用于dna提取的方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于从溶液中回收生物聚合物的方法和材料。尤其，本发明提供了用于从生物材料中提取和分离核酸的方法。在洗涤剂和溶剂的存在下，可以通过形成与可溶性多糖聚合物和磁性颗粒的稳定复合物来分离核酸。当从溶液中磁性地分离出颗粒时，核酸和它们一起分离。随后可以从颗粒释放和分离核酸。该核酸制剂有用于在下游分子技术中得到有效且精确的结果，所述下游分子技术例如核酸来源的定量、鉴定以及基因分型。
【专利说明】用于DNA提取的方法和试剂盒
[0001] 本申请是申请日为2009年5月22日、发明名称为"用于DNA提取的方法和试剂 盒"、申请号为2009801290899的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002] 本发明涉及用于DNA提取的方法和试剂盒。
【发明内容】
[0003] 本教导提供用于获得高数量、高质量的核酸并且精确地在短时间内获得核酸的组 合物、方法和试剂盒。本教导一般涉及从生物材料中分离核酸，以使所述核酸与下游应用中 的使用相适应（compatible with)的方法。在各种实施方式中，本教导涉及多轻基聚合物 和洗涤剂用于将核酸与具有亲水表面的磁性颗粒结合、将核酸从所述磁性颗粒释放并且通 过使用数种缓冲液提取核酸的用途。在一些实施方式中，提供了用于从生物材料中分离DNA 的试剂盒。
[0004] 本教导的提取和纯化方法提供了用于从生物样品、食品样品、水样品、环境样品、 农业样品、生物药物样品或者药物样品中获得核酸（例如基因组DNA)的有用方法，所述核 酸可用于下游应用中，例如所述生物材料、食品材料、水材料、环境材料、农业材料、生物药 物材料或者药物材料来源的基因分型、检测、定量和鉴定，其中采用分子生物学方法，例如 PCR。所提供的缓冲液系统在提取保持DNA完整性的高数量DNA中是独特的。其提供了高 效率DNA提取并去除了 PCR抑制剂。此外，使用标准的液体处理系统，可使用于提取和纯化 核酸的程序（procedure)完全自动化。
[0005] 本文所用的标题部分只是用于编排目的，不理解为以任何方式限制所描述的主 题。本申请中所引用的所有文献和类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和 协议，不管此类文献和类似材料的形式如何，都以全文通过引用明确并入本文，用于任何目 的。
【专利附图】
【附图说明】
[0006] 本领域技术人员将理解下文所描述的附图只用于说明目的。附图并无意以任何方 式限制本教导的范围。
[0007] 图1是说明如本教导的各种实施方式中所描述的DNA分离和纯化的方法的示意 图。
[0008] 图2说明如实施例6中所描述的DNA分离和纯化的DNA产率，其中按照实施例4 中所描述的方法，从细胞计数为1562-50000的培养的Raji细胞分离基因组DNA。
[0009] 图3说明如实施例7中所描述的DNA分离和纯化的DNA产率，其中按照实施例4 中所描述的方法，从细胞计数为3500-110000的培养的K562细胞分离基因组DNA。
[0010] 图4说明如实施例13中所描述的从基材中分离和纯化DNA后获得的基因分型分 布（genotyping profiles),其中按照实施例11的方法从生物样品中分离基因组DNA，并使 用Identiflleir?试剂盒进行处理，用于基因分型。
[0011] 图5,在抑制剂的存在下，（加入）到洗涤溶液中的洗涤剂添加剂对从干燥于粗斜 纹布（denim)上的血液中提取DNA的影响。
[0012] 图6,在抑制剂的存在下，（加入）到洗涤溶液中的洗涤剂添加剂对从干燥于粗斜 纹布上的血液中去除抑制剂的效率的影响。
【具体实施方式】
[0013] 虽然结合各种实施方式来描述本教导，但并无意将本教导限制于此类实施方式。 相反，如本领域技术人员将理解的，本教导涵盖了各种替代、修改和等同物。
[0014] 本说明书中所用的绝大多数词语具有本领域技术人员所认为的那些词语的含义。 本说明书中具体定义的词语具有本教导上下文中提供的整体含义和如本领域技术人员通 常理解的含义。在词语或短语的本领域所理解定义与本说明书中具体教导的该词语或短语 的定义相冲突的情况下，应以本说明书为准。本文所用的标题只是为了方便起见，并不理解 为以任何方式进行限制。
[0015] 本文所用的"DNA"指本领域所理解的各种形式的脱氧核糖核酸，例如基因组DNA、 cDNA、分离的核酸分子、载体DNA和染色体DNA。"核酸"指任何形式的一种或多种核酸分 子、DNA或RNA(核糖核酸）。本文所用的术语"分离的核酸分子"或"分离的核酸"指已从其 天然环境中脱离（remove)的核酸分子（任何形式的DNA或RNA)。分离的核酸分子的一些 实例为含于载体中的重组DNA分子；保持在异源宿主细胞中的重组DNA分子；部分或基本 纯化的核酸分子；获得自法医样品和其它样品的核酸，所述其它样品包括生物材料，例如血 液、精液、唾液、皮肤组织等，食品样品，包括但不限于肉、鱼、水果、蔬菜、啤酒、葡萄酒、蛋、 奶等，以及植物、动物、人或环境来源的样品，水样品，环境样品，农业样品，生物药物样品， 药物样品，存在于用于制备或储存食品、饮料、水、药物产品、个人护理产品或奶制品的原材 料、设备、产品或工艺中的环境样品，存在于临床样本或者用于处理人或动物的设备、固定 装直（fixtures)或广品中的和存在于临床样品或临床环境中的环境样品；以及合成的DNA 分子。"分离"的核酸可以不含在取得所述核酸的有机体的基因组DNA中天然位于所述核酸 侧翼的序列（即位于所述核酸5 '和3'端的序列）。此外，"分离"的核酸分子（例如cNDA 分子）当通过重组技术制备时，可以基本不含其它细胞材料或培养基，或者当化学合成时， 可基本不含化学前体或其它化学品。
[0016] "聚合酶链式反应"（或"PCR"）指一种技术，其中使用变性、用引物退火以及用DNA 聚合酶延伸的重复循环来将靶DNA序列的拷贝数扩增大约106倍或更多。用于扩增核酸的 PCR方法涵盖于美国专利No. 4, 683, 195和4, 683, 202中，通过引用将其全文并入本文，用于 描述该方法。任何PCR的反应条件包括该反应的化学组分及其浓度、反应循环中使用的温 度、反应的循环数目以及反应循环的阶段的持续时间。
[0017] "PCR相适应的（PCR-compatible) "指任何组合物、溶液、化合物、试剂等，其与PCT 测定中的后续使用相适应，且对酶促聚合酶链式反应是相对非限制性的。如通过PCR结果 与相关阳性和阴性对照的比较所证明的，PCR相适应的产品显示相对最小地抑制或者不抑 制PCR扩增。PCR测定可以包括但不限于DNA基因分型系统；用于DNA定量的TaqMan? 或SYBRe绿色实时PCR测定；多重PCR测定，包括设计为对短串联重复序列进行基因分型 的那些。
[0018] 本文所用的"扩增"指酶促增加特定核苷酸序列的量的方法。该扩增并不限于但 是通常由PCR来实现。
[0019] "聚合物（Polymer) "或"多种聚合物（polymers) "指用于将核酸与具有亲水表面 的磁性颗粒结合，以及将核酸从所述磁性颗粒释放的可溶性多羟基聚合物。
[0020] 在本教导的一些实施方式中描述了方法，其中可以从样品中分离（s印arated)和 /或分离（isolated)核酸分子，并且在一些实施方式中，其中从所述方法制备的产物为核 酸。在一些实施方式中，本教导的方法导致形成了包含分离的核酸的产物。
[0021] 在本教导的一些实施方式中，可以从含有生物材料的样品中分离和/或分离核 酸分子，并且在一些实施方式中，从所述方法制备的产物为核酸。此类样品的例子包括但 不限于血液和血斑（blood stain)、唾液和唾液斑、颊细胞和颊拭子、精液和精斑、烟蒂、口 香糖、碎牛肉（ground beef)、布里干酪（brie cheese)、生鸡（raw chicken)、虫下、罗马甜 瓜、干燥婴儿配制食品、全壳蛋、碎（ground)黑胡椒、干燥宠物食品、花生酱、橙汁、巴氏灭 菌奶、苜蓿芽、烤牛肉、烟熏鲑鱼、蛋黄酱、色拉调料、奶、冰激凌、腌培根、莴苣、香肠、甜菜 (beet trim)、果汁、菠菜、切达干酪（cheddar cheese)、原奶（raw milk)、牡贩、蛤以及贝类 (mussels)〇
[0022] 在本教导的一些实施方式中描述了方法，其中可以用包含可溶性多羟基聚合物和 洗涤剂的起始溶液处理样品，并加入可磁性吸引的颗粒，以便从所述样品中回收核酸分子， 并且在一些实施方式中，通过施加磁场从样品中回收核酸。在各种实施方式中，所述样品可 以包括一种或多种游离核酸；细胞；生物材料，例如颊拭子、被沾染的织物等。在本教导的 另外实施方式中描述了其中可以从样品中分离核酸的方法，其包括以下步骤：用包含聚合 物和洗涤剂的起始溶液处理样品；向处理的样品中加入悬浮的可磁性吸引的颗粒；以及通 过施加磁场，分离经由聚合物附着于可磁性吸引的颗粒的核酸。此类方法可以进一步包括 从可磁性吸引的颗粒释放核酸的步骤。此类方法还可以进一步包括在水溶液中洗脱核酸的 步骤。
[0023] 然后可将如此获得的核酸用于各种下游应用中的任何种，例如定量、检测以及特 定核酸的基因分型或甚至生物物种的基因分型。可以通过例如PCR扩增进行这些分析。作 为一个实例，在法医DNA分析中，可以从复合生物材料中获得人的核DNA (nDNA)和/或基因 组DNA，然后使用PCR进行基因分型。作为另一个实例，DNA制剂可用于使用实时PCR系统 (如Quantiflier? )对人DNA、或者更具体的男人DNA进行定量，和/或使用系统（例如 AmpFJSTR?试剂盒）进行常染色体或Y染色体短串联重复基因座的基因分型。基于存 在于样品中的DNA的量，可以选择将产生用于特定分析所需的最佳结果的特定基因分型系 统。因此，为了最好地将核酸用于下游应用中，以高产率产生产品的提取和分离方法，以及 相对不含下游应用（例如PCR)的抑制剂的方法均是特别合意的。
[0024] 作为一个实例，在获取和处理过程中，典型的法医证据样品常常暴露于各种环境 伤害中，这可导致被起抑制PCR作用的化合物污染，并且其因此对基因分型或其它分析的 尝试造成干扰。在DNA分离期间以及扩增之前去除此类抑制剂是合意的。
[0025] 核酸应用的另一个实例是在食品加工和生物药物制备的质量控制中检测污染性 DNA。在一个实例中，分离掺入（spiked into)汉堡中的大肠杆菌（E. coli)0157 :H7的DNA, 然后通过实时PCR进行检测。作为另一个实例，可以分离支原体（Mycoplasma)DNA,并通过 灵敏性（sensitivity)比竞争方法更高的解链曲线分析进行检测。由于要求保护的提取和 分离方法产生极大的DNA回收，因此可以通过本领域技术人员已知的实时PCR方法以更高 的灵敏性检测存在于样品中的DNA的量。
[0026] 通常将食品或饮料的一部分与适当的液体组合，所述液体包括但不限于水、缓冲 溶液或培养基（包括但不限于选择性培养基或富集培养基）。在一些实施方式中，食品是 剁碎的、浸软的、液化的、切丁的（diced)或者匀质化的。在一些实施方式中，按照公开的方 法，对大体积的样品（例如但不限于100mL、250mL或更大的体积）进行处理，以确定在原材 料中是否存在一种或多种外源核酸。根据某些实施方式，通常将食品或饮料的一部分和适 当的液体组合以形成稀释悬浮液，例如但不限于约1:5、1:10或l:20(w/vol)的比率。在一 些实施方式中，加入洗涤剂、乳化剂或两者，以增强高脂食品的溶解度，所述高脂食品例如 但不限于黄油和某些其它的奶制品。本领域技术人员将理解，对用于悬浮食品或饮料的液 体的选择将至少部分取决于原材料（即，食品或饮料）和外源核酸（包括但不限于一种或 多种感兴趣的微生物）；并且食品/饮料与液体之比可以宽泛变化，条件是该悬浮液充分流 动以进行处理，例如但不限于使其通过过滤介质。在某些实施方式中，将25克的固体或半 固体食品与225mL合适的培养基组合。在一些实施方式中，将25mL的饮料或者液化或部分 液化的食品与225mL合适的培养基组合。
[0027] 本教导的各种实施方式涉及将核酸（例如基因组DNA)与磁性颗粒（S卩，可磁性吸 引的颗粒或珠子）以然后可以在适当的水性条件下将结合的核酸释放的形式有效结合。因 此，这些教导的实施方式使核酸（例如基因组DNA)能够从各种不同类型的生物材料中有效 分离。此外，可以从少量或大量的生物材料中分离核酸（例如基因组DNA)，所述材料通常在 实验室中处理，例如在基因分型分析中涉及的那些材料。
[0028] 本文所用的洗涤缓冲液或洗涤溶液包含阴离子洗涤剂（优选为0. 1 %至2% )和 诸如异丙醇或乙醇之类的极性溶剂（优选为50%至90%)的混合物，所述阴离子洗涤剂例 如为N-月桂酰肌氨酸、脱氧胆酸钠、CTAB、N-十二烷基β -D-麦芽糖苷、壬酰基-N-甲基葡 糖酰胺（methylglucamide)、Triton^ Χ-100和/或十二烧基硫酸钠。任选地，洗漆溶液还 可包含吐温20、脱氧胆酸盐和月桂酰肌氨酸钠 （lauroyl sarcosinate)(也称作十二烧基 肌氨酸钠（sarcosyl))。图5和图6提供了洗涤缓冲液中的各种洗涤剂的比较。洗涤缓冲 液在DNA结合后洗涤珠子，并且还去除DNA抑制剂。
[0029] 这些实施方式和本教导的其它特征将从下文描述中变得更加明显。
[0030] 核酸分离系统
[0031] 本教导的各种实施方式涉及系统，其顺应（amenable to)组装于试剂盒中，用于在 洗涤剂的存在下，将核酸（例如基因组DNA)经由可溶性多羟基聚合物与具有亲水表面的磁 性颗粒结合，形成核酸-聚合物-颗粒复合物，并且产生和分离此类复合物，其中所述核酸 不直接与磁性颗粒结合。复合物的形成是这样的：聚合物俘获核酸，聚合物附着于颗粒，并 因此间接地将核酸与颗粒相连。各种实施方式包括裂解溶液，其引起细胞的裂解和核酸的 释放，同时保护核酸免于降解并去除PCR抑制剂。在本教导的各种实施方式中，在洗涤溶液 的存在下，核酸经由复合物保持与磁性颗粒结合，复合物在所述洗涤溶液中被洗涤以去除 污染物和抑制剂，并使得所述核酸顺应用于诸如PCR之类的下游应用中。用于洗涤核酸分 离物的任何污染物和抑制剂的溶液为本领域技术人员所熟知，并且可包含例如洗涤剂和极 性溶剂。在本教导的实施方式中，然后可以在水溶液（例如缓冲液）中释放核酸，所述水溶 液也与用于诸如PCR之类的下游应用相适应。本发明的方法中可以进行多次洗涤，分别地 或者与多次向样品施加磁场一起进行所述洗涤，以回收和/或分离核酸。
[0032] 标准核酸提取技术，包括细胞裂解以及核酸的洗涤和洗脱是本领域所熟知的， 并且除非另有说明，可以按照在例如以下文献中所描述的各种技术来进行：DNA Typing Protocols:Molecular Biology and Forensic Analysis,第 1 版，B. Budowle等人编，Eaton Publishing Co. (2000) ；JM Butler,Forensic DNA Typing:Biology, Technology, and Genetics of STR Markers,第 2 版，Elsevier Academic Press (2005);或者 P. Gill, "Application of Low Copy Number DNA Profiling, "Croatian Medical Journal, 42:229-232 页（2001) ;FR Bieber 等人，"Isolation of DNA from Forensic Evidence,''Current Protocols in Human Genetics,增干丨J 26(2000) ；Forensic DNA Profiling Protocols, Methods in Molecular Biology,第 98 卷，PJ Lincoln 和 J. Thomson 编，Humana Press (1998)。
[0033] 本教导的各种实施方式涉及核酸分离系统（例如用于基因组DNA)，其包含用于从 生物样品、食品样品、水样品、环境样品、农业样品、生物药物样品或药物样品中提取核酸的 试剂和方法。这些方法的实施方式可以包括：在洗涤剂的存在下，从生物材料中裂解细胞形 成核酸（如基因组DNA)与可溶性聚合物的非共价复合物，所述聚合物具有与可磁性吸引的 颗粒表面相同或类似的化学结构；经由聚合物与颗粒表面之间的相互作用，将核酸-聚合 物复合物与磁性颗粒结合，从而形成稳定的核酸-聚合物-颗粒复合物；经由包含洗涤剂和 极性溶剂的洗涤缓冲液去除未结合的材料，例如PCR抑制剂；以及从所述颗粒释放核酸，并 在水溶液中洗脱核酸。
[0034] 申请人:已发现在适当的盐和极性溶剂的存在下，使用多羟基水溶性聚合物和洗 涤剂改进了核酸（例如基因组DNA)在可磁性吸引的颗粒表面上的结合和释放效率。适 当的可磁性吸引的颗粒的实例包括但不限于葡聚糖包被的>< it η (> m a 磁性纳米颗粒 (magnetite nanoparticles)。在本教导的一些实施方式中，以约2至约10mg/ml将葡聚糖 包被的磁性纳米颗粒加入到包含核酸的样品中。
[0035] 所述可溶性聚合物和洗漆剂可称为结合促进剂（binding enhancer)。适 当的多羟基水溶性聚合物的一些实例为但不限于长链分支的多糖，例如葡聚糖（如 葡聚糖5, 000, 000-40, 000, 000)、可溶性淀粉、糊精、纤维糊精、聚乙二醇（PEG)、肝 素、糖原、短链纤维素、纤维素衍生物及其组合。适当的洗涤剂的一些实例为但不 限于N-月桂酰肌氨酸（NLS);月桂酰肌氨酸钠 （lauroyl sarcosinate)，也称作 十二烷基肌氨酸钠（sarcosyl)，为衍生自肌氨酸的离子表面活性剂；十六烷基三 甲基溴化铵（hexadecyltrimethylammonium bromide)或十六烧基三甲基溴化铵 (cetyltrimethylammonium bromide) (CTAB);脱氧胆酸盐；十二烧基 β-D-麦芽糖苷；壬酰 基-N-甲基葡糖酰胺（methylglucamide);十二烧基硫酸钠；聚乙二醇对-(1，1，3, 3-四甲 基丁基）-苯基醚（商品名为1>Ηωι_?-?〇〇);及其组合。在一些实施方式中，结合促进剂 包含l-5mg/ml范围内的葡聚糖和约5-约15%范围内的十二烷基肌氨酸钠。
[0036] 适当的极性溶剂的一些实例为但不限于异丙醇、乙醇、丁醇及其组合。在一些实施 方式中，极性溶剂包含约70 %至约100 %异丙醇。
[0037] 在一些实施方式中，可以将可磁性吸引的颗粒加入到包含核酸的样品（例如细胞 裂解物）中，同时加入结合促进剂，形成悬浮液。之后可以将包含极性溶剂的溶液加入到该 悬浮液中。或者，在本教导的一些实施方式中，可以将包含结合促进剂和极性溶剂的单一溶 液加入到该悬浮液中。结合促进剂、溶剂和细胞裂解物提供独特的条件，以使核酸被俘获在 与可溶性聚合物的非共价复合物中，所述可溶性聚合物具有与磁性颗粒表面相同或类似的 化学结构。结果是被聚合物俘获的核酸在非共价的核酸-聚合物-颗粒复合物中有效地与 磁性颗粒结合。该复合物在醇洗涤条件下是稳定的，并且以后可以在标准低盐缓冲液（例 如含有低浓度的二价金属离子螯合剂（例如EDTA)的Tris缓冲液）中容易地将核酸洗脱。 在一些实施方式中，核酸-聚合物与颗粒结合的这一阶段可以通过冷却（chill)加以辅助。
[0038] 此外，本教导提供了使用与极性溶剂（例如乙醇或异丙醇）混合的洗涤剂（例如 但不限于N-月桂酰肌氨酸、脱氧胆酸钠、CTAB、N-十二烷基β -D-麦芽糖苷、壬酰基-N-甲 基葡糖酰胺、Trtton#x-I〇〇和/或十二烷基硫酸钠）作为核酸-颗粒复合物的洗涤溶液， 以改进下游应用的抑制剂（例如PCR抑制剂）从结合于磁性颗粒的这些核酸中的去除。
[0039] 在核酸-聚合物-颗粒复合物形成中，在被聚合物俘获的核酸与磁性颗粒结合之 后，可以向所述悬浮液施加磁场。该磁场可用于从悬浮液中去除核酸-聚合物-颗粒复合 物，形成复合物层（例如在管的底部或一侧），并留下上清液。可以通过本领域已知的设备 和方法（例如经由Ambion? (Austin, τχ)磁力站）将磁场施加于样品。之后可以从管中 去除上清液。
[0040] 然后可任选洗涤核酸-聚合物-颗粒复合物层，以去除残余的污染物和/或PCR 抑制剂；然后，可以在不存在任何磁场的情况下，将核酸-聚合物-颗粒复合物重悬浮于必 需体积的适当洗脱缓冲液中。用于分离核酸的适当洗脱缓冲液为本领域技术人员所熟知。 这使得核酸从核酸-聚合物-颗粒复合物中释放进入到溶液中。可以再次向管施加磁场， 导致从悬浮液中去除磁性颗粒，例如到管（tube)的底部或一侧，留下现在核酸溶解于其中 的上清液。现在可以通过用例如移液器收集上清液，从磁性颗粒分离再次溶解的核酸，同时 所述颗粒被磁场保持于管的底部或一侧。在这些方法中不需要对样品进行离心。
[0041] 在本教导的一些实施方式中，然后可以从含有生物材料的生物样品、食品样品、水 样品、环境样品、农业样品、生物药物样品或药物样品中分离核酸分子，并结合使用具有亲 水表面的磁性颗粒（例如磁性葡聚糖颗粒）从溶液中纯化。磁性颗粒促进的核酸分离和纯 化可用来极大地改进本领域技术人员熟知的基于醇的沉淀的常规分离和纯化核酸的方法。 可通过参考图1来说明可通过这些教导修改的基于醇的分离和纯化程序的实施方式的一 个实例。
[0042] 样品制备
[0043] 本文所述方法的实施方式可以包括将食品或饮料的一部分与适当的液体组合，所 述液体包括但不限于水、缓冲溶液或培养基（非限制性包括选择性培养基或富集培养基）。 在一些实施方式中，食品是剁碎的、浸软的、液化的、切丁的或者匀质化的。在一些实施方 式中，按照公开的方法，对大体积（例如但不限于100mL、250mL或更大）的样品进行处理， 以确定在原材料中是否存在特定的微生物。根据某些实施方式，通常将食品或饮料的一部 分和适当的液体组合以形成稀释悬浮液，例如但不限于约1:5、1:10或l:20(w/ V〇l)的比 率。在一些实施方式中，加入洗涤剂、乳化剂或两者，以增强高脂食品的溶解度，所述高脂食 品例如但不限于黄油和某些其它的奶制品。本领域技术人员将理解，对用于悬浮食品或饮 料的液体的选择将至少部分取决于原材料（即，食品或饮料）和一种或多种感兴趣的微生 物；并且食品/饮料与液体之比可以宽泛变化，条件是该悬浮液充分流动以进行处理，例如 但不限于使其通过过滤介质。在某些实施方式中，将25克的固体或半固体食品与225mL合 适的培养基组合。在一些实施方式中，将25mL的饮料或者液化或部分液化的食品与225mL 合适的培养基组合。
[0044] 裂解溶液
[0045] 本文所述方法的实施方式可包括从存在于基材（例如颊拭子的棉花或沾染的织 物）上的生物材料裂解细胞，以产生包含核酸的裂解物；从所述裂解物中去除基材；形成核 酸-聚合物-颗粒复合物，之后如上文所述，将核酸分离并洗脱。在一个实施方式中，裂解 溶液可包含SDS、Tris缓冲液和NaCl，任选含有蛋白酶K ;在一些实施方式中，裂解溶液可包 含 0· 0% -1% SDS、100mM Tris 缓冲液和 2M NaCl。
[0046] 在本教导的一些实施方式中，裂解溶液可包含硫氰酸胍（GuSCN)或盐酸胍、 Tr i s · HC1、乙二胺四乙酸（EDTA)、消泡剂A和两亲性洗涤剂（例如二甲基氨基-丙 烧-1-横酸酯（dimethylammonio-propane-1-sulfonate)(例如 Zwittergent?，如 Zwittergenr3-16,具有C16链）。在本教导的一些实施方式中，裂解溶液包含3. 5-6M范 围内的GuSCN、10-150mM范围内的EDTA、100-500mM范围内的Tris·HCl、0·005-0·05%范围 内的消泡剂Α、ι-5%范围内的Zwittergent?, pH范围为7. 2-8. 5。在本教导的一些实施 方式中，裂解溶液可以进一步包含强还原剂，例如三（2-羧乙基）膦（TCEP)或二硫苏糖醇 (DTT)。因为强还原剂起到水解和断裂蛋白二硫键的作用，所以例如在生物材料为精子的情 况下，这些是尤为有用的，这是因为该试剂可以起到水解蛋白的作用，所述蛋白保持精子壁 完整，并且其因此使得精子细胞的裂解相对困难。
[0047] 在本教导的各种实施方式中，可将裂解溶液加入到含有生物材料的样品（并且任 选地，对所述样品进行加热一段时间，例如二十分钟至两个小时）中，以便裂解细胞和将核 酸释放到裂解物中。在一些实施方式中，裂解溶液可以为包含设计为有效裂解细胞（例如 收集在棉拭子上的颊细胞），同时还保护释放的核酸免于降解的化合物的组合物。在一些实 施方式中，裂解溶液进一步包含确保释放的核酸与用于下游测定（例如PCR测定、尤其DNA 基因分型系统）相适应的这样的化合物。
[0048] 在本教导的一些实施方式中，然后在裂解程序后，可以将磁性颗粒（例如葡聚 糖磁性纳米颗粒）、结合促进剂和极性溶剂加入到包含核酸的裂解物中，生成其中形成核 酸-聚合物-颗粒复合物的悬浮液，如上文所述分离并洗脱核酸。
[0049] 结合溶液
[0050] 然后可将结合促进剂加入到悬浮液中，所述结合促进剂包含离子洗涤 剂（例如N-月桂酰肌氨酸（NLS)或月桂酰肌氨酸钠（也称作十二烷基肌氨酸钠， 为衍生自肌氨酸的离子表面活性剂）和水可溶性长链分支的多糖（例如葡聚糖 5, 000, 000-40, 000, 000)。在一些实施方式中，结合促进剂可包含洗涤剂十六烷基 三甲基溴化铵（hexadecyltrimethylammonium bromide)或十六烧基三甲基溴化铵 (cetyltrimethylammonium bromide)(CTAB)、脱氧胆酸盐、十二烧基 β-D-麦芽糖苷、壬酰 基-N-甲基葡糖酰胺（methylglucamide)、十二烧基硫酸钠和聚乙二醇对-(1，1，3, 3-四甲 基丁基）-苯基醚（商品名为Triton:< X-100)中的一种或多种。结合促进剂还可以包含 或者可选地包含其他水溶性聚合物，例如短链纤维素、纤维素衍生物、PEG、肝素、淀粉、糖原 等。或者，磁性颗粒可以和结合促进剂在同一时间加入到裂解物中。在一些实施方式中，结 合促进剂包含5-15%范围内的十二烷基肌氨酸钠和l-5mg/ml范围内的葡聚糖。
[0051] 可将包含醇（例如乙醇、丁醇或异丙醇）的结合溶液加入到悬浮液中。在一些实 施方式中，结合溶液包含30-100%异丙醇。或者，在本教导的一些实施方式中，可将包含结 合促进剂和结合溶液的单一溶液加入到悬浮液中。结合促进剂、结合溶液和细胞裂解物提 供了独特的条件，以使核酸被俘获在与可溶性聚合物（例如葡聚糖）的非共价复合物中，所 述可溶性聚合物具有与磁性颗粒表面相同或类似的化学结构。结果是聚合物俘获的核酸在 非共价的核酸-颗粒复合物中有效地与磁性颗粒结合。该复合物在醇洗涤条件（例如含乙 醇的洗涤溶液）下是稳定的，并且以后可以在标准低盐缓冲液（例如含有低浓度的二价金 属离子螯合剂（如EDTA)的10mM Tris缓冲液（pH8.0))中容易地洗脱核酸。在一些实施 方式中，该结合阶段可以通过冷却来辅助一些类型的沉淀。
[0052] 洗涤溶液
[0053] 本教导的各种实施方式涉及核酸分离系统（例如用于基因组DNA)，其包含用于从 生物样品、食品样品、水样品、环境样品、农业样品、生物药物样品或药物样品中提取核酸的 试剂和方法，并包含洗涤步骤以从所述样品中去除PCR抑制剂。在洗涤步骤中使用的洗涤 溶液为例如本领域所已知的（溶液）。在一些实施方式中，所述洗涤溶液的具体组分可以 为浓度为70% -90 %的乙醇。这些方法的实施方式可以包括：形成核酸（如基因组DNA) 与可溶性聚合物的非共价复合物，所述聚合物具有与磁性颗粒的表面相同或类似的化学结 构；经由聚合物与颗粒表面之间的相互作用，将所述核酸-聚合物复合物与磁性颗粒结合， 从而形成稳定的核酸-聚合物-颗粒复合物；通过包含洗涤剂和极性溶剂的洗涤溶液试剂 去除未结合的材料，例如PCR抑制剂；以及在水溶液中洗脱顺应用于诸如PCR之类的下游应 用中的核酸。
[0054] 在核酸-颗粒复合物的形成中，被俘获的核酸与磁性颗粒结合之后，然后可以向 所述悬浮液施加磁场。该磁场可用于从悬浮液中去除核酸-颗粒复合物，在管的底部或一 侧形成复合物层，并留下第一上清液。然后可从管中去除第一上清液。
[0055] 使用洗涤剂和极性溶剂的洗涤溶液来洗涤去除第一上清液后留下的核酸-聚合 物-颗粒复合物层，帮助去除任何残留的盐、核苷酸、化学品、有机溶剂和样品中的其它污 染物，并且促进去除下游应用的抑制剂，例如PCR抑制剂。在各种实施方式中，可将洗涤溶 液用作核酸-聚合物-颗粒复合物的洗涤液，以去除PCR抑制剂和/或污染物。对分离和 /或纯化期间洗涤核酸有用的溶液是本领域技术人员所熟知的。
[0056] 在一些实施方式中，将洗涤溶液加入到核酸-聚合物-颗粒复合物中以产生洗涤 悬浮液。在一些实施方式中，洗涤溶液包含十二烷基肌氨酸钠和醇（例如乙醇、异丙醇和 70% (v/v)乙醇中的一种或多种）。在一些实施方式中，洗涤溶液包含洗涤剂，例如失水山 梨醇聚氧乙烯（20)醚月桂酸酯（polysorbate20)或失水山梨醇聚氧乙烯（20)醚油酸酯 (polysorbate80)。在一些实施方式中，洗涤溶液包含1-2M范围内的GuSCN、3-50mM范围内 的EDTA、30-170mM范围内的Tris ·Η(：1、0. 001-0. 02%范围内的消泡剂A、0. 3-2%范围内的 7\\七〖1>1$〇11111、30-45%范围内的异丙醇和0.5-2%范围内的十二烧基肌氨酸钠。所述核 酸不溶于醇（例如异丙醇、乙醇和70% (v/v)乙醇），并在洗涤期间保持为与聚合物及颗粒 的稳定复合物。因此，可剧烈（例如通过涡旋混合）进行洗涤步骤，而没有损失核酸的风险。 之后可将样品再次置于磁场前，可从所述复合物层中去除从洗涤悬浮液中分离出来的包含 污染物的所得洗涤上清液。
[0057] 洗涤步骤之后，还可以按照第一次洗涤中的类似步骤进行第二次洗涤步骤。在本 教导的一些实施方式中，一个或多个洗涤步骤后，如上文所述，将核酸分离并洗脱。
[0058] 核酸提取和纯化
[0059] 本教导的提取和纯化方法提供了用于从生物样品中获得核酸（例如基因组DNA) 的有用方法，所述核酸可用于下游应用中，例如基因分型、定量和生物材料来源的鉴定，其 中利用了诸如PCR之类的分子生物学方法。本文实施例中所描述的示例性结果说明了本教 导的核酸提取和纯化方法的各种优势，其包括但不限于提供核酸（例如基因组DNA)制品， 所述核酸制品（a)可源自各种生物材料；(b)不含下游应用（例如PCR扩增）的可检测抑 制剂；(c)可以为浓缩形式；以及（d)顺应用于核酸分析（例如基因分型、定量、生物材料来 源的检测等）用的各种应用中的任何种。此外，使用标准液体处理系统，可使核酸的提取及 纯化用程序完全自动化。
[0060] 此外，通过本教导的方法修改目前使用的标准醇沉淀程序（例如需要离心的那些 程序），可以提供数种明显的益处。第一，本教导举例说明的本文方法更快速一用于从分 离的核酸复合物中去除溶液的修改程序只花费约1-2分钟，相比之下使用离心的常规方法 花费约10-30分钟。第二，本文方法不依赖于离心设备，却可用简单的磁性装置来进行。第 三，本文方法更易于适合自动化。例如，可将大量的管放置在大型电磁体上，使用例如多通 道移液器具可同时分离来自这些管中的所有核酸。第四，本教导的方法对于洗涤核酸-聚 合物-磁性颗粒复合物的步骤（例如为了去除任何残留的盐、核苷酸或有机溶剂（例如 酚））尤其有效，因为在本教导中，洗涤步骤不需要离心，因此可以迅速进行。此外，不存在 材料损失的风险或存在最小的材料损失风险，基于离心的常规方法可发生材料损失（其中 粒状沉淀（pellet)常常在此类洗涤期间从管的底部脱离）。
[0061] 如本领域技术人员将理解的，对本教导的各种实施方式可以进行多种变化和修 改，而不背离这些教导的精神。所有此类变化有意落入这些教导的范围内。
[0062] 如本文所公开和要求保护的本教导的所有组合物和方法按照本公开内容，无需过 度实验，即可制备和实施。尽管已经以【具体实施方式】对这些教导的组合物和方法进行描述， 但对于本领域技术人员显然的是，可对所述组合物和方法，以及在本文所述方法的步骤中 或者步骤顺序中，进行改变，而不背离这些教导的概念和范围。更具体地，显然，可用化学及 生理学上均相关的某些试剂代替本文所述试剂，但将达到相同或类似的结果。对于本领域 技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改都被认为在由所附权利要求所限定的本 发明的范围之内。
[0063] 实施例
[0064] 本教导的各方面可根据以下实施例得到进一步理解，所述实施例不应理解为以任 何方式限制本教导的范围。
[0065] 实施例1
[0066] 将人的体液样品置于2. 0ml容量的聚丙烯管中。所述样品为2 μ 1血液、10 μ 1唾 液和2μ1精液。将每个样品与裂解溶液混合，以便裂解细胞。裂解溶液包含0.0^-1% SDS、100mM Tris缓冲液和2M NaCl，任选含有蛋白酶K。将裂解混合物在约60°C至80°C范 围内的温度下，在摇动或不摇动条件下孵育约40分钟至1小时的时段。
[0067] 之后使释放自该生物材料的基因组DNA与具有葡聚糖的多羟基基团的磁性颗粒 结合。每一样品的结合混合物含有：细胞裂解物；包含浓度为约5-20mg/ml的磁性颗粒的 10 μ 1至20 μ 1悬浮液；以及约150至300 μ 1极性化合物，例如异丙醇、乙醇和/或PEG。 然后通过向结合混合物施加磁场，将与磁性颗粒结合的DNA从该混合物中物理分离。
[0068] 然后，用基于醇的洗涤溶液（90%乙醇）洗涤仍与复合物中的磁性颗粒结合的 DNA。通过使用磁场，将DNA-磁性颗粒复合物再次从洗涤混合物中物理分离。重复洗涤步 骤一至两次。在该洗涤步骤中去除俘获在DNA-磁性颗粒复合物中的PCR抑制剂和其他大 分子。之后通过将DNA-颗粒复合物悬浮于10至100 μ 1水溶液（例如不含DNA的水或例 如Tris-HCl的中性缓冲液）中，将DNA从磁性颗粒上释放，并在约50至75°C范围内的温度 下孵育该DNA释放混合物。然后通过使用磁场将释放的基因组DNA与磁性颗粒物理分离。 将如此获得的基因组DNA制品在4°C下短期储存，或在_20°C下长期储存。使用本领域技术 人员熟知的标准方法对DNA进行定量。表1中示出了典型关于人的基因组DNA的结果。
[0069] 表 1 :
[0070]
[0071] 实施例2
【权利要求】
1. 制备产品的方法，其中所述产品包含核酸，所述方法包括以下步骤： (a) 用包含聚合物和洗涤剂的起始溶液处理样品，其中所述聚合物为至少一种葡聚糖 或可溶性淀粉并且其中所述洗涤剂包括N-月桂基肌氨酸、十二烷基肌氨酸钠、十二烷基 β -D-麦芽糖苷或壬酰基-N-甲基葡糖酰胺； (b) 施加悬浮的可磁性吸引的颗粒，其中所述可磁性吸引的颗粒具有葡聚糖的多羟基 基团； (c) 施加洗涤溶液和磁场； (d) 洗脱并回收核酸。
2. 权利要求1所述的方法，其中所述核酸源自生物材料样品，所述样品包括血液、血 斑、唾液、唾液斑、颊细胞、颊拭子、精液、精斑、烟蒂、口香糖、碎牛肉、布里干酪、生鸡、虾、罗 马甜瓜、干燥婴儿配制食品、全壳蛋、碎黑胡椒、干燥宠物食品、花生酱、橙汁、巴氏灭菌奶、 苜蓿芽、烤牛肉、烟熏鲑鱼、蛋黄酱、色拉调料、奶、冰激凌、腌培根、莴苣、香肠、甜菜、果汁、 菠菜、切达干酪、原奶、牡蛎、蛤或贝类中的一种或多种。
3. 权利要求1所述的方法，其中所述洗涤溶液包含至少一种洗涤剂和极性溶剂。
4. 权利要求3所述的方法，其中所述极性溶剂选自异丙醇和乙醇，优选为50%至90%。
5. 制备产品的方法，其中所述产品包含核酸，所述方法包括以下步骤： (a) 在裂解溶液中从样品中裂解细胞，从而形成包含核酸的裂解物； (b) 用包含聚合物和洗涤剂的起始溶液处理所述裂解物，其中所述聚合物为至少一种 葡聚糖或可溶性淀粉并且其中所述洗涤剂包括N-月桂基肌氨酸、十二烷基肌氨酸钠、十二 烷基β -D-麦芽糖苷或壬酰基-N-甲基葡糖酰胺； (c) 施加悬浮的可磁性吸引的颗粒，其中所述可磁性吸引的颗粒具有葡聚糖的多羟基 基团； (d) 施加洗涤溶液； (e) 通过施加磁场回收所述核酸。
6. 权利要求5所述的方法，其中所述可磁性吸引的颗粒具有葡聚糖的多羟基基团并且 是葡聚糖包被的磁性纳米颗粒。
7. -种试剂盒，其包含可磁性吸引的颗粒、聚合物和洗涤剂，其中所述可磁性吸引的 颗粒具有葡聚糖的多羟基基团，其中所述聚合物为至少一种葡聚糖或可溶性淀粉并且其中 所述洗涤剂包括N-月桂基肌氨酸、十二烷基肌氨酸钠、十二烷基β-D-麦芽糖苷或壬酰 基-Ν-甲基葡糖酰胺。
8. 权利要求7所述的试剂盒，其中所述可磁性吸引的颗粒具有葡聚糖的多羟基基团并 且是葡聚糖包被的磁性纳米颗粒。
9. 从样品中分离核酸的方法，其包括以下步骤： (a) 用包含聚合物和洗涤剂的起始溶液处理所述样品，其中所述聚合物为至少一种葡 聚糖或可溶性淀粉并且其中所述洗涤剂包括N-月桂基肌氨酸、十二烷基肌氨酸钠、十二烷 基β -D-麦芽糖苷或壬酰基-N-甲基葡糖酰胺； (b) 将悬浮的可磁性吸引的颗粒加入到经处理的样品中，其中所述可磁性吸引的颗粒 具有葡聚糖的多羟基基团；以及 (c) 通过施加磁场来分离附着于可磁性吸引的颗粒的核酸。
10.由权利要求1和9中任一项所述的方法制备的核酸产品。
【文档编号】C12N15/10GK104232617SQ201410276520
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2009年5月22日 优先权日:2008年5月23日
【发明者】G. 布列夫诺夫 M., S. 帕瓦 H., 富尔塔多 M., G. 谢威尔 J. 申请人:生命科技公司