一种光可控atp生物合成体系及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种光可控ATP生物合成体系及其制备方法。该方法包括如下步骤：(1)制备光系统Ⅱ微球或光系统Ⅱ胶囊；(2)将所述光系统Ⅱ微球或所述光系统Ⅱ胶囊分散到含有二醛交联剂的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中进行吸附；然后继续分散于含有光系统Ⅱ的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中进行吸附；(3)将经步(2)处理后的光系统Ⅱ微球或光系统Ⅱ胶囊分散到含有ATP合成酶的蛋白脂质体溶液中进行吸附，即得到所述光可控ATP生物合成体系。本发明中，光系统II在3D(微纳米球和微纳米胶囊)表面固定，增大作用面积和适用性；尺寸、结构和功能可调控：可根据实际需要，通过选择不同的合成方法任意改变球或胶囊的尺寸、结构并包裹额外的功能性囊壁成分。
【专利说明】一种光可控ATP生物合成体系及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种ATP合成体系及其制备方法，具体涉及一种光可控ATP生物合成 体系及其制备方法。
【背景技术】
[0002] ATP是生物体内的"能量货币"，在能量代谢过程中有重要作用。它为细胞内的多 种耗能过程提供能量并参与调控多种生化过程，如神经传导、新陈代谢、肌肉收缩、生物发 光和物质运输等等。由于其多样化的功能，如果能在亚细胞水平上模拟细胞中ATP的可控 合成，就将能够实现对多种生物过程的精细控制和研究。
[0003] 在生物体内ATP是由ATP合酶催化合成的。利用ATP合酶构建仿生体系的组装结 构就可以实现在人工载体上ATP合成的精细化控制，从而不仅能够为由ATP驱动的纳米杂 化器件（如分子马达）提供动力，也可以为耗能的生化过程提供能量。细胞内ATP的合成 至少需要两个必要条件：嵌在闭合膜中的ATP合酶、膜两侧存在质子梯度。因此，对ATP仿 生合成过程的研究主要集中于如何在膜两侧构建质子动力势以推动ATP合酶的旋转。
[0004] 质子动力势的来源主要有以下两种：利用酸碱度不同的缓冲液直接形成和诱导体 系自身发生酸碱变化。体系自身发生变化又分为底物响应（如葡萄糖氧化酶催化葡萄糖分 解产生葡萄糖酸）和光响应两种。其中光响应由于其无需在反应体系中外加溶液、对体系 干扰小、适用于封闭体系、光刺激易于添加和终止、适于长时间实验、在空间范围易控制等 优势受到研究人员的关注。目前，光响应产生质子梯度的研究集中于嵌在膜内的质子泵细 菌视紫红质和色素衍生物类小分子化合物。
[0005] 光系统II是一种光响应的蛋白复合物，它能够吸收传递转换光能，分解水产生质 子。它的活性功能的维持不完全依赖于嵌在膜内，因此大大扩展了光响应产生质子梯度的 研究和应用。目前尚无利用光系统II蛋白作质子来源推动ATP合成的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种光可控ATP生物合成体系及其制备方法，在光照下，本 发明提供的ATP生物合成体系可产生ATP。
[0007] 本发明所提供的光可控ATP生物合成体系的制备方法，包括如下步骤：
[0008] (1)制备光系统II微球或光系统II胶囊；所述光系统II微球为光系统II微米球或 光系统II纳米球，所述光系统II胶囊为光系统II微米胶囊或光系统II纳米胶囊；
[0009] (2)将所述光系统II微球或所述光系统II胶囊分散到含有二醛交联剂的2-(N-吗 啡啉）乙磺酸缓冲液中进行吸附；然后继续分散于含有光系统II的2-(N-吗啡啉）乙磺酸 缓冲液中进行吸附；
[0010] (3)将经步（2)处理后的光系统II微球或光系统II胶囊分散到含有ATP合成酶的 蛋白脂质体溶液中进行吸附，即得到所述光可控ATP生物合成体系。
[0011] 通过所述方法，通过交联剂中醛基的作用，形成了西佛碱的结构，从而将光系统II 和ATP连接起来。
[0012] 上述的制备方法中，所述光系统II微米球的粒径为1?20μπι，如2μ-- ;
[0013] 所述光系统II纳米球的粒径为200?900nm，如500nm ;
[0014] 所述光系统II微米胶囊的粒径为1?20 μ m，如5 μ m ;
[0015] 所述光系统II纳米胶囊的粒径为200?900nm。
[0016] 上述的制备方法中，所述二醛交联剂可为戊二醛、氧化海藻酸钠、氧化肝素或氧化 纤维素，所述氧化海藻酸钠、所述氧化肝素和所述氧化纤维素均能通过高碘酸氧化得到，即 将海藻酸钠、肝素或纤维素中的羟基氧化成醛基。
[0017] 上述的制备方法中，步骤⑵中，所述2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液的pH值可为 5?8,如6, 2-(N_吗啡啉）乙磺酸的摩尔浓度可为10?100mmol/L。
[0018] 上述的制备方法中，步骤（2)中，所述含有二醛交联剂的2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓 冲液中，所述二醛交联剂的质量百分含量可为0.001?0.5%，如0.025% ;
[0019] 所述含有光系统II的2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液中，所述光系统II的浓度可为 0· 01 ?lmg chl/mL,如 0· 3 ?0· 5mg chl/mL、0. 3mg chl/mL 或 0· 5mg chl/mL。
[0020] 上述的制备方法中，步骤（3)中，所述含有ATP合成酶的蛋白脂质体溶液中，所述 ATP合成酶的摩尔浓度可为20?500nmol/L，具体可为100?200nmol/L、150?200nmol/ L、100nmol/L、150nmol/L或200nmol/L，蛋白脂质体的浓度可为1?10mg/mL，具体可为2? 8mg/mL、5 ?8mg/mL、2mg/mL、5mg/mL 或 8mg/mL〇
[0021] 上述的制备方法中，步骤（1)中，在制备所述光系统II微球或所述光系统II胶囊 的过程中添加蛋白质、聚合物、明胶、胶原、透明质酸或海藻酸钠，以利于长时间维持蛋白活 性，如在制备过程中添加牛血清蛋白。
[0022] 本发明的制备方法中，所用的光系统II为一种能够吸收光能催化水分解产生质 子的反应中心蛋白，具体可为光系统II核心复合物或富含光系统II的类囊体膜；具体可来 自于蓝藻、菠菜、莴苣等植物。
[0023] 本发明提供的制备方法还包括重复步骤（2)至少一次的步骤。
[0024] 本发明进一步提供了由上述方法制备得到的光可控ATP生物合成体系。
[0025] 所述光可控ATP生物合成体系含有ADP。
[0026] 本发明提供的光可控ATP生物合成体系可用于产生ATP，具体在光照下进行，如在 采用的光源为氙灯或白炽灯，具体可为单色光或复合光。
[0027] 本发明具有如下优点：
[0028] (1)质子梯度来源为光系统II分解水产生的质子，与现有方法不同；
[0029] (2)光系统II在3D (微纳米球和微纳米胶囊）表面固定，增大作用面积和适用性；
[0030] (3)尺寸、结构和功能可调控：可根据实际需要，通过选择不同的合成方法任意改 变球或胶囊的尺寸、结构并包裹额外的功能性囊壁成分；
[0031] (4)可自发荧光：由于囊壁成分之间形成了西佛碱的化学键，因而可自发荧光；
[0032] (5)可长时间保存：保存30天以上体系分散性良好，仍维持光照产生ATP的能力。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1为实施例1制备的PSII微球的透射电镜照片。
[0034] 图2为实施例1制备的PSII微球的激光共聚焦显微图。
[0035] 图3为实施例1制备的PSII微球-ATP合酶体系在光照下产生ATP的数据图。
【具体实施方式】
[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038] 下述实施例中所用的光系统II的提取方法如下：
[0039] 取新鲜菠菜叶，洗净，4°C下放置。在搅拌机中把菠菜叶搅拌成米粒大小，用纱布过 滤。取滤液离心，收集叶绿体，放入低渗溶液（20mMTricine，50mMNaCl，5mMMgCl 2，pH8. 0)中 涨破，搅拌离心，取沉淀物用高渗缓冲液（0. 4M蔗糖，20mM MES，50mM NaCl，5mM MgCl2, pH6. 5) 洗漆，勻楽至2mg chl/mL。滴加20% Triton X-100,搅拌处理30分钟，离心，取沉淀，反复 洗涤去除多余Triton X-100,所得则为富含光系统II的类囊体膜。
[0040] 下述实施例中所用的ATP合成酶的提取方法如下：
[0041] 取新鲜菠菜叶，洗净，4°C下放置。在搅拌机中把菠菜叶搅拌成米粒大小，用纱布过 滤。取滤液离心，收集叶绿体，放入低渗溶液（20mMTricine，50mMNaCl，5mMMgCl 2, pH8. 0) 中涨破，搅拌离心，取沉淀物用高渗缓冲液（0. 4M鹿糖，20mM Tricine，50mM NaCl，5mM MgCl2， pH7. 0)洗漆，勻楽至5mg chl/mL。加入等体积提取缓冲液（20mM Tricine，20mM NaCl，5mM MgCl2,60mM辛基葡萄糖苷，pH7. 0)，4°C下搅30分钟，离心取上清液，加入硫酸铵粉末，离心 收集沉淀，分散沉淀物得粗蛋白溶液，把粗蛋白溶液在浓度依次为60 %、52 %、44 %、36 %、 28 %和20%的蔗糖密度梯度溶液中离心分离，则得到ATP合成酶溶液。
[0042] 实施例1、制备光系统II/ATP合酶组装体系
[0043] (1)共沉淀制备光系统II凝胶微球
[0044] (a)用二次水配置0. 33M的氯化钙和碳酸钠溶液，等体积混合，同时加入用20mmol MES (2-(N-吗啡啉）乙磺酸）缓冲液（pH值为6)配制的20mg/mL的BSA (牛血清蛋白）溶 液0. 5mL及2mg/mL的光系统II溶液0. 5mL，迅速混合均匀搅拌40s，静置2min，离心收集得 到BSA和光系统II共沉淀的碳酸钙微球。
[0045] (b)把碳酸钙微球分散在含0· 025wt % GA (戊二醛）的MES (2- (N-吗啡啉）乙磺 酸）溶液中，交联3h，离心洗涤，用0. 1M EDTA去除模板碳酸钙粒子；继续分散在含0. 3mg chl/mL光系统II的MES溶液中，交联3h.
[0046] (c)离心洗涤后，重复步骤（b)，再在小球外层交替交联一层GA和光系统II即得 到BSA/PSII/GA共价交联的凝胶小球，直径为2微米左右。将小球分散在缓冲液中4°C保 存。以上步骤均在暗中和4°C中进行。
[0047] 该步骤制备的BSA/PSII/GA共价交联的凝胶小球的透射电镜照片如图1所示，激 光共聚焦显微图如图2所示，由两图可知，本实施例制备的微球结构均匀，分散性好，有自 荧光性质（通过共聚焦显微镜观察在无外加荧光剂的情况下仍有荧光则可说明是有自荧 光）。
[0048] (2)制备含ATP合酶的蛋白脂质体
[0049] 把提取得到的ATP合成酶溶液与去垢剂溶液10% Triton-100和缓冲液混合，加入 500 μ L10mg/mL的脂质体溶液中，4°C搅拌lh，随后依次加入Bio-beads (生物珠子）室温搅 拌lh，重复3次，即得到蛋白脂质体溶液，液氮中保存。ATP合成酶的终浓度为200nM，蛋白 脂质体的终浓度为8mg/mL。
[0050] (3)制备光系统II/ATP合酶组装体系
[0051] 把步骤（1)制备的光系统II凝胶微球分散到步骤（2)制备的蛋白脂质体溶液中， 震荡均匀，吸附40min，4°C离心洗涤。加入含5mM ADP和10mM NaH2P04的MES溶液至终体积 为2mL,在室温下暗置lh。
[0052] 本实施例制备的光系统II/ATP合酶组装体系的活性测定：
[0053] 将本实施例制备的光系统II/ATP合酶组装体系置于经5cm水浴和红光滤片处理 的氙灯光源前光照。在光照的不同时间点，从体系中取出i〇yL的样品，加入到荧光素-荧 光素酶ATP测量体系（ENLITENATPAssaySystem)中，用发光仪测量发光信号，从而计算出 体系中ATP的含量，结果如图3所示。由图3可以看出，与非光照样品相比较，光照后本发 明的体系中ATP浓度持续上升，实现了光响应的ATP仿生合成，证明本发明的系统II/ATP 合酶组装体系能够产生ATP。
[0054] 将本实施例制备的光系统II/ATP合酶组装体系在4°C下避光放置30天后，取出按 上述方法测量其活性，观察到光照后ATP的产量维持了 50%。
[0055] 实施例2、制备光系统II/ATP合酶组装体系
[0056] (1)制备光系统II微胶囊
[0057] 将粒径为5微米的碳酸锰粒子分散到含有0. 2M氯化钠的2mg/mL聚丙烯酰胺的溶 液中吸附30min后，离心分离，充分洗涤，再分散到含有0. 025Wt% GA的溶液中，反应3h，充 分洗涤，再分散到含有〇. 5mg/mL光系统II、2mg/mL BSA的40mmol MES缓冲溶液（pH = 6) 中，振汤吸附4h，GA上的基与蛋白的氣基反应，从而把蛋白固定在微粒表面，完成了 ^ 组装周期，依次重复吸附GA、光系统II的操作，直到所需的层数。用0. 1M EDTA去除模板碳 酸锰粒子，即得到BSA/PSII/GA共价交联的直径为5微米的微胶囊。微胶囊分散在缓冲液 中4 C保存。
[0058] (2)含ATP合成酶的蛋白脂质体的制备同实施例1中步骤（2)，所不同的是ATP合 成酶的终浓度为150nM，蛋白脂质体的终浓度为5mg/mL。
[0059] (3)制备光系统II/ATP合酶组装体系
[0060] 实施例制备的光系统II/ATP合酶组装体系的活性测定：
[0061] 同实施例1中，不同之处在于：光源为氙灯光源经过680nm带通滤光片过滤。结果 表明：随着光照时间的增长，本实施例制备的光系统II/ATP合酶组装体系持续产生ATP。
[0062] 实施例3、制备光系统II/ATP合酶组装体系
[0063] (1)制备光系统II微球
[0064] 将粒径为500nm的二氧化硅粒子分散到含0. 2M氯化钠的lmg/mL聚丙烯酰胺的溶 液中吸附30min后，离心分离，充分洗涤，再分散到含有0. 025Wt% GA的溶液中，反应3h，充 分洗涤，再分散到含有〇. 5mg/mL光系统II、2mg/mL BSA的40mmol MES缓冲溶液（pH = 6) 中，振荡吸附4h，完成了一个组装周期，依次重复吸附GA、光系统II的操作，直到所需的层 数。纳米二氧化硅粒子是生物相容的，对质子无影响，可不除核。得到了直径为500nm左右 的微球。小球分散在缓冲液中4°C保存。
[0065] (2)含ATP合酶的蛋白脂质体的制备同实施例1中步骤（2)，所不同的是ATP合成 酶的终浓度为ΙΟΟηΜ，蛋白脂质体的终浓度为2mg/mL。
[0066] (3)制备光系统II/ATP合酶组装体系
[0067] 实施例制备的光系统II/ATP合酶组装体系的活性测定：
[0068] 同实施例1中，不同之处在于：光源为红光单色光源。结果表明：随着光照时间的 增长，实施例制备的光系统Π /ATP合酶组装体系持续产生ATP。
【权利要求】
1. 一种光可控ATP生物合成体系的制备方法，包括如下步骤： (1) 制备光系统II微球或光系统II胶囊；所述光系统II微球为光系统II微米球或光系 统II纳米球，所述光系统II胶囊为光系统II微米胶囊或光系统II纳米胶囊； (2) 将所述光系统II微球或所述光系统II胶囊分散到含有二醛交联剂的2-(N-吗啡 啉）乙磺酸缓冲液中进行吸附；然后继续分散于含有光系统II的2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓 冲液中进行吸附； (3) 将经步（2)处理后的光系统II微球或光系统II胶囊分散到含有ATP合成酶的蛋白 脂质体溶液中进行吸附，即得到所述光可控ATP生物合成体系。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述光系统II微米球的粒径为1? 20 μ m ； 所述光系统II纳米球的粒径为200?900nm ; 所述光系统II微米胶囊的粒径为1?20μπι; 所述光系统II纳米胶囊的粒径为200?900nm。
3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述二醛交联剂为戊二醛、氧化 海藻酸钠、氧化肝素或氧化纤维素。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤（2)中，所述 2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液的pH值为5?8, 2-(N-吗啡啉）乙磺酸的摩尔浓度为10? 100mmol/L〇
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤（2)中，所述含有二 醛交联剂的2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液中，所述二醛交联剂的质量百分含量为0. 001? 0. 5% ； 所述含有光系统II的2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液中，所述光系统II的浓度为0. 01? lmg chl/mL〇
6. 根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤（3)中，所述含有 ATP合成酶的蛋白脂质体溶液中，所述ATP合成酶的摩尔浓度为20?500nmol/L，蛋白脂质 体的浓度为1?10mg/mL。
7. 根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤（1)中，在制备所述 光系统II微球或所述光系统II胶囊的过程中添加蛋白质、聚合物、明胶、胶原、透明质酸或 海藻酸钠。
8. 权利要求1-7中任一项所述方法制备的光可控ATP生物合成体系。
9. 权利要求8所述的光可控ATP生物合成体系在产生ATP中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述应用在光照下进行；所述光照所用 的光源为氙灯或白炽灯。
【文档编号】C12P19/32GK104059954SQ201410264588
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】李峻柏, 冯熙云, 蔡鹏 , 贾怡, 费进波, 董伟光, 李洁龄 申请人:中国科学院化学研究所