一种构建高产5-氨基乙酰丙酸大肠杆菌工程菌株的方法
【专利摘要】本发明公开了一种构建高产5-氨基乙酰丙酸大肠杆菌工程菌株的方法，属于代谢工程和微生物发酵领域。本发明在使用载体pACYCDuet-1过量表达5-氨基乙酰丙酸C5合成途径关键酶谷氨酰-tRNA还原酶和谷氨醛氨基转移酶的基础上，将来源于大肠杆菌血红素生物合成途径中的尿卟啉原III合酶(uroporphyrinogen?III?synthase,UROS,hemD编码)及粪卟啉原III氧化酶(coproporphyrinogen?III?oxidase,CPO,hemF编码)，使用pCDFDuet-1单独表达或共表达两个酶基因，构建重组菌株。通过发酵验证，单独表达hemD或hemF以及共表达hemD和hemF，ALA产量均明显提高。
【专利说明】一种构建高产5-氨基乙酰丙酸大肠杆菌工程菌株的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种构建高产5-氨基乙酰丙酸大肠杆菌工程菌株的方法，属于代谢工程和微生物发酵领域。
【背景技术】
[0002]5_ 氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA),分子式为 C5O3NH9,分子量为131.13,熔点为149-151°C,它是生物体合成叶绿素、血红素、维生素B12等的关键前体物质。ALA作为一种安全、选择、渗透性好的光动力学药物在医学领域逐渐受到重视，已经成功应用于皮肤癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的诊断和光动力治疗中。另外，ALA作为一种环境相容性及选择性很高的新型光活化农药，在农药领域应用非常广泛，如作为一种无公害的绿色农药、除草剂以及植物生长调节剂等。
[0003]目前，ALA合成主要采用化学法合成，最早出现在上世纪50年代，直到20世纪90年代，相关研究才大量开展，并取得了一定的成绩。但是由于化学合成反应步骤繁琐，副产物多，分离提纯困难，ALA的得率也较低，并且环境污染严重等问题，近年来，微生物发酵生产ALA已成为研究的热点。自然界中，ALA的生物合成存在两条途径，一条是C4途径，由
5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS，hemA编码)催化琥珀酰-CoA和甘氨酸生成ALA的一步酶促反应组成，主要存在于一些光合细菌、真菌以及动物体内。另外一条是C5途径，首先谷氨酸在谷氨酰-tRNA合成酶(GluRS，gltX编码)催化下，生成谷氨酰_tRNA，然后，谷氨酰-tRNA在谷氨酸-tRNA还原酶(GluTR, hemA编码)作用下生成谷氨酸-1-半醒(GSA),最后GSA由谷氨酸-1-半醛_2，1-氨基转移酶(GSA-AM，hemL编码)催化生成ALA。该途径广泛存在于植物、藻类以及细菌(如大肠杆菌)中。
[0004]早期，人们筛选到产ALA的光合细菌类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides),通过诱变育种法对其进行诱变，筛选ALA的高产菌株，并通过发酵优化等使得ALA的产量达到
7.2g/L。但由于光合细菌的特殊性，其成本较高，不适合大规模的工业化生产。目前以C4途径为基础的生物转化由于添加前体琥珀酸和甘氨酸生产ALA成本相对较高。
[0005]本发明在系统阐述分析大肠杆菌中C5途径(图1)调控机制，及表达5-氨基乙酰丙酸C5合成途径关键酶基因hemL和hemA基础上，进一步表达来源于大肠杆菌血红素生物合成途径基因hemD及hemF，实现了 ALA产量的进一步提高，且发酵周期明显缩短，降低了生产成本。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的第一个技术问题是提供一种高产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株，其在表达C5途径关键基因hemL(编码谷氨醛氨基转移酶)和hemA(编码谷氨酰-tRNA还原酶)的基础上，共表达来源于大肠杆菌的尿卟啉原III合酶(hemD编码)和/或粪卟啉原III氧化酶(hemF编码)。
[0007]所述hemL的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。[0008]所述hemA的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]所述hemD的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0010]所述hemF的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0011]所述大肠杆菌优选DH5a、JM109、W3110 或 BL21 (DE3)。
[0012]所述大肠杆菌进一步优选BL21 (DE3)。
[0013]所述hemL与hemA优选以pACY⑶uet_l表达载体进行共表达，得到表达载体PACYCDu e t-1_hemLA。
[0014]表达hemD或hemF时，优选将hemD或hemF基因分别通过酶切位点Nde1、XhoI连接 pCDFDuet-1,得到重组表达载体 pCDFDuet-1-hemD 或 pCDFDuet-1-hemF。
[0015]表达hemD和hemF时，可以共用一个表达载体。优选将hemD与pCDFDuet-1-hemF连接。进一步优选通过酶切位点BamHI和PstI与p⑶FDuet-1-hemF连接,得到重组表达载体 pCDFDuet-1-hemD-hemF。
[0016]本发明还提供一种构建所述大肠杆菌工程菌株的方法，利用pACY⑶uet-Ι表达hemL和hemA，以pCDFDuet-Ι表达来源于大肠杆菌的尿卟啉原III合酶(hemD编码)和/或粪卟啉原III氧化酶(hemF编码)，获得高产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株。
[0017]具体包括以下步 骤:
[0018]将来源于大肠杆菌的基因hemL与来源于伤寒沙门氏菌的基因hemA通过扩增利用酶切位点BamHI和PstI连接表达载体pACYCDuet-1，获得hemL与hemA基因的共表达载体pACY⑶uet-1-hemLA。将来源于大肠杆菌的hemD和hemF基因通过扩增利用酶切位点NdeI和XhoI连接表达载体pCDFDuet-Ι中，分别得到载体pCDFDuet-1-hemD和pCDFDuet-1-hemF。同时将hemD基因与经BamHI和PstI双酶切的质粒pCDFDuet-hemF连接，得到质粒 pCDFDuet-1-hemD-hemF。
[0019]将构建的重组质粒pACYCDuet-1-hemLA 与 pCDFDuet-1-hemD 共转化 Ε.coliBL21 (DE3)，获得重组菌 LAD ;将构建的重组质粒 pACYCDuet-1-hemLA 与 pCDFDuet-1-hemF共转化E.coli BL21 (DE3)，获得重组菌LAF ;将构建的重组质粒pACYCDuet-1-hemLA与pCDFDuet-hemD-hemF 共转化 E.coli BL21 (DE3)，获得重组菌 LADF。
[0020]本发明要解决的第三个技术问题是应用所述大肠杆菌工程菌发酵生产ALA。
[0021 ] 所述大肠杆菌工程菌优选:
[0022]LAD:E.coli BL21 (DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemD 或
[0023]LAF:Ε.coli BL21 (DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemF 或
[0024]LADF:E.coli BL21 (DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemD-hemF。
[0025]所述发酵生产ALA涉及的培养基优选:
[0026]斜面培养基(g/L):蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，琼脂20，pH7.0 ；
[0027]种子培养基(g/L):蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，ρΗ7.0，装液量20mL/250mL ；
[0028]发酵培养基(g/L): (NH4)2S0415, ΚΗ2Ρ045.0, Na2HPO4.12H2015, MgSO4.7Η201.0，酵母提取物(Yeast extract) 1.0,葡萄糖 20, pH7.0。
[0029]所述发酵生产ALA的培养条件优选:
[0030]菌种培养:甘油管划线，然后挑取单菌落划线平板37°C培养，作为种子来源；
[0031]种子培养:平板挑取菌体，37°C，200r/min，根据要求添加氯霉素34μ g/mL，链霉素100 μ g/mL，培养约12h，转接发酵培养基；
[0032]发酵培养:以2%接种量转接，Oh时添加0.1-0.5mMIPTG诱导基因表达，根据需要添加氯霉素(34 μ g/mL)以及链霉素(100 μ g/mL)，30-37°C，200r/min 培养，周期 28_36h。
[0033]本发明在表达C5途径关键基因hemL和hemA的基础上，共表达ALA代谢途径的下游基因hemD和/或hemF，取得了意料不到的技术效果:所得大肠杆菌工程菌株LADF在3L发酵罐中能够积累5-氨基乙酰丙酸1800mg/L，有效地利用C5途径促进5-氨基乙酰丙酸的合成，从而实现微生物发酵法直接发酵葡萄糖合成5-氨基乙酰丙酸，缩短发酵周期、降低生产成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1:大肠杆菌中ALA C5合成途径。
[0035]图2:重组质粒构建酶切电泳图；M:DL 5000Marker ；A:pACYCDuet-hemLA ；B:pCDFDuet-hemD ；C:pCDFDuet_hemF ;D，E:pCDFDuet-hemD_hemF。
[0036]图3:重组菌摇瓶发酵 ALA 产量；LA:E.coli BL21 (DE3)pACYCDuet-hemLApCDFDuet-1 ；LAD:E.coli BL21 (DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemD ；LAF:E.coliBL21(DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemF ；LADF:E.coli BL21(DE3)pACYCDuet-hemLApCDFDuet-hemD-hemF。
[0037]图4:重组菌 LADF 发酵过程曲线图；LADF:E.coli BL21 (DE3)pACYCDuet-hemLApCDFDuet-hemD-hemF。
【具体实施方式】
[0038]ALA分析方法:采用Mauzerall和Granick的分光光度法:将样品稀释至2mL,加入ImL的乙酸盐缓冲液,0.5mL的乙酰丙酮,然后煮沸15min。冷却至室温,取2mL的反应液至新管中，然后加入2mL的改良Ehrlich’s试剂,反应20min,利用分光光度计554nm下检测。
[0039]培养基:
[0040]斜面培养基(g/L):蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，琼脂20，ρΗ7.0 ；
[0041]种子培养基(g/L):蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，ρΗ7.0，装液量20mL/250mL ；
[0042]发酵培养基(g/L): (NH4)2S0415, ΚΗ2Ρ045.0, Na2HPO4.12H2015, MgSO4.7Η201.0,Yeast extractl.0，Glucose20，ρΗ7.0。
[0043]培养条件:
[0044]菌种培养:甘油管划线，然后挑取单菌落划线平板37°C培养，作为种子来源；
[0045]种子培养:平板挑取菌体，37°C，200r/min，根据要求添加氯霉素34μ g/mL，链霉素100 μ g/mL，培养约12h，转接发酵培养基；
[0046]发酵培养:以2%接种量转接，Oh时添加0.1-0.5mM IPTG诱导基因表达，根据需要添加氯霉素(34 μ g/mL)以及链霉素(100 μ g/mL)，30-37 V，200r/min 培养，周期 28_36h。
[0047]实施例1重组质粒的构建及鉴定[0048](I)重组质粒 pACYCDuet-1-hemLA, pCDFDuet-1-hemD, pCDFDuet-1-hemF,及pCDFDuet-1-hemD-hemF 的构建
[0049]以大肠杆菌基因组为模板获取hemL, hemD,以及hemF, hemA来源于伤寒沙门氏菌[0050] 引物如下(下划线部分为酶切位点)
【权利要求】
1.一种高产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，在表达C5途径基因hemL和hemA的基础上，共表达编码尿卟啉原III合酶的基因hemD和/或粪卟啉原III氧化酶的基因hemF。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述hemL的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，hemA的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述hemD的核苷酸序列如SEQ ID N0.3 所示。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述hemF的核苷酸序列如SEQ ID N0.4 所示。
5.根据权利要求1-4任一所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，以大肠杆菌DH5α、JM109、W3110 或 BL21(DE3)为表达宿主。
6.根据权利要求1-4所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述hemL与hemA以pACY⑶uet-Ι为表达载体进行串联表达，得到表达载体pACY⑶uet-1-hemLA。
7.根据权利要求1-4所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，单独或串联表达hemD和hemF时，所用表达载体是pUC18、pUC19、pCL1920、pCDFDuet-1或pET系列质粒。
8.根据权利要求7所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，以pCDFDuet-1为表达载体。
9.一种构建权利要求1所述大肠杆菌工程菌株的方法，利用pACY⑶uet-Ι表达hemL和hemA，以P⑶FDuet-1表达编码尿卟啉原III合酶的基因hemD和/或粪卟啉原III氧化酶的基因hemF，转化筛选获得高产5_氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株Escherichiacoli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-hemL-hemA pCDFDuet-1-hemD-hemF 或 Escherichia coliBL21 (DE3)/pACYCDuet-1-hemL-hemA pCDFDuet-1-hemD 或 Escherichia coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-hemL-hemA pCDFDuet-1-hemF。
10.应用权利要求1-4任一所述大肠杆菌工程菌发酵生产ALA的方法，其特征在于，将工程菌株活化后，转接发酵培养基，30-37°C，200r/min培养，发酵周期28_36h。
【文档编号】C12P13/00GK104004701SQ201410274445
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月18日 优先权日:2014年6月18日
【发明者】陈坚, 康振, 堵国成, 张俊丽 申请人:江南大学