体的HLA轻链或β 2-微球蛋白(β2πι)，其水平约为500mg/升细菌培养物。
[0128]裂解大肠杆菌细胞，处理包涵体至约80%纯度。将合成肽(gplOOYLEPGPVTA)溶解于 DMSO 至 4mg/ml 的终浓度。用 6M 盐酸胍、50mM Tris ρΗ8.1、IOOmM NaCl、IOmM DTT、IOmMEDTA使b2m和重链的包涵体各自变性。制备含有0.4M L-精氨酸、IOOmM Tris pH8.1,3.7mM二盐酸胱胺、6.6mM盐酸半胱胺的重折叠缓冲液并冷却至<5 V。优选先将肽加入重折叠缓冲液，然后加入变性的b2m，再加入变性的重链。将gplOOYLEPGPVTA肽以4毫克/升(终浓度)加入重折叠缓冲液。然后依次加入30毫克/升的b2m和30毫克/升的重链(终浓度)。使重折叠在4°C进行至少I小时至完成。
[0129]用10体积的IOmM Tris pH8.1作透析来更换缓冲液。必需更换缓冲液两次来充分降低溶液的离子强度。然后经1.5μπι乙酸纤维素滤膜过滤蛋白质溶液，加载到P0R0S50HQ阴离子交换柱上(8ml床体积)。利用Akta纯化仪(GE保健公司的)，用IOmM Tris pH8.1配制的0-500mM NaCl线性梯度液洗脱蛋白。HLA_A*02_肽复合物约在250mM NaCl处洗脱，收集诸峰组分，加入蛋白酶抑制剂混合物(卡尔生物化学公司)，各组分置于冰上冷却。
[0130]用相同缓冲液平衡的GE保健公司的快速脱盐柱将生物素化标记的pHLA分子的缓冲液更换为IOmM Tris pH8.1, 5mM NaCl。洗脱后立即将含有蛋白质的组分置于冰上冷却，加入蛋白酶抑制剂混合物(卡尔生物化学公司)。然后加入生物素化试剂=ImM生物素、5mMATP (缓冲至 pH8)、7.5mM MgCl2 和 5 μ g/ml BirA 酶(按照 O，Callaghan 等，(1999)，Anal.Biochem.266:9-15纯化)。然后室温培育混合物过夜。
[0131]采用凝胶过滤层析纯化生物素化的pHLA_A*02分子。利用Akta纯化仪(GE保健公司)，用过滤的PBS预平衡GE保健公司Superdex75HR10/30柱，加载Iml生物素化反应混合物，用PBS以0.5毫升/分钟过柱。生物素化pHLA-A*02分子在约15ml时作为单峰洗脱。合并含有蛋白质的组分，置在冰上冷却，加入蛋白酶抑制剂混合物。采用考马斯结合试验(PB公司(PerBio))测定蛋白质浓度，将生物素化pHLA_A*02分子的等份试样冷冻保存在-20。。。
[0132]此类固定的复合物能结合T-细胞受体和辅助受体⑶8 α α，可将二者注入可溶相。如果采用可溶相或固定相的TCR，观察到可溶性TCR的pHLA结合特性在质量和数量上相似。这是对可溶性物质的部分活性的重要控制，也提示生物素化的PHLA复合物与非生物素化复合物的生物活性相同。
[0133]利用BIACOre3000?表面等离振子共振(SPR)生物传感器检测小型流动小室内传感器表面附近以响应单位(RU)表示的折射率变化，该原理可用于检测受体配体相互作用和分析它们的亲和力以及动力学参数。在25°C下进行BIAcore实验，利用PBS缓冲液(西格玛公司，PH7.1-7.5)作为运行缓冲液和制备蛋白质样品的稀释液。通过标准胺偶联方法将链霉亲和素固定于流动小室。通过生物素标签固定PHLA复合物。然后使可溶性TCR以恒定流速通过不同流动小室的表面，检测该情况下的SPR响应以进行试验。
[0134]平衡结合常数
[0135]采用以上B IAcore分析方法测定平衡结合常数。制备参比gplOOTCR的二硫键连接可溶性异源二聚体形式的连续稀释液，以5微升/分钟的恒定流速注射到两个不同的流动小室上；一个包被有约300RU的特异性YLEPGPVTA HLA-A2复合物(或变体肽YLEPGPVTVHLA-A2复合物)，第二个包被有约300RU非特异性HLA-A2 - WTl野生型肽(RMFPNAPYL)复合物。利用对照细胞的检测值标准化各浓度的响应。绘制标准化的数据响应与TCR样品浓度的图，根据非线性曲线拟合模型拟合以计算平衡结合常数，KD。(Price和Dwek，《生物化学家的物理化学原理和问题(Principles and Problems in Physical Chemistryfor Biochemists)))(第二版)，1979,克拉伦登出版社(Clarendon Press),牛津)。参比gplOOTCR的二硫键连接可溶性形式(实施例2)显示Kd为约19 μ Μ。根据同一 BIAcore数
[0136]还利用HLA-A*0201 加载的 gplOOYLEPGPVTA(SEQ ID NO:1)肽的变体肽(YLEPGPVTV - SEQ ID NO:6)重复该亲和力测定。可溶性二硫键连接的参比gplOOTCR 对 YLEPGPVTV (SEQ ID NO: 6)-HLA*0201 复合物的亲和力(Kd)(约 19 μ M)与gplOOYLEPGPVTA (SEQ ID NO: 1)_HLA*0201 复合物所得的相似。
[0137]动力学参数
[0138]还采用以上BIAcore分析方法测定平衡结合常数和解离速率。
[0139]通过实验检测解离速率常数、?和结合速率常数1^来确定高亲和力TCR的Kd (参见以下实施例4)。平衡常数Kd计算为kf/k。#
[0140]将TCR注射流过两个不同小室，一个用约300RU的特异性YLEPGPVTA HLA_A*02复合物(或指定时的YLEPGPVTV HLA-A*02复合物)包被，第二个用约300RU的非特异性HLA-A2-肽复合物包被。流速设置为50微升/分钟。通常注射入250 μ I浓度约等于Kd的10倍的TCR。然后使缓冲液流过直到响应回复到基线或时间过去2小时以上。用Biaevaluation软件计算动力学参数。也将解离相拟合为单指数衰变方程式从而能计算半衰期。
[0141]实施例4
[0142]产生天然gplOOTCR的高亲和力变体
[0143]噬菌体展示是产生gplOOTCR变体的文库以鉴定高亲和力突变体的一种手段。将Li等((2005) Nature Biotech23(3):349-354)描述的TCR噬菌体展示和筛选方法应用于实施例2的参比gplOOTCR。通过诱变靶向所有6个gplOOTCR⑶R区域(参比TCR中与天然TCR中相同)，分别淘选和筛选各CDR文库。
[0144]鉴定了亲和力和/或结合半衰期至少是参比gplOOTCR两倍的TCR(因此，隐含表示是天然TCR的至少两倍)，采用SEQ ID No: 2中所示编号，其具有一个或多个α链可变域氨基酸残基 94S、94T、94R、97M、98M、98Q、98G、98S、98A 或 102D 和 / 或采用 SEQ ID No: 3 中所示编号，其具有一个或多个β链可变域氨基酸残基271、28F、29Q、30K、31K、50W、51A、51G、52Q、52Y、52T、53G、53F、54N、54H、61T、94L、95Y、95H、95W、95F、95S、95V、96C、97E、97A、98G、100Q 或 100P。
[0145]高亲和力TCR 的 α 链(SEQ ID No:7、8 和 9)和 β 链(SEQ ID No: 10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34 和 35)的可变区的氨
基酸序列的具体例子分别示于图3A-C和4Α-Ζ。这些α链仅在⑶R3中突变，β链在⑶R1、⑶R2和⑶R3的一个或多个中突变。
[0146]采用以上实施例2的方法重折叠TCR异源二聚体(包括在恒定区中引入的半胱氨酸以提供人工链间二硫键)。以此方式制备的TCR由以下部分构成:(a)参比TCRii链以及经突变包含可变域SEQ IDNo: 7、8和9的α链；(b)参比TCRa链以及经突变包含β链可变域 SEQ ID Νο:10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、
31、32、33、34和35的β链；和(c)包含突变型可变域的β和α链的各种组合物。
[0147]采用上述BIAcore方法分析高亲和力可溶性二硫键连接的gplOOTCR和天然肽YLEPGPVTA HLA-A*02复合物之间的相互作用，结合数据示于表1。表1A显示当利用变体肽YLEPGPVTV HLA-A*02复合物检验时，这些高亲和力TCR的结合数据。
[0148]采用上述BIAcore方法分析高亲和力可溶性二硫键连接的gplOOTCR和YLEPGPVTVHLA-A*02复合物之间的相互作用，结合数据示于表2。
[0149]表1
[0150]
TCR可变域SEQI
ID koffCs'1) TA kon (M—V1) Kd
αβ____
2(1-109) 10 2.47e-3 4.6 分钟 4.77e5 5.18 nM
2(1-109) 13 0.0109 63 秒 2.88e5 37.8 nM
2(1-109) H 4.71e-3 2.4 分钟 3.2e5 14.7 nM[0151]
2(1-109)|163.13e-3 | 3.6 分钟 |2.84e5 11 nM
2(1-109)175.82e-3 1.9 分钟2.99e519.5 nM
2(1-109)is3.84e-3 2.9 分钟6.54e458.7 nM
2(1-109)193.41e-3 3.3 分钟1.25e527.2 nM
2(1-109)200.013352 秒3.44e538.7 nM
[0152]表1A:用gplOO变体肽-HLA-A2复合物检验的表1的gplOOTCR的结合数据
[0153]
TCR可变域SEQ j
ID koffCs'1) T1A kon (M4S'1) Kd
αβ____
2(1-109)102.33e-3 4.9 分钟 4e55.83 nM
2(1-109)130.0102 67 秒3.05e533.4 nM
2(1-109)14 4.47e-3 2.57 分钟3.71e512 nM
2(1-109)163.02e-3 3.8 分钟3.16e59,5 nM
2(1-109)175.81e-3 1.98 分钟2.32e525 nM
2(1-109)183.56e-3 3.2 分钟8.96e439.7 nM
2(1-109)193.33e-3 3.4 分钟3.53e59.44 nM
2(1-109)200.0124 56 秒2.78e544.6 nM
[0154]上表1和IA显示用天然gplOOYLEPGPVTA肽HLA_A*02复合物或变体gp 100YLEPGPVTV肽HLA-A*02复合物检验的各高亲和力TCR获得实验误差内的、非常相似的动力学参数。观察到这一情况后，仅用变体YLEPGPVTV肽HLA-A*02复合物检验了一些高亲和力TCR(参见表2)。预计这些TCR对天然肽HLA-A*02复合物表现出非常相似的动力学参数。
[0155]表2
[0156]
TCR π?变域 SEQID| ; ,.,, ^^^LJ^^
k,.,rr(s ,) T72 kon (M s ) Kd
αρ_____
2(1-109)227.05e-416.3 分钟1.72e54.1 nM
2(1-109)235.6e-420.5 分钟3.28e51.7nM
2(1-109)249.93e-5115 分钟4.87e50.2 nM
7202.85e-34 分钟4,55e56.2 nM
8202.49e-34.6 分钟4.36e55.7 nM
9202.82e-34 分钟5.33e55.3 nM[0157]
【权利要求】
1.一种T细胞受体(TCR)，其具有结合YLEPGPVTA (SEQ ID No:1) HLA-A2复合物的特性，并具有: (a)序列如SEQ ID No:2 的氨基酸 I 到 109 所示、但包含 S1A、S1G、D94S、D94T、D94R、L97M、V98M、V98Q、V98G、V98S、V98A和G102D中一个或多个突变的α链可变域序列；和/或 (b)序列如SEQ ID No: 3 的氨基酸 I 到 112 所示、但包含 L271、N28F、H29Q、D30K、A31K、Q50W、I51A、I51G、V52Q、V52Y、V52T、N53G、N53F、D54N、D54H、A61T、S94L、I95Y、I95H、I95W、I95F、I95S、I95V、G96C、G97E、G97A、P98G、E100Q 和 E100P 中一个或多个突变的 β 链可变域序列， 其中，所述TCR对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合亲和力和/或结合半衰期是具有胞外α链序列SEQ ID No:45和胞外β链序列SEQ ID No:46的TCR的至少两倍。
2.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR包含α链可变域氨基酸序列SEQID Νο:7、8 和 9 之一。
3.如权利要求2所述的TCR，其特征在于，所述α链可变域氨基酸序列是SEQID No: 7、8和9之一，所述β链可变域氨基酸序列是SEQ ID No:3的氨基酸I到112。
4.如权利要求1或2所述的TCR，其特征在于，所述TCR包含β链可变域氨基酸序列SEQ ID No:10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34 和 35 之一。
5.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述α链可变域氨基酸序列是SEQID No:2的氨基酸I到109，所述β链可变域氨基酸序列是SEQ ID No:10-35之一。
6.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR是αβ异源二聚TCR，其具有α和β链恒定域序列，其中半胱氨酸残基取代TRAC的Thr48和TRBCl或TRBC2的Ser57，所述半胱氨酸在所述TCR的α和β恒定域之间形成二硫键。
7.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR是αβ异源二聚TCR，其具有α和β链恒定域序列，其中恒定域序列通过TRAC的外显子2的Cys4和TRBCl或TRBC2的外显子2的Cys2之间的天然二硫键相连。
8.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR与可检测标记物、治疗剂、PK修饰部分或任何这些物质的组合结合。
9.如权利要求8所述的TCR，其特征在于，所述治疗剂是共价连接于所述TCR的α或β链的C-或N-末端的抗-⑶3抗体。
10.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，与具有胞外α和β链序列SEQID No:2和3的TCR相比，所述TCR具有修饰的糖基化。
11.一种多价TCR复合物，其包含至少两个以上权利要求中任一项所述的TCR。
12.编码权利要求1到10中任一项所述TCR的DNA或RNA。
13.一种分离的细胞，其呈递权利要求1到7中任一项所述的TCR。
14.如权利要求9所述的TCR，其特征在于，所述TCR包含: 选自下组的TCRa链氨基酸序列: (i)TCR α链序列SEQ ID No:45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No:8替代，其中I位的氨基酸是S ；(ii)TCRa链序列SEQIDNo:45，其中氨基酸1-109被序列SEQ IDNo:8替代，其中I位的氨基酸是A ； (iii)TCRa链序列SEQID No:45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No:8替代，其中I位的氨基酸是G ; (iv)TCR a链序列SEQ ID No:45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No:8替代，其中I位的氨基酸是S，依据SEQ ID No:45的编号，该a链的C-末端从F196到S203截短8个氨基酸； (v)TCRa链序列SEQID No:45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No:8替代，其中I位的氨基酸是A，依据SEQ ID No:45的编号，该a链的C-末端从F196到S203截短8个氨基酸(包括端点)；和 (vi)TCR a链序列SEQ ID No:45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No:8替代，其中I位的氨基酸是G，依据SEQ ID No:45的编号，该a链的C-末端从F196到S203截短8个氨基酸(包括端点)； 和选自下组的TCR β链-抗-⑶3氨基酸序列: (vii)TCRP链-抗-⑶3序列SEQID No:36，其中I和2位的氨基酸分别是D和I ;
(viii)TCRP链-抗-⑶3序列SEQID No:36，其中I和2位的氨基酸分别是A和I ; (ix)TCRii链-抗-⑶3序列SEQ ID No:36，其中I和2位的氨基酸分别是A和Q ; (X)TCRP链-抗-CD3序列SEQ IDNo:36，其中I和2位的氨基酸分别是D和I，108-131位的氨基酸被SEQ ID No:44替代，254-258位的氨基酸被SEQID No:47替代； (xi)TCRP链-抗-CD3序列SEQID No:36，其中I和2位的氨基酸分别是D和I，257位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ； (xii)TCRP链-抗-CD3序列SEQID No:36，其中I和2位的氨基酸分别是D和1,256位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ； (xiii)TCRP链-抗-CD3序列SEQIDNo:36，其中I和2位的氨基酸分别是D和I，255位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ； (xiv)具有序列SEQID No:36的TCRP链-抗-⑶3，其中I和2位的氨基酸分别是A和Q，257位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ； (XV)具有序列SEQ ID No:36的TCR β链-抗-⑶3，其中I和2位的氨基酸分别是A和Q，256位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ； (xvi)具有序列SEQID No:36的TCRP链-抗-⑶3，其中I和2位的氨基酸分别是A和Q，255位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ； (xvii)具有序列SEQID No:36的TCRP链-抗-⑶3，其中I和2位的氨基酸分别是A和I，257位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ; (xviii)具有序列SEQID No:36的TCRP链-抗-⑶3，其中I和2位的氨基酸分别是A和I，256位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G ;和 (xix)具有序列SEQID No:36的TCRP链-抗-⑶3，其中I和2位的氨基酸分别是A和I，255位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G。
15.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述a链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(vii)。
16.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(X)。
17.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(ix)。
18.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(V)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(viii)。
19.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(vii)。
20.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xi)。
21.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xii)。
22.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xiii)。
23.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xiv)。
24.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(XV)。
25.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xvi)。
26.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(V)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xvii)。
27.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(V)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xviii)。
28.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(V)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xix)。
29.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xi)。
30.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xii)。
31.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-⑶3氨基酸序列是(xiii)。
32.一种参比gplOOTCR，其具有胞外α链序列SEQ ID No:45和胞外β链序列SEQ IDNo:46ο
33.选自下组的治疗剂:放射性化合物、前药激活酶或联苯基水解酶-样蛋白质、化疗剂、毒素、免疫调节抗体片段或免疫调节细胞因子。
【文档编号】C12N5/0783GK104017067SQ201410257886
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2010年7月1日 优先权日:2009年7月3日
【发明者】B·K·雅各布森, N·哈伍德, N·R·利迪 申请人:英美偌科有限公司