一种核酸片段及其用途
【专利摘要】本发明公开了一种核酸片段,其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本发明还公开了所述核酸片段在制备诊断乳腺癌和/或子宫内膜癌的试剂中的用途,以及由该诊断试剂组成的试剂盒。本发明还公开了该核酸片段在制备雌激素受体拮抗剂中的用途,可用于制备治疗乳腺癌的药物,具有实际应用价值。
【专利说明】-种核酸片段及其用途 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及一种核酸片段及其用途。 【背景技术】
[0002] 自20世纪70年代末开始,乳腺癌的发病在全球范围内一直位居女性肿瘤的首位, 我国虽不是乳腺癌的高发国家,但发病率却呈逐年上升的趋势。根据雌激素受体(ER)表达 情况,乳腺癌可分为雌激素受体依赖性乳腺癌和非激素受体依赖性乳腺癌。雌激素受体依 赖性乳腺癌表达雌激素受体,并依赖雌激素生长,对激素敏感、抗性弱,可以采用抗雌激素 药物治疗,而非激素受体依赖性乳腺癌不表达雌激素受体,不依赖雌激素生长,对激素的敏 感性差、抗性强,不能采用抗雌激素药物治疗。据研究,约70%的乳腺癌为雌激素受体依赖 性乳腺癌,因此,检测乳腺癌组织中的雌激素受体表达情况,确定乳腺癌是否为雌激素受体 依赖性乳腺癌,对治疗和预后具有重要意义。
[0003] 子宫内膜癌是妇科常见的恶性肿瘤,发病率仅次于子宫颈癌。根据雌激素受体表 达情况,子宫内膜癌可分为雌激素受体依赖性子宫内膜癌和非激素受体依赖性子宫内膜 癌。雌激素受体依赖性子宫内膜癌的预后较好,而非激素受体依赖性子宫内膜癌的预后较 差。据研究,约80%的子宫内膜癌为雌激素受体依赖性子宫内膜癌,因此,检测子宫内膜癌 组织中的雌激素受体表达情况,确定乳腺癌是否为雌激素受体依赖性子宫内膜癌,对治疗 和预后具有重要意义。
[0004] 现有的雌激素受体检测方法通常采用雌激素和雌激素受体抗体进行检测,其中, 雌激素因分子量太小,不能用于免疫组化检测乳腺癌和子宫内膜癌组织,难以有效定位,雌 激素受体抗体可以用于免疫组化检测,但是抗体生产是一个耗费时间的复杂过程,而且需 要动物养殖和/或细胞培养的设施。因此,急需一种更容易和更少代价的方法来对乳腺癌 中ER进行检测。
[0005] 雌激素依赖性乳腺癌的治疗方式众多,包括外科治疗、化学治疗、放射治疗和中医 中药治疗,其中,抗雌激素药物是最重要的治疗药物之一,其可以通过消除雌激素与雌激素 受体的相互作用促使癌细胞凋亡,包括雌激素受体拮抗剂例如它莫西芬,芳香化酶抑制剂 如依西美坦等。它莫西芬是目前最为常见的雌激素依赖性乳腺癌治疗药物,它通过竞争性 结合雌激素受体,抑制雌激素与雌激素受体结合,治疗乳腺癌。然而,使用它莫西芬存在严 重的耐药性,因而需要开发新的抗雌激素药物。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题,本发明涉及一种核苷酸序列及其用途,具体涉及一种能够与 雌激素受体特异性结合的核酸适体,及其在制备诊断乳腺癌和/或子宫内膜癌的试剂中的 用途和制备雌激素受体拮抗剂中的用途。
[0007] 本发明公开的的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 所述核酸片段是雌激素受体的核酸适体(Aptamer)(即ER-Aptamer),对雌激素受 体有高亲和力。
[0009] 核酸适体(aptamer)指的是经体外筛选技术SELEX (指数富集配体系统进化)筛 选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的核酸片段。
[〇〇1〇] 本发明还提供了所述核酸片段在制备诊断表达雌激素受体的组织和/或细胞的 试剂中的用途。优选地,所述诊断表达雌激素受体的组织和/或细胞的试剂是诊断雌激素 受体依赖性乳腺癌或雌激素受体依赖性子宫内膜癌的试剂。
[〇〇11] 雌激素受体依赖性乳腺癌,是指表达雌激素受体的乳腺癌。
[〇〇12] 雌激素受体依赖性子宫内膜癌,是指表达雌激素受体的子宫内膜癌。
[〇〇13] 一种诊断表达雌激素受体的组织和/或细胞的试剂,它是含有标记物的权利要求 1所述的核酸片段,所述标记物为生物素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、地高辛或荧光素。
[0014] 一种检测乳腺癌和/或子宫内膜癌的试剂盒,包括前述诊断试剂。
[0015] 优选地,它包括生物素标记的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段、链亲和 素-辣根过氧化物酶和DAB溶液;
[0016] 或者,它包括辣根过氧化酶标记的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段和 DAB溶液。
[0017] DAB溶液,即二氨基联苯胺溶液。
[0018] 所述的核苷酸序列在制备雌激素受体拮抗剂中的用途。
[0019] 所述雌激素受体拮抗剂是治疗雌激素受体依赖性乳腺癌的药物。
[0020] 雌激素受体拮抗剂,是指竞争性结合雌激素受体,抑制雌激素与雌激素受体结合 的物质。
[0021] 本发明核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所不的ER-核酸适体,与ER分子的未和力与 雌激素相当,且其分子量大,可以用于免疫组化检测表达雌激素受体的组织和/或细胞,如 乳腺癌和子宫内膜癌,同时,其还是一种雌激素受体拮抗剂,可以有效抑制乳腺癌细胞的增 殖,是一种新的乳腺癌的治疗药物,同时,本发明核酸片段的制备方法简单,成本低廉。
[0022] 显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0023] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】,对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。 【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1表示生物素标记的寡核苷酸与从MCF-7乳腺癌细胞株制备的雌激素受体(ER) 结合的饱和曲线。
[0025] 图2图1所示饱和曲线的斯卡查德(Scatchard)作图,分析寡核苷酸与雌激素受 体结合的亲和度和结合量。根据斯卡查德公式,BS = BT - BN,结果以图形方式表示,其中BT 为总结合,BN为非特异性结合,BS为特异性结合。根据曲线的斜率和在横轴上的截距计算 出寡核苷酸与雌激素受体结合的解离常数(Kd)和结合量(Bmax)。该图为一个代表性的试 验,该实验重复3次。
[0026] 图3生物素标记核苷酸序列和特异的抗ER单克隆抗体对乳房癌组织的免疫染色 比较。乳腺癌入选病例为已经病理学检测确认的癌症病例。第一行是用生物素标记核苷酸 序列的乳房癌免疫染色,第二行是用抗ER单克隆抗体的乳腺癌免疫染色。该图显示该寡核 苷酸和抗体均识别相同的癌细胞,但不识别相邻的非肿瘤组织。所有的照片都是在光学显 微镜X200的放大倍率下拍摄。
[0027] 图4使用合成的生物素标记寡核苷酸对石蜡包埋的乳腺癌和子宫内膜癌组 织切片进行免疫染色。A和E分别是子宫内膜癌和乳腺癌的样本;用生物素标记寡核 苷酸+str ept〇avidin-HRP染色。B和F分别为子宫内膜癌和乳腺癌阴性对照;仅用 str印toavidin-HRP染色。C和G分别为子宫内膜癌和乳腺癌阴性对照;将生物素标记寡核 苷酸与纯化ER蛋白进行预孵育,然后再应用到切片上。D和Η分别为子宫内膜癌和乳腺癌 阴性对照;将生物素标记的对照DNA寡核苷酸(与ER-核酸适体的序列长度相同)应用到 切片上。入选病例为已经病理学检测确认的癌症病例。该图显示生物素标记的核苷酸序列 特异性地定位组织切片中的肿瘤细胞,但不与相邻的非恶性组织发生交叉反应,而乳腺癌 和子宫内膜癌的阴性对照切片均未见特异性染色。所有图像均是光学显微镜Χ200的放大 倍率下拍摄。
[0028] 图5从10到1000 μ Μ时,它莫西芬(□)或ER-核酸适体()对MCF-7细胞增殖 存在剂量依赖性影响。细胞增殖的用ΜΤΤ法测定。数据取3次重复测量的均数土 SE。未处 理的对照定义为100%,细胞增殖的百分比与对照比较。*与对照组相比时Ρ〈〇. 05。
[0029] 图6ER-核酸适体(Α)和它莫西芬(Β)对雌激素诱导的MCF7细胞增殖的拮抗作 用。雌二醇以剂量依赖的方式增加 MCF7细胞的增殖(柱形图),而ER-核酸适体()或它 莫西芬(〇)可抑制雌二醇作用。细胞增殖采用MTT法检测。数据取3次重复测量的均数 土SE。未处理的对照定义为100%,细胞增殖的百分比与对照比较。*与雌二醇处理相比时 P〈0.05。 【具体实施方式】
[0030] 实施例1本发明核酸片段(ER-核酸适体)的制备及其与雌激素受体的结合能力 鉴定
[0031] 1、本发明雌激素受体的核酸适体的制备
[0032] 采用体外筛选技术SELEX (指数富集配体系统进化)筛选雌激素受体的核酸适体, 得到一个与雌激素受体具有高亲和力的核酸片段,其序列(SEQ ID NO. 1)如下:
[0033] 5'-GTCAGGTCACAGTGACCTGATCA AAGTTAATG-3'。
[0034] 送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0035] 2、核酸适体与雌激素受体结合能力的验证
[0036] 为了测定上述SEQ ID NO. 1所示核酸适体与雌激素受体的亲和力,采用基于ELISA 的配体-受体结合测定方法测定。
[0037] 实验步骤:
[0038] (1)对合成的SEQ ID NO. 1所示ER-核酸适体的5'末端进行生物素标记。
[0039] (2)MCF_7细胞匀浆细胞质总受体蛋白从培养的获得:将MCF-7细胞在细胞溶质 制备缓冲液(10mM的Tris-HCl,pH值7·5,lmM的EDTA,lmM的二硫苏糖醇(DTT),10%甘 油,150mM的谷氨酸钾和Sigma蛋白酶抑制剂混合物)中匀浆,再采用高速(10, OOOg),低温 (4°C )离心lh而获得细胞质总受体蛋白。
[0040] (3)将步骤⑵的提取物包被在96孔的酶标板(2 μ g/孔)。加入不同浓度生物 素标记的核酸适体或雌二醇,在37°C孵育1小时。所有的浓度均做复孔。未结合的核酸适 体通过用PBS-吐温洗液洗漆4次除去。再用Streptavidin-辣根过氧化物酶(HRP)结合 物与结合的核酸适体中生物素反应。以TMB作为底物,比色确定核酸适体的结合值。生物 素标记的核酸适体与受体的特异性结合值则是将总的结合值(无未标记的核酸适体或雌 二醇)减去非特异性结合值(加入100倍未标记的核酸适体或雌二醇)确定。
[0041] (4)根据斯卡查德(Scatchard)方程,将得到的数据进行作图。对结合亲和力(Kd) 和能力(结合位点的数目)进行计算,得到生物素标记的核酸适体与ER结合得的亲和力和 最大结合量。
[0042] 实验结果:
[0043] 生物素标记的ER-核酸适体与ER结合的饱和曲线见图1,生物素标记的ER-核酸 适体结合的Scatchard作图见图2。
[0044] 如图1?2所示,生物素标记的ER-核酸适体与ER复合物的解离常数(Kd) 为0. 34±0. 05nM(n = 3 ;r = 0. 989)。该Kd值与已报道的雌激素在乳腺癌MCF-7细 胞结合值相吻合(〇· 35ηΜ+0· 05) (Wooge C. H.,Nilsson G. M.,Heierson A.,McDonnell D.P.,Katzenellenbogen B.S. Structural requirements for high affinity ligand binding by estrogen receptors:a comparative analysis of truncated and full length estrogen receptors expressed in bacteria, yeast, and mammalian cells. Mol Endocrinol. 1992 ;6:861-869)
[0045] 实验结果说明,本发明SEQ ID NO. 1所示ER-核酸适体与雌激素受体(ER)结合具 有非常强的亲和力,与雌激素相当,是一种检测表达雌激素受体的组织或细胞的诊断试剂。
[0046] 实施例2本发明检测试剂盒
[0047] 1、试剂盒一
[0048] 试剂盒组成(50人份):
[0049]
【权利要求】
1. 一种核酸片段,其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 权利要求1所述的核酸片段在制备诊断表达雌激素受体的组织和/或细胞的试剂中 的用途。
3. 根据权利要求2所述的用途,其特征在于:所述诊断表达雌激素受体的组织和/或 细胞的试剂是诊断雌激素受体依赖性乳腺癌或雌激素受体依赖性子宫内膜癌的试剂。
4. 一种诊断表达雌激素受体的组织和/或细胞的试剂,其特征在于:它是含有标记物 的权利要求1所述的核酸片段,所述标记物为生物素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、地高辛 或荧光素。
5. -种检测表达雌激素受体的组织和/或细胞的试剂盒,其特征在于:它包括权利要 求4所述的试剂。
6. 根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:它包括生物素标记的权利要求1所述 的核酸片段、链亲和素-辣根过氧化物酶和DAB溶液; 或者,它包括辣根过氧化酶标记的权利要求1所述的核酸片段和DAB溶液。
7. 权利要求1所述的核酸片段在制备雌激素受体拮抗剂中的用途。
8. 根据权利要求7所述的用途,其特征在于:所述雌激素受体拮抗剂是治疗雌激素受 体依赖性乳腺癌的药物。
【文档编号】C12Q1/68GK104109667SQ201410289326
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】叶尚勉 申请人:叶尚勉, 四川禾力生物制药有限公司