一株香茅草产香内生细菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株产生挥发性香味物的内生细菌Pantoeasp.CcSh-1，保藏号为CGMCCNo.8715，该菌株来源于成熟香茅草的鞘部，易于培养，在固体培养基上生长2-3天则能产清新、愉悦香味，经鉴定含柠檬醛成分，该菌的发现为替代植物原料生产香料提供了一种新的微生物资源。
【专利说明】一株香茅草产香内生细菌
【技术领域】
[0001] 本发明涉及从香茅草中分离获得一株产香内生细菌Paflioea sp. CcSh-1。
【背景技术】
[0002] 香茅草[6^2^0/70^0/7 citraiiAs (DC. ) Stapf]为香茅属多年生草本植物，是一种重 要的热带香料作物。研究表明，香茅草挥发性化合物中最主要的成分为柠檬醛。柠檬醛味 类似果香，被我国食品添加剂使用卫生标准GB 2760-96规定为允许使用的食用香料，主要 用于配制柠檬、柑橘和什锦水果型香精。柠檬醛还是紫罗兰酮的主要生产原料，后者作为高 级香精的主要原料极具商业价值，广泛应用于高档化妆品、日化产品的制备。但目前农业种 植香茅草仍然不能满足香料行业的需求。除柠檬醛外，香茅草挥发性化合物还包括香茅醇、 二戊烯、金合欢醇、牛儿醇、柠檬烯、芳樟醇、庚烯、月桂烯、η-葵醛、橙花醇等一系列成分，具 有较高的开发价值。
[0003] 近年来研究者开始关注开发产香微生物，以期找到新的天然香料资源。由于微生 物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢 的协同作用下，可使底物发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的 低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如萜烯类、醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、酚类、 呋喃类、吡嗪类和吡啶类等，这些香气物质无疑是天然香料生产的新来源。但迄今能够合成 柠檬醛等萜类挥发性香味物的微生物鲜有报道。
[0004] 植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种 组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物（至少是暂时）不表现出外在症状。植物内 生菌具有普遍性和功能多样性，存在所有已研究过的植物中，也几乎存在于植物的所有组 织中，因此是一可供开发的资源宝库。现有研究推测，由于基因的重组或长期信息交流致 使内生菌产生了与宿主相同的信息传导通路，从而使内生菌能合成与宿主相类似的次生产 物，所以从香茅草中寻找能产生类似挥发物的内生菌具有极大的目的性和选择性。但目前 从香茅草中分离筛选产香内生菌的报道很少。本发明所述的产香内生细菌，能够合成以柠 檬醛为主的萜类挥发性香味物，说明其在香料原材料的生产上具有较大的开发潜力。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是：提供一株能生产香茅草香料原料的内生细菌，该菌株 来源于成熟香茅草的鞘部，易于培养，在固体培养基上生长2-3天则能产清新、愉悦香味， 经鉴定含柠檬醛成分，在27°C，170r/min，ΝΒ液体培养基的条件下培养2天，根据气相色谱 所得柠檬醛的峰面积值，计算出柠檬醛在发酵液中的含量约为2000 μ g/L。 本发明提供的技术方案是：一种产香内生细菌，所述产香内生细菌为/"aflioea sp. CcSh-1，保藏号为 CGMCC No.8715。
[0005] 本发明所述菌株结合菌落菌体形态特征和基于细菌16S rRNA基因序列的系统发 育分析，鉴定为Paflioea 5/7菌，命名为CcSh-1，该菌株已于2014年1月10日由中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)所保藏(保藏地址是：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号)，保藏号为CGMCC No. 8715,分类命名为泛菌sp.，经检测存活。 CcSh-Ι菌株的分离、纯化和筛选过程为：将香茅草(源自福建农林大学)洗去泥土后，分 为根、叶鞘、叶等部分，表面消毒，干燥后置于内生菌分离培养基（WA)上，27°C培养，待内生 细菌长出再结合划线分离法在固体NA平板上进行分离，直至获得纯培养。将分离得到的纯 培养菌株放入培养箱中27°C恒温静置培养，闻香评定并筛选。从香茅草鞘分离得到了产香 效果最好的菌株，即CcSh-Ι菌。 所述WA培养基组成为：琼脂18g，蒸馏水1L，调节PH值范围7. 0±0. 2。NA培养基组 成为：蛋白胨l〇g，牛肉膏粉3g，NaCl 5g，琼脂15g，蒸馏水1L，调节PH值范围7.0±0. 2。 本发明具有以下有益效果： 本发明为香茅草香料生产提供了一种新的微生物资源。本发明所述菌株/"aflioea sp. CcSh-Ι在27°C，170r/min，NB液体培养基(与ΝΑ培养基成分相同，无琼脂）的条件下培养 2天后，利用C18色谱柱进行发酵液的富集和萃取，之后进行顶空进样气相色谱-质谱联用 (HS-GC-MS)分析，能够检测到挥发性香味物，尤其包含柠檬醛的两种同分异构体：α -柠檬 醒和β-朽1樣醒，其中朽1樣醒（α-朽1樣醒和β-朽 1樣醒)含量达2000 μ g/L以上。因此，本 发明提供Paflioea属的一个菌株，能够高水平的产生朽1檬醒的能力，该菌的上述特征表明 其在香料原材料的生产上具有较大的开发潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0006] 图1 :本发明菌株Paflioea sp. CcSh-Ι的菌落形态图； 图2 :本发明菌株sp. CcSh-Ι进化树图； 图3:本发明菌株sp. CcSh-lNB液体培养基中的生长曲线图； 图4 :本发明菌株挥发性香气成分总离子流图； 图5 :柠檬醛标准样品总离子流图；柠檬醛标准样品（97%)总离子流图。
[0007]
【具体实施方式】： 实施例1 :菌株的生物学鉴定 1. 菌株形态特征 (1) 菌落群体形态特征：将单克隆菌落划线接种至NA固体培养基中，平板倒置于恒温 培养箱，27°C培养1?3天，其菌落呈浅黄色，表面光滑湿润、边缘圆滑，见附图1。 (2) 菌体个体形态特征：对菌株进行革兰氏染色，利用光学显微镜观测，显示该菌株为 短杆状，革兰氏阴性菌。 2. 菌株16S rRNA分析 采用细菌基因组DNA提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司），抽提菌株基因组DNA， 以该DNA为模板，采用细菌16S rRNA通用引物（27F，1492R)扩增菌株16S rRNA片段，经过 公司测序后将其序列与NCBI中的核酸数据库进行Blast同源性比对（www. ncbi. nlm. nih. 区0丫/131381：)，与数据库中已知细菌/><3/^0(9<3. <3/7<3/7<3以>5 5^/'<3//7!113-9的163冰敵全长序列 的相似性达到了 98. 73%，保守区序列的相似性达到100%，将该菌株鉴定为属，命名 为CcSh-Ι。本发明菌种也是第一次报道能够产香的属细菌。使用软件MEGA5.0中 的邻近结合法（neighbor-joining method)制作CcSh-Ι的系统发育树，见附图2。 3.菌株相关生理生化实验 分别对菌株纯培养物进行甲基红实验、淀粉水解实验、吲哚实验、柠檬酸盐、V-P实验等 一系列相关生理生化实验，得出该菌株为甲基红阴性，V-P阳性，吲哚阴性，可以利用蔗糖、 乳糖产酸，但不产气，无法利用淀粉，能水解明胶，能利用柠檬酸盐等。这些生理生化特征与 同为作/^ 〇似属的成团泛菌生理生化特征基本一致。 实施例2 :本发明菌株产挥发性香味物分析 将所得菌株接种到NB液体培养基中，在27°C，170r/min下振荡培养，观察菌株在NB液 体培养基中的生长特点，每小时取样一次用紫外分光光计测定培养液的0D变化，描绘其生 长曲线图，见附图3。
[0008] 利用HS-GC-MS分析法对sp. CcSh-Ι挥发性香味物进行检测。
[0009] 1.实验参数 美国 Thermo-Finnigan Trace GC，Polaris Q,气相色谱-质谱联用仪，Tri plus RSH 三合一自动进样器及NIST08谱库。
[0010] 色谱条件：DB-5石英毛细管柱，30 m X 0. 25 mm X0. 25 μ m，柱温采用程序升 温，初始温度60°C，保持2 min，然后以5°C/ min升至130°C，保持2 min，再以5°C/ min 升至180°C后，以20°C / min的升温速率升至220°C，220°C保持5 min ;进样口温度220°C。 载气为高纯氦（纯度大于99. 999%)，流速：1. OmL/min，分流进样，分流比为10 :1。
[0011] 质谱条件：电子轰击电离源，电子束能量70eV;连接线温度：230°C ;溶剂延迟3. 00 min，3. 00 mirT 25. 00 min采用全扫描工作方式，扫描范围25?250 amu，25. 00 min~ 33. 00 min, Fil/ Delay。
[0012] 顶空进样条件：顶空加热温度40°C，平衡时间5 min，顶空进样针温度60°C，进 样量1 ml，用高纯氦气推动和清洗顶空进样针，清洗时间为5 min，顶空用氦气压力为0. 8bar。
[0013] 挥发性香味物所得总离子流图中的保留时间（min)为14. 38物质峰和15. 21物 质峰，与柠檬醛标样总离子流图中的14. 43物质峰和15. 27物质峰吻合。其中保留时间为 14. 38物质峰经鉴定为β-柠檬醛，15.21物质峰经鉴定为α-柠檬醛，见附图4和图5。根 据标样的不同梯度浓度的气相色谱峰，能够计算出挥发性香味物中柠檬醛（α-柠檬醛和 β-柠檬醛)含量达2320 μ g/L，除此以外，通过顶空气质联用仪，检测出在发酵液的挥发性 香味物中除了柠檬醛以外，还检测出α -菔烯(保留时间为7. 28min)，其含量约为377 μ g/ L，亚麻三烯(保留时间为8. 03min)约为1460 μ g/L，因此该菌产香味物质水平非常高。
【权利要求】
1. 一株产香内生细菌，所述产香内生细菌为Aflioea sp. CcSh-1，保藏号为CGMCC No.8715。
2. 如权利要求1所述的产香内生细菌在香料原料生产上的应用。
3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：将所述产香内生细菌在25 - 30°C，150到 200r/min，NB液体培养基的条件下培养1至3天，收集香味气体。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于：将所述产香内生细菌在27°C，170r/min，NB 液体培养基的条件下培养2天提取。
【文档编号】C12P7/24GK104195063SQ201410278532
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年6月20日 优先权日:2014年6月20日
【发明者】朱咏华, 刘选明, 廖红东, 张鑫, 徐婷, 李燕, 卢骁南 申请人:湖南大学