一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法

一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法
【专利摘要】本发明公开了一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法。本发明运用分子生物学技术在表达黑曲霉β-甘露聚糖酶的重组菌中转化含分子伴侣蛋白PDI基因编码区的质粒，使β-甘露聚糖酶与分子伴侣共表达。在伴侣蛋白的协同作用下，加速了外源蛋白的合成速率，从而增加了外源蛋白β-甘露聚糖酶的分泌速率。本发明将β-甘露聚糖酶与分子伴侣共表达，提高了β-甘露聚糖酶的表达水平。
【专利说明】一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的 方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及的是一种共表达伴侣蛋白提高β_甘露聚糖 酶基因表达水平的方法。

【背景技术】
[0002] 植物细胞壁主要由半纤维素、纤维素、木质素等组成。甘露聚糖是植物半纤维 素的重要组分，由β -1，4-D吡喃甘露聚糖连接而成的线状多糖，主要存在于植物细胞壁和 豆科植物种子中。作为一种非淀粉多糖，β_甘露聚糖能产生抗营养作用。单胃动物不含 有降解β_甘露聚糖的内源酶，不能消除β_甘露聚糖的抗营养作用，因而对动物的生产性 能产生负面影响。
[0003] β -甘露聚糖酶（β-mannanase，EC3. 2. 1. 78)是一种半纤维素酶，以内切方式降 解β_1，4糖苷键。β-甘露聚糖酶主要来源于微生物，如细菌、放线菌和真菌等。丝状真菌 黑曲霉是一种重要的工业微生物，已被FDA认定为属于GRAS (公认安全）的微生物，其能分 泌多种胞外酶和有机酸。目前，微生物来源的β-甘露聚糖酶已被广泛应用于造纸工业、食 品工业、饲料工业、纺织工业和石油工业等。但所有这些工业化应用能否成功的关键因素之 一是β-甘露聚糖酶的高水平表达。
[0004] 毕赤酵母表达系统具有原核生物表达系统所不具有的对外源蛋白质的翻译后修 饰等优点，近年来已被广泛用于工业化生产各种异源蛋白，且被认为是最有效的蛋白表达 系统之一。大量研究表明，当外源蛋白大量表达时，酵母分泌途径的超载导致内质网工具酶 量的减少，造成蛋白错误的装配折叠而使其聚集在内质网中，最终导致蛋白表达量降低。而 在酵母中共表达能辅助蛋白质正确折叠装配的分子伴侣能改善这一状况。分子伴侣的概念 早在1978年被Laskey等提出，它能帮助蛋白质正确折置和提商外源蛋白表达量，从而逐渐 被众多学者所关注。蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide ?8〇η?θΓΒ8θ，Η)Ι)是内质网中 一种重要的折叠催化剂，能通过其氧化活性催化蛋白质分子中二硫键的形成，也能通过异 构作用促进蛋白质正确折叠，同时还具有类似分子伴侣抑制错误折叠蛋白质聚集的功能。 目前，国内外已有很多成功实例表明PDI能提高外源蛋白表达水平。Inan等（2005)研究发 现过表达PDI可使钩虫分泌蛋白（Na-SPl)在毕赤酵母中的表达量显著增加；屈琳（2009) 发现共表达PDI能提高IFNi3-HAS在毕赤酵母中的表达量达60%;Zhang等（2011)发现共 表达PDI能增加 β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的分泌表达；Sha等（2013)研究表明，共表 达PDI能显著增加脂肪酶在毕赤酵母中的产量。
[0005] 综上可知，酵母细胞表达外源蛋白分泌产率与PDI及二硫键形成有很大的相关 性。国内外有很多研究证实了酵母中PDI的过量表达能大幅度提高外源蛋白的表达量。因 此，当蛋白质含较多的二硫键时，了解和操纵内质网中二硫键形成途径是提高外源基因表 达水平的关键。


【发明内容】

[0006] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种共表达伴侣蛋白 提高β_甘露聚糖酶基因表达水平的方法。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] -种共表达伴侣蛋白提高β -甘露聚糖酶基因表达水平的方法，其步骤如下：
[0009] (1)黑曲霉β-甘露聚糖酶基因编码区的克隆及其在毕赤酵母中的表达
[0010] 提取黑曲霉总RNA，将其反转录成cDNA ;根据已知的丝状真菌β -甘露聚糖酶基因 编码区序列，设计一对简并引物，设计的引物为：上游引物MAN-F :5' -ATGAAG(T/C)T(C/T) TCCA (G/A) C (T/G) CCCTC-3，，下游引物 MAN-R : 5，-TTA (G/A) GC (G/A) CTA (T/C) (G/C) AATA (T/ G)CAGCAAG-3,；
[0011] PCR 反应体系为 50yL:ddH2019yL，10yM 上下游引物各 lyL，模板 cDNA4yL， 2XTaq PCR MasterMix25y L ;PCR 反应条件均为 95°C 预变性 3min，然后进行 95°C 30s， 52°C 30s，72°C 90s，共35个循环，最后再72°C延伸7min ;切胶回收PCR产物并将其克隆至 T载体上；对所获得的β_甘露聚糖酶进行信号肽分析，将β_甘露聚糖酶成熟肽编码序列 克隆至毕赤酵母表达质粒PPIC9K上，构建成pPIC9K-MAN质粒并实现其在毕赤酵母中的表 达，并筛选一株能高表达β-甘露聚糖酶的重组菌；
[0012] (2)伴侣蛋白PDI基因编码区的克隆及pPICZaA-PDI质粒的构建
[0013] 将伴侣蛋白PDI基因编码区的序列插入到pPICZ a A质粒中，构建成pPICZ a A-PDI 质粒；
[0014] (3)共表达分子伴侣蛋白PDI对β -甘露聚糖酶产量的影响
[0015] 转化pPICZ a A-PDI质粒到表达β-甘露聚糖酶的重组菌中，诱导表达β-甘露聚 糖酶，并对其表达条件进行优化，同时鉴定表达产物并分析表达产物的酶学性质。
[0016] 所述的方法，步骤（3)中，所述优化的表达条件是：诱导表达时间为7d，甲醇的体 积浓度为1.5%。
[0017] 本发明将在表达黑曲霉β-甘露聚糖酶的重组菌中转化含分子伴侣蛋白PDI基因 编码区的质粒，使β-甘露聚糖酶与分子伴侣共表达，提高了 β-甘露聚糖酶的表达水平。

【专利附图】

【附图说明】
[0018] 图1为黑曲霉β-甘露聚糖酶基因编码区的克隆；M:DNA标准分子量；1 :PCR扩增 产物
[0019] 图2为毕赤酵母转化子基因组DNA为模板的PCR鉴定结果；M :DNA标准分子量；1 : 5' A0X1/3' A0X1 为引物的 PCR 结果；2 :EcoRI-MAN/NotI-MAN 为引物的 PCR 结果。
[0020] 图3为毕赤酵母PDI基因编码区的克隆；M :DNA标准分子量；1 :PCR扩增产物。
[0021] 图4为毕赤酵母转化子基因组DNA为模板的PCR鉴定结果；M:DNA标准分子 量；1 :EcoRI-MAN/NotI-MAN 为引物的 PCR 结果；2 :PDI-F/PDI-R 为引物的 PCR 结果；3 : 5' A0X1/3' A0X1为引物的PCR结果。
[0022] 图5为重组β -甘露聚糖酶去糖基化后的SDS-PAGE电泳分析；M :DNA标准分子量； 1 :重组β -甘露聚糖酶去糖基化；2 :重组β -甘露聚糖酶未去糖基化。
[0023] 图6为高表达β -甘露聚糖酶毕赤酵母重组子最适诱导条件的优化结果。
[0024] 图7为重组β -甘露聚糖酶的Western-blot分析；1 :未诱导表达上清；2 :甲醇诱 导表达上清。
[0025] 图8为重组β -甘露聚糖酶最适反应pH。
[0026] 图9为重组β -甘露聚糖酶最适反应温度。
[0027] 图10为重组β -甘露聚糖酶pH稳定性。
[0028] 图11为重组β -甘露聚糖酶温度稳定性。

【具体实施方式】
[0029] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0030] 实施例1黑曲霉β -甘露聚糖酶基因（MAN)编码区的克隆及其在毕赤酵母中的表 达
[0031] 1、黑曲霉液体培养
[0032] 黑曲霉（Aspergillus niger)GM3. 452购自广东省微生物研究所微生物菌种 保藏中心。配制液体培养基：Sucrose (鹿糖）30g，NaN033g，MgS04 · 7Η200· 5g，KC10. 5g， FeS04 · 7H200. Olg，K2HP04lg，蒸馏水lOOOmL，pH调至7. 2,高压灭菌，冷却，接种黑曲霉到无 菌液体培养基，25°C，200r/min，培养3-4d，收集菌体进行RNA提取。
[0033] 2、黑曲霉总RNA的提取和反转录
[0034] 将培养好的菌体吸干表面的培养基后放研钵中加液氮研磨，取适量研磨菌体于无 菌去RNA酶的1. 5mL离心管中，加 lmlTRIzol，用手剧烈摇晃使粉末充分溶解后，室温放置 5min ;4°C，12000g离心10min ;转移上清至另一新的1. 5mL离心管，加0. 2mL氯仿，盖紧离 心管后用力剧烈晃动15s，室温放置3min ;4°C 12000g离心15min，移取上清至一新的1. 5mL 离心管，加0. 4mL冰预冷的异丙醇，轻缓上下颠倒6-8次使其充分混匀后室温静置10min ; 4°C，12000g离心10min后弃上清，加入lmL75% (v/v)乙醇（DEPC处理过的水配制）洗涤 沉淀一次；4°C，7500g离心5min后弃上清，晾干残余乙醇，加入20 μ L DEPC处理过的水溶 解沉淀；取3 μ L RNA样品于紫外/可见光分光光度计测定其浓度及质量，剩余的RNA样品 于-80°C保存备用。
[0035] 取 1 μ g 总 RNA、1 μ L Oligo dT 弓| 物（50μ M)和 1 μ L dNTP mixture(10mM each)，用DEPC处理过的水补充至10μ L，65°C加热变性5min后快速置于冰中，再加入 4 μ L5 XPrimeScript Buffer、。· 5 μ L RNase Inhibitor (40U/ μ L)、4· 5 μ LDEPC 处理过的水 和 1 μ L PrimeScript RTase (200U/ μ L)，于 42°C 反应 45min 将其中的 mRNA 反转录为 cDNA， 最后于70°C作用15min以灭活反转录酶，立即使用或-20°C保存备用。
[0036] 3、引物的设计及PCR反应
[0037] 根据已知的丝状真菌来源的甘露聚糖酶编码区序列设计一对简并引物，上游 引物自起始密码子处设计，下游引物至终止密码子处设计，设计的引物为：
[0038] 上游引物（MAN-F) : 5 ' -ATGAAG (T/C) T (C/T) TCCA (G/A) C (T/G) CCCTC-3 '
[0039] 下游引物（MAN-R) : 5 ' -ΤΤΑ (G/A) GC (G/A) CTA (T/C) (G/C) AATA (T/G) CAGCAAG-3 '
[0040] PCR 反应体系为 50 μ L :ddH2019 μ L，上下游引物（10 μ Μ)各 1 μ L，cDNA (模 板）4 μ L，2 X Taqmix25 μ L。
[0041] PCR 反应条件：95°C预变性 3min，然后进行 95°C 30s，52°C 30s，72°C 90s，共 35 个 循环，最后再72°C延伸7min。反应结束后将PCR产物进行1%琼脂糖电泳，结果表明，在 1000?1500bp之间有一特异性条带（图1)。
[0042] 4、PCR产物的回收和纯化
[0043] 采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，具体操作步骤为：
[0044] 按照步骤3所述，制备lOOuLPCR反应液，电泳后割胶，步骤如下：
[0045] a、PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外光下用消毒刀片切下目的条带， 将切下的胶切成小块置于1. 5mL离心管中，称量胶的重量，加入3-6倍的BufferB2,于50°C 水浴至胶块完全溶化。
[0046] b、将胶溶液移入吸附柱中，8000g离心30s，倒掉收集管中液体。
[0047] c、向吸附柱中加入500 μ L Wash solution, 9000g离心30s，倒掉收集管中液体，将 吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次。
[0048] d、将空吸附柱于9000g离心lmin。
[0049] e、向空吸附柱中加入30 μ L灭菌ddH20,室温静置2min，13000g离心2min。
[0050] f、离心管中的溶液即为回收的DNA片段的水溶液。
[0051] g、取3 μ L于紫外/可见光分光光度计测定其浓度及质量，剩余DNA样品于-20°c 贮存。
[0052] 5、T 克隆
[0053] a、DNA连接反应
[0054] 将凝胶回收后的PCR产物（由步骤4获得）与pMD19-T载体连接，连接体系为 10μ L :回收后的 PCR 产物 4· 5μ L，pMD19-T VectorO. 5μ L，SolutionI5y L。以上操作在冰 上进行，混匀后在连接仪上于16°C连接3-4h。
[0055] b、大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备与转化
[0056] 将大肠杆菌DH5 a单菌落接种于3mLLB液体培养基，37°C振荡培养过夜。按1 %接 种于50mLLB液体培养基，37°C振荡培养至0D600为0· 3-0. 5,冰浴10min。4°C，5000rpm离 心 3min，弃上清，加入 15-20mL80mmol/LCaCl2，轻轻悬浮，冰浴 20_25min。4°C，5000rpm 离心 311^11，弃上清，菌体用1-21^80臟〇1/10&(：12轻轻悬浮，制得0册〇感受态细胞，然后加20% 的甘油，分装，于_70°C保存备用。
[0057] 取a中的10 μ L连接产物与80 μ L的DH5 α感受态细胞混合，冰浴25_30min ;42°C 热激1. 5min，立即置冰上2min，再加入400-600 μ LLB液体培养基，37°C培养lh ;涂布于LB 固体平板（含50 μ g/mL氨苄青霉素），37°C培养过夜。
[0058] c、菌落PCR初步鉴定
[0059] 用灭菌的牙签挑取少量单菌落至含10 μ L灭菌水的PCR管中，于PCR仪上95°C变 性5min，立即置于冰上。
[0060] 混匀并稍微离心后，加入10 μ Μ的上下游引物MAN-F/MAN-R各1 μ L、0. 5 μ L水和 12. 5 μ L Taq mix。
[0061] 混合均匀后，按以下条件进行PCR反应：95°C 30s，52°C 30s，72°C90s，共35个循 环，最后再72°C延伸7min。PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，初步筛选重组载体。
[0062] d、DNA测序及检验实验的正确性
[0063] 挑取菌落PCR鉴定为阳性克隆的菌落，送往生工生物工程（上海）股份有限公司 进行DNA测序。将测序后获得的序列用DNAMAN软件进行比对以验证序列的正确性和该 方法的可靠性。测序结果表明，所获得的DNA片段含有β-甘露聚糖酶基因编码区。该 β-甘露聚糖酶基因编码区序列全长为1152bp，编码383个氨基酸。成功构建的质粒命名 为 PMD19-T-MAN。
[0064] 黑曲霉β -甘露聚糖酶基因编码区T克隆测序结果如下：
[0065] 1ATGAAGCTTTCCAACGCCCTCCTCACCCTGGCTAGCCTGGCGCTGGCCAACGTCTCCACG
[0066] 61GCTCTGCCGAAAGCCTCCCCTGCACCGAGCACCAGCAGCAGTGCTGCCTCCACCTCCTTC
[0067] 121GCCAGCACCTCCGGCCTCCAATTCACCATTGATGGCGAAACTGGCTACTTCGCCGGAACG
[0068] 181AACAGCTACTGGATCGGTTTCCTCACTGACAACGCGGACGTCGACCTCGTCATGGGCCAC
[0069] 241CTGAAGTCGTCCGGCCTCAAGATCCTCCGCGTGTGGGGCTTCAACGATGTCACCTCGCAG
[0070] 301CCCTCCTCCGGCACAGTCTGGTACCAACTGCACCAGGACGGCAAATCGACAATCAACACG
[0071] 361GGTGCCGACGGTCTCCAGCGCCTCGACTACGTCGTCTCGTCTGCCGAACAGCACGACATC
[0072] 421AAACTCATCATCAACTTCGTCAACTACTGGACCGATTACGGTGGTATGTCTGCGTACGTG
[0073] 481AGCGCGTATGGCGGATCCGGCGAGACGGATTTCTATACCAGTGATACCATGCAGAGTGCC
[0074] 541TATCAGACATATATCAAGACGGTCGTGGAGCGGTACAGTAACTCCTCGGCGGTGTTTGCG
[0075] 601TGGGAGTTGGCGAATGAGCTGAGATGTCCGAGTTGCGATACTTCTGTGTTGTATAACTGG
[0076] 661ATTGAGAAGACGAGTAAGTTTATTAAGGGGTTGGATGCGGATCGTATGGTTTGTATTGGT
[0077] 721GATGAGGGCTTCGGTCTCAACATCGACTCGGACGGCAGCTACCCTTATCAATTCTCCGAG
[0078] 781GGCTTGAACTTTACGATGAACCTCGGTATCGATACTATTGACTTTGGTACCCTCCACTTG
[0079] 841TACCCTGATAGCTGGGGCACCTCCGACGACTGGGGCAACGGCTGGATCACCGCCCACGGC
[0080] 901GCAGCCTGCAAAGCGGCCGGCAAGCCATGTCTCCTGGAGGAATACGGAGTCACCTCGAAC
[0081] 961CACTGCAGTGTGGAGGGCTCGTGGCAGAAGACAGCGCTCAGCACAACGGGCGTCGGCGCG
[0082] 1021GATCTGTTCTGGCAGTATGGTGATGATTTGAGTACCGGGAAGTCGCCGGATGATGGGAAT
[0083] 1081ACTATCTACTATGGGGCTAGTGATTATCAGTGCCTGGTGACGGATCATCTTGCTGCTATT
[0084] 1141GGTAGTGCTTAA
[0085] 氨基酸序列如下：
[0086] 1MKLSNALLTLASLALANVST
[0087] 21ALPKASPAPSTSSSAASTSF
[0088] 41ASTSGLQFTIDGETGYFAGT
[0089] 61NSYWIGFLTDNADVDLVMGH
[0090] 81LKSSGLKILRVWGFNDVTSQ
[0091] 101PSSGTVWYQLHQDGKSTINT
[0092] 121GADGLQRLDYVVSSAEQHDI
[0093] 141KLIINFVNYWTDYGGMSAYV
[0094] 161SAYGGSGETDFYTSDTMQSA
[0095] 181YQTYIKTVVERYSNSSAVFA
[0096] 201WELANELRCPSCDTSVLYNW
[0097] 221IEKTSKFIKGLDADRMVCIG
[0098] 241DEGFGLNIDSDGSYPYQFSE
[0099] 261GLNFTMNLGIDTIDFGTLHL
[0100] 281YPDSWGTSDDWGNGWITAHG
[0101] 301AACKAAGKPCLLEEYGVTSN
[0102] 321HCSVEGSWQKTALSTTGVGA
[0103] 341DLFWQYGDDLSTGKSPDDGN
[0104] 361TIYYGASDYQCLVTDHLAAI
[0105] 381 GSA*
[0106] 6、β-甘露聚糖酶基因重组毕赤酵母表达载体（pPIC9K-MAN)的构建
[0107] a、β-甘露聚糖酶成熟肽编码序列的克隆
[0108] 对所克隆的黑曲霉β-甘露聚糖酶基因编码区所编码的蛋白序列通过在线分析 (http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)，结果表明，β -甘露聚糖酶基因 Ν 端前 21 个氨基酸为信号肽。根据PPIC9K质粒所含的酶切位点，设计引物进行PCR扩增β-甘露聚 糖酶成熟肽（不含信号肽）编码序列，引物序列如下：
[0109] EcoRI-MAN ：5, -CCGGAATTCCTGCCGAAAGCCTCCC-3' (下划线为 EcoRI 位点）
[0110] Notl-MAN ：5, ~ATAAGAATGCGGCCGCTTAAGCACTACCAATAG~3,(下划线为 Notl 酶切位 点）
[0111] 以PMD19-T-MAN质粒为模板进行PCR反应，PCR反应体系为50 μ L :pMD19-T-MAN 质粒 lyL，EcoRI-MAN/NotI-MAN(10yM)弓I 物各 lyL，2XTaqPCRMasterMix25yL， ddH2022 yL。PCR 反应条件为 95°C预变性 3min，然后进行 95°C 30s，60°C 30s，72°C 90s，共 35个循环，最后再72°C延伸7min。
[0112] b、PCR切胶回收产物和pPIC9K质粒的双酶切
[0113] PCR切胶回收产物和pPIC9K质粒均用限制性内切酶EcoRI和Notl双酶切。酶切 产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收备用（胶回收采用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒 方法进行）。
[0114] PCR切胶回收产物酶切体系为100yL:回收后的PCR片段15yL，ddH2051 yL， EcoRI4y L, NotI4y L,0. 1 % (w/v)BSA8 μ L,0. 1 % (v/v)TritonX-1008 μ L, lOXbuffer H10 μ L。以上操作在冰上进行，混匀后在水浴锅上于37°C反应3h。
[0115] pPIC9K 质粒酶切体系为 100 μ L :pPIC9K 质粒 10 μ L，ddH2056 μ L，EcoRI4 μ L， NotI4yL，0.1% (w/v)BSA8 μ L，0.1% (ν/ν)Triton Χ-1008 μ L，lOXbuffer Η10 μ L。以上 操作在冰上进行，混匀后在水浴锅上于37°C反应3h。
[0116] c、DNA连接反应
[0117] 琼脂糖凝胶回收上述EcoRI和Notl双酶切后的PCR产物（β-甘露聚糖酶成熟肽 编码区和PPIC9K质粒），将它们用T4DNA连接酶进行连接，，连接体系为10 μ L :回收后的 PCR片段4. 5 μ L，回收后的pPIC9K质粒0. 5 μ L，Solution〗（含T4DNA连接酶）5 μ L。以上 操作在冰上进行，混匀后在连接仪上于16°C连接3-4h。
[0118] d、连接产物的转化和鉴定
[0119] 连接产物转化大肠杆菌DH5 α，转化后长出的菌落进行菌落PCR鉴定和测序鉴定。 测序结果表明，与步骤5所获得的β -甘露聚糖酶成熟肽编码区序列100%同源，表明序列 连接正确。成功构建的质粒命名为PPIC9K-MAN。
[0120] 7、β -甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达
[0121] a、pPIC9K_MAN质粒的小量提取
[0122] 采用OMEGA公司Plasmid Mini kit I试剂盒小量提取质粒，具体操作步骤为：
[0123] 从LB平板上挑取鉴定正确的携带pPIC9K-MAN质粒的重组菌，接种到4mL含有卡 那霉素（50 μ g/mL)的液体LB培养基中，振荡培养16h左右。取1. 5mL菌液加入到2mL离 心管中，常温，12000rpm离心30s，弃尽上清。加入100 μ L溶液I，振荡混匀。加入200 μ L 新配制的溶液II，上下轻轻颠倒数次，混匀，置冰上5min。加入300 μ L冰预冷的溶液III， 上下轻轻颠倒数次，使裂解物分散均匀，置冰上5min。常温，12000rpm离心5min。转移上清 至新离心管中，加入500yL苯酚/氯仿。常温，12000rpm离心8min。上清液中加入2倍体 积无水乙醇，混勻，冰浴30min。常温，12000rpm离心15min。沉淀用70%乙醇洗漆沉淀两 次，真空抽干，加20yL含RNaseCOyg/mL)的TE(pH8.0)溶解沉淀。0.8%琼脂糖凝胶电 泳检测质粒DNA纯度，-20°C贮存。
[0124] b、pPIC9K_MAN质粒的线性化
[0125] pPIC9K-MAN质粒线性化体系为 150 μ L :pPIC9K-MAN质粒（6 μ g) 15 μ L，SacI6 μ L， lOXbuffer L15y L，（ΜΗ20114μ L。以上操作在冰上进行，混匀后在水浴锅上于37°C反应 5h〇
[0126] c、毕赤酵母感受态细胞的制备
[0127] 挑取酵母GS115单菌落，接种至含有5mL YH)培养基试管中，28-30°C，250-300rpm 培养过夜。取50 μ L的培养物接种至含有50mL新鲜Yro培养基的500mL三角瓶中，28-30°C， 250-300rpm培养过夜，至0D600值达到1. 3-1. 5。将细胞培养物于4°C，1500g离心5min， 用50mL冰预冷的灭菌水将菌体沉淀重悬。4°C，1500g离心5min，用25mL冰预冷的灭菌水 将菌体沉淀重悬。4°C，1500g离心5min，用20mL冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液将菌体沉 淀重悬。4°C，1500g离心5min，用lmL冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其 终体积约为1. 5mL。每管80 μ L分装，-70°C保存。
[0128] d、毕赤酵母的电转化
[0129] 取80 μ L步骤c中感受态细胞与6 μ g步骤b得到的线性化pPIC9K-MAN质粒混匀， 转至0. 2cm冰预冷的电转化杯中，将电转化杯冰浴5min后进行电击。电击完毕后，加入lmL 冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液将菌体混勻，转至50mL离心管中，28°C孵育3h。将菌体悬液 涂布于 YPDS 平板上（含 G418 浓度为 0· 5mg/mL、lmg/mL、2mg/mL 和 4mg/mL)，每 100-200 μ L 涂布一块平板，于30°C培养2-5d。
[0130] e、β -甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达
[0131] 挑选步骤d中平板上长出的单菌落，置于装有30mLBMGY培养基的250mL三角 瓶中，于 28-30°C，250-300rpm 培养至 0D600 为 2-6。4°C，2000g 离心 5min，收集菌体，用 BMMY重悬菌体，使0D600为1. 0。置于500mL的三角瓶中，用双层纱布封口，于28-30°C， 250-300rpm的摇床上继续生长。每24h向培养基中添加无水甲醇至终浓度为0. 5% (v/v)。 按时间点分别取菌液样品（24h、48h、60h、72h和96h)，取样量为lmL，置于2mL离心管中，常 温，12000rpm离心5min，收集上清，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。用12% SDS-PAGE电泳和活性检测确定重组蛋白的表达和酶活力。
[0132] ①甘露聚糖酶活性检测
[0133] 在40°C和pH5. 5条件下，每分钟从浓度为0. 8% (w/v)的甘露聚糖溶液中降解释 放1 μ mol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位U。
[0134] 吸取2mL经过适当稀释的酶液（已经过40°C平衡），加入到刻度试管中，然后加入 2mL甘露聚糖溶液（0. 8% )，电磁振荡3s，40°C保温30min，加入5mL DNS试剂（3,5 -二硝基 水杨酸），电磁振荡3秒，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振 荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度。结果表明，对所长出的重组子进 行诱导表达后酶活测定，筛选出一株能高表达β -甘露聚糖酶的重组菌，酶活力为26. 6U/ mL〇
[0135] ②酵母基因组DNA提取和鉴定
[0136] 提取①中的那株高表达β-甘露聚糖酶的重组菌的基因组DNA并进行PCR鉴 定。基因组DNA提取按TIANGEN公司酵母基因组DNA提取试剂盒说明书进行。以所提取 基因组 DNA 为模板，分别以 EcoRI-MAN/Notl-MAN 和 5' Α0Χ1/3' Α0Χ1 (上游引物 5' Α0Χ1 : 5' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'，下游引物 3' A0X1 :5' -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'）为引 物，对重组子进行PCR鉴定。
[0137] PCR反应体系为50yL :ddH2021 yL，上下游引物（10μΜ)各lyL，基因组DNA (模 板）2 μ L，2 X Taq PCR MasterMix25 μ L。
[0138] 以EcoRI-MAN/Notl-MAN为引物的PCR反应条件：95°C预变性3min，然后进行 95°C 30s，57°C 30s，72°C 90s，共 35 个循环，最后再 72°C延伸 7min。以 5' A0X1/3' A0X1 为 引物的PCR反应条件：95°C预变性3min，然后进行95°C 30s，53°C 30s，72°C 45s，共35个循 环，最后再72°C延伸7min。
[0139] 反应结束后以1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。电泳结果表明，以 5' A0X1/3' A0X1和EcoRI-MAN/Notl-MAN为引物分别能扩增出约1500bp和1100bp大小的 片段（图2)，与预测大小相符，表明重组子已成功整合到毕赤酵母基因组DNA中。
[0140] 实施例2伴侣蛋白PDI基因编码区的克隆及pPICZ a A-PDI质粒的构建
[0141] 1、毕赤酵母GS115总RNA的提取
[0142] 挑取毕赤酵母GS115菌落于5mLYro培养基中，于30°C，220r/min振荡培养过夜， 收集菌体进行总RNA提取。RNA提取方法和反转录按实施例1中所述的方法进行。
[0143] 2、PDI基因编码区的PCR扩增
[0144] 根据GenBank上公布的毕赤酵母PDI基因序列（GenBank登录号：EU805807)设计 下列引物：
[0145] 上游引物 PD I-F :5 ' -CCGGAATTCATGCAATTCAACTGGAATATTAAAACTG-3 '（下划线为 EcoRI酶切位点）
[0146] 下游引物 PDI-R :5' -GCTCTAGATTAAAGCTCGTCGTGAGCGTC-3' (下划线为 Xbal 酶切 位点）
[0147] PCR反应体系为 50μ L :ddH2021 μ L，PDI-F和 PDI-R 引物（10μΜ)各 1 μ L，cDNA (模 板，由本实施例步骤1所提取的总RNA经反转录而成）2 μ L，2 X Taq PCR MasterMix25 μ L。
[0148] PCR 反应条件均为 95°C预变性 3min，然后进行 95°C 30s，60°C 30s，72°C 90s，共 35 个循环，最后再72°C延伸7min。反应结束后以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，结果 表明，所扩目的片段大小约为1500bp (图3)。
[0149] 3、pPICZ a A-PDI 质粒的构建
[0150] ①双酶切
[0151] pPICZ α A为毕赤酵母表达质粒。为构建pPICZ αΑ-PDI质粒，一方面，将本实施例 步骤2获得的PCR产物（PDI基因编码区）进行切胶回收，然后用限制性内切酶EcoRI和 XbaI双酶切；另一方面，将pPICZaA质粒用限制性内切酶EC0RI和XbaI双酶切。上述酶 切产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收备用（胶回收采用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂 盒方法进行）。
[0152] PCR产物的酶切体系为100μ L :回收后的PCR产物15μ L，ddH2067 y L，EcoRI4y L， XbaI4 μ L，lOXbufferMlO μ L。以上操作在冰上进行，混匀后放置于水浴锅中37°C反应3h。
[0153] pPICZ α A 质粒的酶切体系为 100 μ L :pPICZ α A 质粒 10 μ L，ddH2062 μ L， EcoRI4yL，XbaI4yL，10Xbuffer MlOyL。以上操作在冰上进行，混匀后在水浴锅上于 37°C 反应 3h。
[0154] ②DNA连接反应
[0155] 琼脂糖凝胶回收EcoRI和Xbal双酶切的PCR产物（PDI基因编码区）和pPICZ α A 质粒，将它们用T4DNA连接酶进行连接，连接体系为10 μ L :回收后的PCR产物4. 5 μ L，回收 后的pPICZ α A质粒0. 5 μ L，Solution I (含T4DNA连接酶）5 μ L。以上操作在冰上进行，混 匀后在连接仪上于16°C连接3-4h。
[0156] ③连接产物的转化和鉴定
[0157] 将本实施例步骤4所获得的连接产物转化大肠杆菌DH5a，对转化后长出的菌 落进行菌落PCR鉴定和测序鉴定。测序结果表明，所获得的酵母PDI基因编码区序列与 GenBank上已知的序列100%同源。成功构建的质粒命名为pPICZaA-PDI。
[0158] 毕赤酵母PDI基因编码区与pPICZ a A连接克隆测序结果如下：
[0159] 1ATGCAATTCAACTGGAATATTAAAACTGTGGCAAGTATTTTGTCCGCTCTCACACTAGCA
[0160] 61CAAGCAAGTGATCAGGAGGCTATTGCTCCAGAGGACTCTCATGTCGTCAAATTGACTGAA
[0161] 121GCCACTTTTGAGTCTTTCATCACCAGTAATCCTCACGTTTTGGCAGAGTTTTTTGCCCCT
[0162] 181TGGTGTGGTCACTGTAAGAAGTTGGGCCCTGAACTTGTTTCTGCTGCCGAGATCTTAAAG
[0163] 241GACAATGAGCAGGTTAAGATTGCTCAAATTGATTGTACGGAGGAGAAGGAATTATGTCAA
[0164] 301GGCTACGAAATTAAAGGGTATCCTACTTTGAAGGTGTTCCATGGTGAGGTTGAGGTCCCA
[0165] 361AGTGACTATCAAGGTCAAAGACAGAGCCAAAGCATTGTCAGCTATATGCTAAAGCAGAGT
[0166] 421TTACCCCCTGTCAGTGAAATCAATGCAACCAAAGATTTAGACGACACAATCGCCGAGGCA
[0167] 481AAAGAGCCCGTGATTGTGCAAGTACTACCGGAAGATGCATCCAACTTGGAATCTAACACC
[0168] 541ACATTTTACGGAGTTGCCGGTACTCTCAGAGAGAAATTCACTTTTGTCTCCACTAAGTCT
[0169] 601ACTGATTATGCCAAAAAATACACTAGCGACTCGACTCCTGCCTATTTGCTTGTCAGACCT
[0170] 661GGCGAGGAACCTAGTGTTTACTCTGGTGAGGAGTTAGATGAGACTCATTTGGTGCACTGG
[0171] 721ATTGATATTGAGTCCAAACCTCTATTTGGAGACATTGACGGATCCACCTTCAAATCATAT
[0172] 781GCTGAAGCTAACATCCCTTTAGCCTACTATTTCTATGAGAACGAAGAACAACGTGCTGCT
[0173] 841GCTGCCGATATTATTAAACCTTTTGCTAAAGAGCAACGTGGCAAAATTAACTTTGTTGGC
[0174] 901TTAGATGCCGTTAAATTCGGTAAGCATGCCAAGAACTTAAACATGGATGAAGAGAAACTC
[0175] 961CCTCTATTTGTCATTCATGATTTGGTGAGCAACAAGAAGTTTGGAGTTCCTCAAGACCAA
[0176] 1021GAATTGACGAACAAAGATGTGACCGAGCTGATTGAGAAATTCATCGCAGGAGAGGCAGAA
[0177] 1081CCAATTGTGAAATCAGAGCCAATTCCAGAAATTCAAGAAGAGAAAGTCTTCAAGCTAGTC
[0178] 1141GGAAAGGCCCACGATGAAGTTGTCTTCGATGAATCTAAAGATGTTCTAGTCAAGTACTAC
[0179] 1201GCCCCTTGGTGTGGTCACTGTAAGAGAATGGCTCCTGCTTATGAGGAATTGGCTACTCTT
[0180] 1261TACGCCAATGATGAGGATGCCTCTTCAAAGGTTGTGATTGCAAAACTTGATCACACTTTG
[0181] 1321AACGATGTCGACAACGTTGATATTCAAGGTTATCCTACTTTGATCCTTTATCCAGCTGGT
[0182] 1381GATAAATCCAATCCTCAACTGTATGATGGATCTCGTGACCTAGAATCATTGGCTGAGTTT
[0183] 1441GTAAAGGAGAGAGGAACCCACAAAGTGGATGCCCTAGCACTCAGACCAGTCGAGGAAGAA
[0184] 1501AAGGAAGCTGAAGAAGAAGCTGAAAGTGAGGCAGACGCTCACGACGAGCTTTAA
[0185] 其氨基酸序列如下：
[0186] 1MQFNWNIKTVASILSALTLA
[0187] 21QASDQEAIAPEDSHVVKLTE
[0188] 41ATFESFITSNPHVLAEFFAP
[0189] 61WCGHCKKLGPELVSAAEILK
[0190] 81DNEQVKIAQIDCTEEKELCQ
[0191] 101GYEIKGYPTLKVFHGEVEVP
[0192] 121SDYQGQRQSQSIVSYMLKQS
[0193] 141LPPVSEINATKDLDDTIAEA
[0194] 161KEPVIVQVLPEDASNLESNT
[0195] 181TFYGVAGTLREKFTFVSTKS
[0196] 201TDYAKKYTSDSTPAYLLVRP
[0197] 221GEEPSVYSGEELDETHLVHW
[0198] 241IDIESKPLFGDIDGSTFKSY
[0199] 261AEANIPLAYYFYENEEQRAA
[0200] 281AADIIKPFAKEQRGKINFVG
[0201] 301LDAVKFGKHAKNLNMDEEKL
[0202] 321PLFVIHDLVSNKKFGVPQDQ
[0203] 341ELTNKDVTELIEKFIAGEAE
[0204] 361PIVKSEPIPEIQEEKVFKLV
[0205] 381GKAHDEVVFDESKDVLVKYY
[0206] 401APWCGHCKRMAPAYEELATL
[0207] 421YANDEDASSKVVIAKLDHTL
[0208] 441NDVDNVDIQGYPTLILYPAG
[0209] 461DKSNPQLYDGSRDLESLAEF
[0210] 481VKERGTHKVDALALRPVEEE
[0211] 501KEAEEEAESEADAHDEL
[0212] 实施例3共表达分子伴侣蛋白PDI对β -甘露聚糖酶产量的影响
[0213] 1、pPICZ a A-PDI质粒线性化及双重重组毕赤酵母工程菌的构建
[0214] 大量提取实施例2步骤3构建的pPICZ a A-PDI质粒，用限制性内切酶SacI线性 化处理。反应体系和反应条件如下：
[0215] 线性化反应体系为 150 μ L :pPICZ a A-PDI 质粒（6 μ g) 10 μ L，SacI5 μ L， lOXbuffer L15y L，水120μ L。以上操作在冰上进行，混匀后在水浴锅上于37°C反应5h。 线性化的pPICZ a A-PDI质粒的回收按照生工SanPr印柱式DNA胶回收试剂盒说明书进行。
[0216] 将上述线性化的pPICZ a A-PDI质粒与80 μ L毕赤酵母感受态细胞（感受态细胞 由实施例1中所筛选获得的高表达β-甘露聚糖酶的基因工程菌制备，制备方法同实施例 1)混匀，后续方法同实施例1中的毕赤酵母的电转化。
[0217] 2、高拷贝重组子筛选
[0218] 将上述转化物涂布于YPDS+Zeocin平板，其中Zeocin浓度分别为100、250、500、 1000 μ g/mL，每块板涂布200 μ L菌悬液。于30°C，培养3-6d，至平板上长出菌落。
[0219] 3、高表达β -甘露聚糖酶毕赤酵母重组子的筛选
[0220] 分别挑取 2 中在 250 μ g/mL、500 μ g/mL、1000 μ g/mL 抗生素 Zeocin 的 YPDS+Zeocin平板长出的5-10个菌落，分别接种于装有50mLBMGY培养基的250mL三角瓶 中，于28°C，200rpm/min摇荡培养至0D600为2-6左右。4°C，2000g离心5min，收集菌体，用 BMMY重悬菌体，使0D600为1. 0。置于500mL的三角瓶中，于28°C，200rpm的摇床上继续生 长，进行诱导培养。每24h向培养基中添加无水甲醇至终浓度为0.5% (v/v)，持续诱导培 养5d。取lmL诱导培养物置于2mL离心管中，常温，12000rpm离心5min，收集上清和沉淀， 分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。用12% SDS-PAGE电泳和活性检测重组蛋白 的表达和酶活力。
[0221] 结果表明，对所长出的重组子进行诱导表达后酶活测定，筛选出一株能高表达 β -甘露聚糖酶的重组菌，酶活力为40. 0U/mL，该表达量比实施例1中未共表达PDI的重组 菌提高了 1. 5倍。
[0222] 4、基因组DNA的提取和鉴定
[0223] 提取本实施例步骤3获得的那株高表达β -甘露聚糖酶基因工程菌的基因组DNA， 提取方法按TIANGEN公司酵母基因组DNA提取试剂盒说明书进行。以所提取的基因组DNA 为模板，分别以EcoRI-MAN/NotI-MAN、PDI-F/PDI-R和5'Α0Χ1/3'Α0Χ1为引物，对重组子进 行PCR鉴定。
[0224] PCR反应体系为50yL :ddH2021 yL，上下游引物（10μΜ)各lyL，基因组DNA (模 板）2 μ L，2 X Taq PCRMasterMix25 μ L。
[0225] 以EcoRI-MAN/Notl-MAN为引物的PCR反应条件：95°C预变性3min，然后进行 95°C 30s，57°C 30s，72°C 90s，共 35 个循环，最后再 72°C延伸 7min。以 PDI-F/PDI-R 为引物 的PCR反应条件：95°C预变性3min，然后进行95°C 30s，60°C 30s，72°C 90s，共35个循环， 最后再72°C延伸7min。以5' A0X1/3' A0X1为引物的PCR反应条件：95°C预变性3min，然 后进行95°C 30s，53°C 30s，72°C 45s，共35个循环，最后再72°C延伸7min。
[0226] 反应结束后以1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。电泳结果表明，以 EcoRI-MAN/Notl-MAN为引物能扩出约1100bp大小的片段，以PDI-F/PDI-R为引物能扩出 约1500bp大小的片段，以5' A0X1/3' A0X1为引物能扩增出约1500bp和2000bp大小的片 段（图4)，与预测大小相符，表明重组子已成功整合到毕赤酵母基因组DNA中。
[0227] 5、β -甘露聚糖酶的糖基化分析
[0228] 糖基化酶活定义：在10 μ L总反应体积，37°C下lh从10 μ g核糖核酸酶去除大于 95%的糖类所需的酶量定义为一个单位。
[0229] 在KKTC，用IX糖蛋白缓冲液变性20yg糖蛋白lOmin;加1/10体积10XG5缓 冲液；加1-5 μ g Endo Η并在37°C下反应lh，反应液用12% SDS-PAGE电泳检测。
[0230] 本实施例步骤3的重组表达产物经SDS-PAGE电泳分析，结果表明，表达出来的蛋 白分子量比从氨基酸序列推断出的理论分子量（约39kDa)大6kDa，分析β-甘露聚糖酶的 氨基酸序列，发现含有两处潜在的糖基化位点，所以可能是因糖基化造成蛋白分子量偏大。 对所表达的产物进行末端去糖基化酶Endo Η去糖基化，SDS-PAGE分析表明（图5)，表达产 物去糖基化后，蛋白分子量降低，约为39kDa，与预计的酶蛋白分子量大小一致。因此可以认 为表达产物分子量比预期偏大是由于糖基化引起的。
[0231] 6、重组子最适诱导表达条件的优化和鉴定
[0232] 采用不同诱导时间（0-10d)和不同甲醇浓度（0-3% ) (v/v)对步骤3获得的重组 菌进行诱导表达。结果表明，最佳诱导表达条件为：时间7d，甲醇浓度为1.5%，酶活力达 222. 8U/mL (图6)。对诱导表达产物采用Western-blot方法进行鉴定，可见一条特异的反应 条带，而对照（未诱导表达上清液）未见任何条带（图7)，表明所获得的表达产物为β -甘 露聚糖酶。
[0233] 7、β-甘露聚糖酶酶学特性分析
[0234] (1)最适pH值和最适反应温度
[0235] a、最适反应pH值的确定：将稀释好的酶液置于不同pH值（2. 4-8. 0)的缓冲液中， 测定β -甘露聚糖酶的酶活。以最高酶活为1〇〇%，其它pH下测得的酶活与之相比，即得到 该pH下的相对酶活。最适反应pH曲线见图8。
[0236] b、最适反应温度：将稀释好的酶液置于不同温度（30-80°C )下反应，测定β -甘 露聚糖酶的酶活。以最高酶活为1〇〇%，其它温度下测得的酶活与之相比，即得到该温度下 的相对酶活。最适反应温度曲线见图9。
[0237] 从图8和图9可以看出，该重组β -甘露聚糖酶的最适pH值为4. 4,最适反应温度 为 60。。。
[0238] (2) pH值稳定性
[0239] 将酶液稀释适当倍数，在不同pH值（2. 4-8. 0)的缓冲液处理60min后，以未处理 的酶液为对照，测定β-甘露聚糖酶的相对酶活力。结果如图10所示。
[0240] 结果显示,该重组β -甘露聚糖酶的最适pH为4. 4,并且在ρΗ2. 4-8. 0范围内相对 酶活均可达到70%以上，说明该重组β -甘露聚糖酶的pH稳定性良好。
[0241] (3)温度稳定性
[0242] 将酶液稀释适当倍数，在不同温度（20°〇、301：、401：、501：、601：、701：和80°〇下 保温30min，以未处理的酶活力为对照测定重组β-甘露聚糖酶的相对酶活。结果如图11 所示。
[0243] 结果显示，该重组β -甘露聚糖酶在温度低于或等于60°C时酶活相对稳定，仍能 保持75%以上的相对酶活，但当温度超过60°C时酶活力急剧下降，80°C时仅保持10%左右 的酶活力。
[0244] 应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
[0001] _序列表_ SEQUENCE LISTING <110 申请人: <?2〇ι -种共表达伴侣蛋?提高13-甘露聚糖酶基囚表达水平的Λ法 <130> <160 12 <170 Patentln version 3. 5 <210 1 <211 25 <21^ DNA <213 MAN-F <400 1 atgaagtctc ttccagactg ccctc 25 <210 2 <211 29 <2)2 ΠΝΛ <213 MAN R <400 2 ttagngcgac tatcgcaat.a tgcagcaag 29 (210 3 (211 11Π2 <212 ΠΝΑ cn:丨 黑曲霉β甘露聚糖酶基因编码区丨克隆测序结果 (400 ；-； atgaagcttt ccaacgccct cctcaccctg gctagcctgg cgctggccaa cgtctccacg 60 gctctgccga aagcctcccc tgcaccgagc accagcagca gti?ct^cctc cacctccttc 120 gccagcacct ccggcctcca attcaccatt gatggcgaaa ctggctaclt cgccggaacg 180 aacagctact ggatcggttt cctcactgac aacgcgcacg tcgacctcgt catgggccac 240 ctgiingtcgrt ccggcctcaa gatcctccgc gtgtggggct tcancgatgt cacctcgcag 300 ccctcctccs gcacagtctg gtaccaactg caccaggacg gcaaatcgac aatcaacacs 360 ggtgccgacg gtctccagcg cctcgactac gtcgtctcgt ctgccgaaca gcacgacatc 420 aaactcatca tcaacttcpt caactactgg accgairtacg gtggtat^tc tgcgtacgts 480 agcgcgtatg gcggatccgg cgagacggat ttct^tacca gtgataccat gcagagtgcc 540 tatcagacat atatcaagac ggtcgtggap cgptacagta actcctcAffc ggtgtttgcg 600 tgggagttgg cgaatgagct gagaxgtccg agttgcaata cttctgtgtt gtataactgg 660
[0002] attgagaaga cgagtaagtt tattaagggg ttggatgcgg atcgtatggt ttgtattggt 720 ^atgagggct tcggtctcaa catcsactcg gacggcagct acccttatca attctccgag 780 ggcttgaact ttacgatgaa cctcggtatc gatactattg actttggtac cctccacttg 840 taccctgata gctggggcac ctccgacgac tggggcaacg gctggatcac cgcccacggc 900 gcagcctgca aagcggccgg caagccatgt ctcctggagg aatacgga^t cacctcgaac 960 cactgcagtg tggagggctc gtggcagaag acagcgctca gcacaacggg cgtcggcgcg 1020 gatctgttct ggcagtatgg tfiatgatttg agtaccggga agtcgccg^a tgatgggaat 1080 actatctact atggggctag tgattatcag tgcctggtga cggatcatct tgctgctatt 1140 ggtagtgelt aa 1152 (210 4 <211 383 <212 PRT <213 氨*酸序列 <400 4 Met Lys Leu Ser Asn Ala Leu Leu Thr Lea Ala Ser Leu Ala Lea Ala 1 5 10 15 Asn Val Ser Thr Ala Leu Pro Lys Ala Ser Pro Ala Pro Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Ser Ala Ala Ser Thr Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gin Phe 35 40 45 Thr 丄丄e Asp Giy (jiu Thr G_Ly Tyr Phe Aia G丄y Thr Asn Ser Tyr Trp 50 55 60 lie Gly Phe Leu Thr Asp Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His 65 70 75 80 Leu Lys Ser Ser Gly Leu Lys lie Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp 85 90 95 Val Thr Ser Gin Pro Ser Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gin Leu His Gin 100 105 110 Asp Gly Lys Ser Thr lie Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gin Arg Leu 115 120 125
[0003] Asp Tu Val Val Ser Ser Ala Glu Gin His Asp lie Lys Leu lie lie 130 135 140 Asn Phe Val Asn Tyr Trp Thr Asp Tyr Gly Gly Met. Ser Ala ?γτ Val 145 150 155 160 Ser Ala Tyr (>Ly (ily Ser Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr 165 170 175 Met Gin Ser Ala Tyr Gin Thr Tyr lie Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr 180 185 190 Ser Asn Ser Ser Ala Val. Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Leu Arg 195 200 205 Cys Pro Ser Cys Asp Thr Ser Val Leu Tyr Asn Trp lie Glu Lys Thr 210 215 220 Scr Lys Phe lie Lys Gly Leu Asp Ala Asp Arg Met Val Cys ,11c Gly 2：ii) 235 240 Asp Glu Gly Phe Gly Leu Asn He Asp Set Asp Gly Ser Tm Pro Tyr 245 250 Gin Phe Ser Glu Gly I.en Asn Phe Thr Met Asn l.en Gly Tip Asp Thr 260 265 270 lie Asp Phe Gly Thr Leu His Leu Tyr Pro Ακρ Ser Trp (；ly Thr Ser 275 280 285 Asp Asp Trp Cily Asn Gly Trp lie Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys 290 295 300 Ala Ala Gly Lys Pro Cyy Leu Leu Glu Glu Tu Gl> Val Thr Ser Asn 305 310 315 320 Eis Cys Ser Val Glu Gly Ser Trp Gin Lys Thr Ala Leu Ser Thr Thr 325 330 335 Gly Val Giy Ala Asp Leu Phe Trp Gin Tyr Gly Asp Asp Leu Scr Thr 340 345 350 Gly Lys Ser Pro Asp Asp Gly Asn Thr lie Tyr Tyr Gly Ala Ser Asp 355 360 365
[0004] Tyr Gin Cys Leu Val Thr Asp His Leu Ala Ala lie Gly Ser Ala 370 375 380 <210 5 <211 25 <212 DNA <213 EcoRI-MAN <400 5 ccggaattcc tgccgaaagc ctccc 25 <210 6 <211 33 <212 DNA <213 NotI-MAN <400 6 ataagaatgc ggccgcttaa gcactaccaa tag 33 <210 7 <211 21 <212 DNA <213. 5' A0X1 <400 7 gactggttcc aattgacaag c 21 <210 8 <211 21 <212 DNA <213 3' AQX1 <400 8 gcaaatggca ttctgacatc c 21 <210. 9 <211 37 <212： DNA <213 PDI-F <400. 9 ccggaattca tgcaattcaa ctggaatatt aaaactg 37 <210 10 <211 29 <212 DNA <213 PDI-R <400/ 10 gctctagatt aaagctcgtc gtgagcgtc 29
[0005] <210 11 <211 1554 <212 DNA <213 毕赤酵母PDI基_编码区与pPICZ α Λ连接克隆测序结果 <400 11 atgcaattca actggaatat taaaactgtg gcaagtattt tgtccgctct cacactagca 60 caagcaagtg atcaggaggc tattgctcca gaggactctc atgtcgtcaa attgactgaa 120 gccacttttg agtctttcat caccagtaat cctcacgttt tggcagagtt ttttgcccct 180 tggtgtggtc actgtaagaa gttgggccct gaacttgttt ctgctgccga gatcttaaag 240 gacaatgagc aggttaagat tgctcaaatt gattgtacgg aggagaagga attatgtcaa 300 ggctacgaaa ttaaagggta tcctactitg aaggtgttcc atggtgaggt tgaggtccca 360 agtgactatc aaggtcaaag acagagccaa agcattgtca gctatatgct aaagcagagt 420 ttaccccctg tcagtgaaat caatgcaacc aaagatttag acgacacaat cgccgaggca 480 aaagagcccg tgattgtgca agtactaccg gaagatgcat ccaacttgga atctaacacc 540 acattttacg gagttgccgg tactctcaga gagaaattca cttttgtctc cactaagtct 600 actgattatg ccaaaaaa七a cactagcgac tcgactcctg cctatttgct tgtcagacct 660 ggcgaggaac ctagtgttta ctctggtgag gagttagatg agactcattt ggtgcactgg 720 attgatattg agtccaaacc tctatttgga gacattgacg gatccacctt caaatcatat 780 gctgaagcta acatcccttt agcctactat ttctntgaga acgaagaaca acgtgctgct 840 gctgccgata ttattaaacc ttttgctaaa gagcaacgtg gcaaaattaa ctttgttggc 900 ttagatgccg ttaaattcgg taagcatgcc aagaacttaa acatggatga agagaaactc 960 cctctatttg tcattcatga tttggtgagc aacaagaagt ttggagttcc tcaagaccaa 1020 gaattgacga acaaagatgt gaccgagctg attgagaaat tcatcgcagg agaggcagaa .1080 ccaattgtga aatcagagcc aattccagaa attcaagaag agaaagtctt caagctagtc 1140 ggaaaggccc acgatgaagt tgtcttcgat gaatctaaag atgttctagt caagtactac 1200 gccccttggt gtggtcactg taagagaatg gctcctgctt atgaggaatt ggctactctt 1260 tacgccaatg atgaggatgc ctcttcaaag gttgtgattg caaaacttga tcacactttg 1320 aacgriLgtcg cicaacgtlga lat Lcciaggt laicctactl tgatcclLla Iccagclggl 1380 gataaatcca atcctcaact gtatgatgga tctcgtgacc tagaatcatt ggctgagttt 1440 gtaaaggaga gaggaaccca caaagtggat gccctagcac tcagaccagt cgaggaagaa 1500
[0006] aaggaagctg aagaagaagc tgaaagtgag gcagacgctc acgacgagct ttaa 1554 <210- 12 <211 517 <212 PRT <213 氨基酸序列 <400 12 Met Gin Phe Asn Trp Asn lie Lys Thr Val Ala Ser lie Leu Ser Ala 1 5 10 15 Leu Thr Leu Ala Gin Ala Ser Asp Gin Glu Ala lie Ala Pro Glu Asp 20 25 30 Ser His Val Val lys Leu Thr GLu Ala Thr Phe Glu Ser Phe He Thr 35 40 4S Ser Asn Pro His Val Leu Ala Glu Phe Phe Ala Pro Trp Cys Gly His 50 55 60 Cys Lys Lys Leu Gly Pro Glu Lea Val Ser Ala Ala Glu lie Leu Lys 65 70 75 80 Asp Asn Glu Crln Val Lys lie Ala Gin lie Asp Cys Thr Glu Glu Lys 85 90 95 Glu Leu Cys Gin Gly Tyr Glu lie Lys Gly Tyr Pro Thr Leu Lys Val 100 105 110 Phe His Gly G丄u Va丄 G丄u Va丄 Pro Ser Asp Tyr Gin G_Ly (i_Ln Arg Gin 115 120 125 Ser Gin Ser lie Val Ser Tyr Met Leu Lys Gin Ser Leu Pro Pro Val 130 135 140 Ser Glu IJe Asn Ala Thr Lys Asp Leu Asp Asp Thr lie Ala Glu AJa 145 150 155 160 Lys Glu Pro Val lie Val Gin Val Leu Pro Glu Asp Ala Ser Asn Leu 165 170 175 Glu Ser Asn Thr Thr Phe Tyr Gly Val Ala Gly Thr Leu Arg Glu Lys 180 185 190
[0007] Phe Thr Phe Val Ser Thr Lys Ser Thr Asp Tyr Ala Lys Lys Tyr Thr 195 200 ^05 Ser Asp Ser Thr Pro Ala Tyr Leu Leu Val Arg Pro Gly Glu Glu Pi-〇 210 215 220 Ser Val Tyr Ser Gly Glu Glu Leu Asp Glu Thr His Leu Val His Trp 225 230 235 240 lie Asp lie Glu Ser Lys Pro Leu Phe Gly Asp lie Asp Gly Ser Thr 245 250 255 Phe Lys Ser Tyr Ala. 01 u Ala Asn Tie Pro Leu Ala Tyr Tyr Phe Tyr 260 265 2T0 Glu /Vsn Glu Glu Gin Arg A丄a Ala Ala Ala Asp lie He Lys Pro Phe 27^ 280 285 Ala Lys Glu Gin Arg Gly Lys lie Asn Phe Val Gly Leu Asp Ala Val 290 295 300 Lys Phe Gly Lys His Ala Lys Asn Leu Asn Mel Asp Glu Glu Lyy Leu 305 310 315 320 Pro Leu Phe Val lie His Asp Leu Val Ser Asn Lys l,ys Phe Gly Val 325 330 335 Pro Gin Asp (i丄n Glu Leu Thr Asn Lys Asp Va丄 Thf (i_Lu Leu 丄丄e (i丄u 340 345 350 Lys Fhe lie Ala Cily (ilu Ala Glu Pro He Vral Lys Ser (ilu Pro lie 355 360 365 Pro Glu lie Gin Glu Glu Lys Val Phe Lys Leu Val Gly Lys Ala His 370 375 380 Asp Glu Val Val Phe Asp Glu Ser Lys Asp Val Leu Val Lys Tyr Tyr 385 390 395 400 Ala Pro Trp Cys Gly His Lys Arg Met Ala Pro Ala Tfr Glu Glu 405 410 415 Leu A.la Thr Leu Tyr Ala Asn Asp Glu Asp Ala Ser Ser Lys Val Val 420 425 430
[0008] lie Ala Lys Leu Asp His Thr Leu Asn Asp Val Asp Asn Val Asp lie 435 440 445 Gin Gly Tyr Pro Thr Leu lie Leu Tyr Pro Ala Gly Asp Lys Ser Asn 450 455 460 Pro Gin Leu Tyr Asp Gly Ser Arg Asp Leu Glu Ser Leu Ala Glu Phe 465 470 475 480 Val Lys Glu Arg Gly Thr His Lys Val Asp Ala Leu Ala Leu Arg Pro 485 490 495 Val Glu Glu Glu Lys Glu Ala Glu Glu Glu Ala Glu Ser Glu Ala Asp 500 505 510 Ala His Asp Glu Leu 515
【权利要求】
1. 一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法，其特征在于，其步 骤如下： (1) 黑曲霉β-甘露聚糖酶基因编码区的克隆及其在毕赤酵母中的表达 提取黑曲霉总RNA，将其反转录成CDNA;根据已知的丝状真菌β-甘露聚糖酶基因编 码区序列，设计一对简并引物，设计的引物为：上游引物MAN-F :5' -ATGAAG(T/C)T(C/T) TCCA (G/A) C (T/G) CCCTC-3，，下游引物 MAN-R : 5，-TTA (G/A) GC (G/A) CTA (T/C) (G/C) AATA (T/ G)CAGCAAG-3,； ?〇?反应体系为5(^1^:(1(1!12019 4 1^，1(^]\1上下游引物各14 1^，模板〇0嫩4 4 1^，2\丁&9 PCR MasterMix25y L ;PCR 反应条件均为 95°C 预变性 3min，然后进行 95°C 30s，52°C 30s， 72°C 90s，共35个循环，最后再72°C延伸7min ;切胶回收PCR产物并将其克隆至T载体上； 对所获得的β-甘露聚糖酶进行信号肽分析，将β-甘露聚糖酶成熟肽编码序列克隆至毕 赤酵母表达质粒PPIC9K上，构建成pPIC9K-MAN质粒并实现其在毕赤酵母中的表达，并筛选 一株能高表达β-甘露聚糖酶的重组菌； (2) 伴侣蛋白PDI基因编码区的克隆及pPICZ a A-PDI质粒的构建 将伴侣蛋白PDI基因编码区的序列插入到pPICZ α Α质粒中，构建成pPICZ a A-PDI质 粒； (3) 共表达分子伴侣蛋白PDI对β -甘露聚糖酶产量的影响 转化pPICZ αΑ-PDI质粒到表达β-甘露聚糖酶的重组菌中，诱导表达β-甘露聚糖 酶，并对其表达条件进行优化，同时鉴定表达产物并分析表达产物的酶学性质。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（3)中，所述优化的表达条件是：诱导 表达时间为7d，甲醇的体积浓度为1. 5%。
【文档编号】C12N9/42GK104046645SQ201410258050
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月11日 优先权日:2014年6月11日
【发明者】陈小玲, 黄志清, 周波, 徐孟 申请人:四川农业大学