运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体pSUZM系列及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一类运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体pSUZM1、pSUZM2和pSUZM3及其构建方法。所述的运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体是一类环状载体，pSUZM1包含来自于运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC、来自于质粒pUC18上的大肠杆菌质粒复制起点，卡那霉素筛选标记基因；pSUZM2包含来自于运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制起点、DNA复制蛋白基因序列和来自于质粒pUC18上的大肠杆菌质粒复制起点、卡那霉素筛选标记基因；pSUZM3包含来自于运动发酵内源性质粒pZZM402上的复制起点、DNA复制蛋白基因序列和来自于质粒pUC18上的大肠杆菌质粒复制起点、卡那霉素筛选标记基因。本发明的穿梭载体既能在大肠杆菌中复制，又能在运动发酵单胞菌中复制，并且在运动发酵单胞菌中能够稳定的遗传，具有很好的应用前景。
【专利说明】运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体PSUZM系列及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体pSUZMl、PSUZM2、pSUZM3及其构建方法与应用，属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]能源安全和环境问题作为全世界共同关注的焦点，燃料乙醇作为一种优良的可替代能源引起了研究者的广泛关注。运动发酵单胞菌(Zymomonasmobi I is, Z.mobilis)在生物【技术领域】的应用前景越来越受到广泛关注，它不仅可用于生产重要的化工产品，而且可用于产生燃料乙醇。与酿酒酵母和其他燃料乙醇基因工程菌相比较，运动发酵单胞菌具备许多突出的优点，比如吸收糖效率高，产生物量少；发酵时无需控制加氧；耐高渗透压和易于基因操作；乙醇耐受性强，理想的乙醇产量等等。但是，运动发酵单胞菌也具有一些不足之处，如底物范围过窄，不能利用复杂的碳水化合物转化为乙醇。除此之外，该细菌在发酵时对醪液中的盐类、pH、抑制剂比较敏感，因而需对生产过程进行严格控制。为满足对该菌的基础研究和工业应用的要求，需要创建不同的基因工程菌株，因此首先需要有优良的载体系统。 [0003]基因组DNA的复制对于一个细胞来说是极其重要的。原核生物的基因组具有一个或多个染色体，且多为环形，真细菌染色体的复制起点仅有一个，古细菌的染色体复制起点则为单个或多个。其中，真细菌的复制起始位点(oriC)片段长度从10bp到100bp不等，染色体从此处开始复制，以双复制叉的形式前行，在复制终点(terC)结束。绝大多数细菌的oriC位点位于dnaA基因附近,个别位于gidA和rpmH基因之间，或者靠近hemE基因。
[0004]细菌质粒主要有theta (Θ)和滚环两种复制形式，Θ型复制与细菌基因组复制形式相似，由RNA聚合胸(RNA polymerase)和DNA聚合胸(DNA polymerase)共同作用，以双复制叉的形式向两端进行延伸。滚环复制与部分噬菌体的复制形式相似，质粒双链中的一条链在复制起始位点区被质粒编码起始蛋白(plasmid-encodedinitiator-protein, Rep)切开,然后环状链和线状链分别进行复制。滚环复制质粒最早是在 Staphylococcusaureus 中被发现，随后在Bacillus subtilis, Clostridium butyricum,Brevibacteriumlactofermentum 等革兰氏阳性菌中均有发现，而 Zymomonasmobilis,Bacteroides, cyanobacteria,Helicobacter pylori等革兰氏阴性菌中质粒的复制也属于该复制形式。滚环复制质粒的大小从1.3kb到1kb不等，具有精简的结构，质粒上基因的转录方向大多相一致。Arvanitis等对Z.mobilis 10988内源性质粒pZMOl和pZM02的特征和复制相关组分进行了研究，将质粒PZMOl线性化后克隆到PUC19中测序，全长为1651bp，G+C含量为38%，其中开放阅读框(0RFZM01)编码348个氨基酸，与其他革兰氏阴性菌滚环复制质粒的复制蛋白高度同源。质粒PZM02全长为1669 bp，G+C含量为38.5，开放阅读框(0RFZM02)编码184个氨基酸，其N-端与滚环复制质粒的复制蛋白高度同源。
[0005]运动发酵单胞菌自身的不足限制了其在基础研究和生物【技术领域】的应用，其中一个主要的瓶颈便是缺乏基因工程菌株。为了获得乙醇生产效率高且又能利用多种碳源的运动发酵单胞菌基因工程菌，最为有效的方法是对其进行遗传改造，常规的遗传方法是利用载体携带感兴趣的外源基因，其编码的蛋白质使运动发酵单胞菌获得相应的功能。运动发酵单胞菌现有的常用载体主要有，光谱载体pBBRlMCS系列和RSF1010系列等，但这些载体均有一定的缺陷，其中pBBRlMCS系列存在结构稳定性，而载体RSF1010系列则载体偏大。因此，将运动发酵单胞菌内源性质粒和大肠杆菌的质粒进行有效整合后形成大小较为合适的穿梭载体，这种类型的载体既能在大肠杆菌中复制，又能在运动发酵单胞菌中复制，且在运动发酵单胞菌中能够稳定的遗传，具有很好的应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体pSUZMl、pSUZM2和PSUZM3及其构建方法。
[0007]本发明提供的运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体pSUZMl、pSUZM2和pSUZM3是一类环状载体。
[0008]其中复制载体pSUZMl包含来自于运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC、来自于质粒PUC18上的大肠杆菌质粒复制起点，卡那霉素筛选标记基因。
[0009]其中复制载体pSUZM2包含来自于运动发酵单胞菌内源性质粒PZZM401的复制起点、DNA复制蛋白基因序列、来自于质粒PUC18上的大肠杆菌质粒复制起点、卡那霉素筛选标记基因。
[0010]其中PSUZM3包含来自于运动发酵内源性质粒PZZM402上的复制起点、DNA复制蛋白基因序列、来自于质粒PUC18上的大肠杆菌质粒复制起点、卡那霉素筛选标记基因。
[0011]本发明的另一个目的是提供运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体pSUZMl、pSUZM2和pSUZM3的构建方法。
[0012]本发明所提供的pSUZMl的构建方法，包括如下步骤:
I)以CTAB法分别提取运动发酵单胞菌DNA。
[0013]2)以运动发酵单胞菌全基因组DNA为模板，用以下引物5’-GGCACGACAGGTTTCCTCTTCGACCAGCGGTAAG-3’ 和 5’ -CCCACTGCAAGCTACCTTCAGTCGCGGCTTCTACC-3’ 进行 PCR 扩增，得到运动发酵单胞菌复制起点片段oriC.3)以载体pUC18 模板，用以下引物 5 ’ -GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC-3，和5’ -CTTACCGCTGGTCGAAGAGGAAACCTGTCGTGCC-3’，进行PCR扩增，得到大肠杆菌质粒复制起点片段oriE-1.4)以载体pBBRlMCS-2 为模板，用以下引物 5’-GGTAGAAGCCGCGACTGAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3’和 5’-GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC-3’，进行 PCR 扩增，得到筛选标记基因片段 kan_l
5)将3个PCR产物oriC、oriE-l和kan_l分别经电泳凝胶回收后等摩尔混合，混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得重组载体pSUZMl。
[0014]本发明所提供的pSUZM2的构建方法，包括如下步骤:
I)以CTAB法分别提取运动发酵单胞菌DNA。
[0015]2)以运动发酵单胞菌全基因组DNA为模板，用以下引物5’-GGCACGACAGGTTTCCGCACCGCAAAGGACATG-3’ 和 5’ -CCCACTGCAAGCTACCTCGATTAACCGCAGGATTACG -3’ 进行 PCR 扩增，得到片段运功发酵单胞菌质粒PZZM401的复制起点和DNA复制酶基因片段oriPl
3)以载体pUC18 模板，用以下引物 5 ’ -GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC-3，和5’ - GCATGTCCTTTGCGGTGCGGAAACCTGTCGTGCC-3’，进行PCR扩增，得到大肠杆菌复制起点片段 oriE-2.4)以载体pBBRlMCS-2 为模板，用以下引物 5’-CGTAATCCTGCGGTTAATCGAGGTAGCTTGCAGTGGG-3’ 和 5’ - GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC-3’，进行 PCR 扩增，得到片段 kan_2
5)将3个PCR产物oriPl、oriE-2和kan_2分别经电泳凝胶回收后等摩尔混合，混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得重组载体PSUZM2。
[0016]本发明所提供的pSUZM3的构建方法，包括如下步骤:
I)以CTAB法分别提取运动发酵单胞菌DNA。
[0017]2)以运动发酵单胞菌全基因组DNA为模板，用以下引物5’ -GGCACGACAGGTTTCCCGGAAAGGTCATCCTG -3’ 和 5’ - CCCACTGCAAGCTACCTCTGAGGCGACGACAG -3’ 进行 PCR 扩增，得到片段运功发酵单胞菌质粒PZZM402的复制起点和DNA复制酶基因片段oriP2.3)以载体pUC18 模板，用以下引物 5’ -GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC -3’ 和5’ - CAGGATGACCTTTCCGGGAAACCTGTCGTGCC -3’，进行PCR扩增，得到大肠杆菌质粒复制起点片段 oriE-3.4)以载体pBBRlMCS-2 为模板，用以下引物 5’-CTTCTGTCGTCGCCTCAGAGGTAGCTTGCAGTGGG -3’ 和 5’ - GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC -3’，进行 PCR 扩增，得到片段 kan_3.5)将3个PCR产物oriP2、o riE-3和kan_3分别经电泳凝胶回收后等摩尔混合，混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得重组载体PSUZM3。
[0018]本发明的运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭复制载体既可以在运动发酵单胞菌中复制，也可以在大肠杆菌中复制。相对于以前使用广谱性载体，其稳定性更强，具有很好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1载体pSUZMl的构建策略 图2载体pSUZMl引物序列及其用途
图 3 载体 pSUZMl 构建凝胶电泳 Μ, λ Eco Τ14 DNA marker, 1: kan; 2: oriE; 3: oriC
图 4 载体 pSUZMl 质粒电泳图 Μ, λ Eco Τ14 DNA marker, I; 2: pSUZMl 质粒
图5载体pSUZM2的构建策略
图6载体pSUZM2引物序列及其用途
图 7 载体 pSUZM2 构建凝胶电泳 Μ, λ Eco Τ14 DNA marker, 1: kan; 2: oriE; 3: oriPl
图 8 载体 pSUZM2 质粒电泳图 M, AEco T14 DNA marker, I; 2; 3; 4; 5; 6; 7: pSUZM2 质粒
图9载体pSUZM3的构建策略
图10载体pSUZM3引物序列及其用途
图 11 载体 pSUZM3构建凝胶电泳.Μ, λ Eco T14 DNA marker, 1: kan; 2: oriE; 3: oriP2图 12 载体 pSUZM3 质粒电泳图 M, AEco T14 DNA marker, I; 2; 3; 4; 5; 6; 7: pSUZM3 质粒图 13 载体 pSUZMl-3 质粒凝胶电泳 M, AEco T14 DNA marker, I; 2pSUZMl 质粒-Nco I; 3; 4: pSUZM2 质粒-Nco I;5;6;7;8: pSUZM3 质粒-Nco I
图 14 质粒 pSUZMl，pSUZM2, pSUZM3 在Z.mobiIisWA 中的稳定性。Times:转接次数，CC:抗性菌落数
图 15 质粒 pSUZMl，PSUZM2, pSUZM3 在Z.mobilis\Q22^ 中的稳定性。Times:转接次数，CC:抗性菌落数
图 16 质粒 pSUZMl，pSUZM2, pSUZM3 在Z.mobilislQ2?,2 中的稳定性。Times:转接次数，CC:抗性菌落数
图 17 质粒 pSUZMl，pSUZM2，pSUZM3 在Z- ?ο&7Υ.529191 中的稳定性。Times:转接次数，CC:抗性菌落数
【具体实施方式】
[0020]实例I载体pSUZMl的构建
载体pSUZMl的构建策 略见图1，具体如下:
1)设计筛选标记卡那霉素抗性基因的上游引物KanCF，下游引物KanR;大肠杆菌pUC18质粒复制起点上游引物OriEF，下游引物OriECR;运动发酵单胞菌ZM4染色体复制起点上游引物OriZCF，下游引物OriZCR，具体引物序列见图2.2)以CTAB法分别提取运动发酵单胞菌DNA。取2mL菌液，12000rpm离心2min后的沉淀用TE洗涤，离心后再用ImLTE重悬菌体。加入53 μ L 10%SDS,混匀，加入IlyL 10mg/mL蛋白酶 K，混匀，37°C温育 I h。加入 211 μ L 5mol/LNaCl，再加入 146 μ L CTAB/NaCl(50 g/ LCTAB，0.5 mol/ L NaCl),混匀，65°C温育1min0加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1 )，混匀，12000rpm离心5min,保留上清。上清中加入等体积的酹:氯仿:异戍醇(25: 24: I),混匀,12000rpm离心5min,保留上清。加入0.6倍的异丙醇，混匀，12000rpm离心5min,收集DNA沉淀，用70%乙醇洗涤DNA沉淀后离心，弃上清。用100 μ LTE或去离子水溶解DNA，加入终浓度为20μ g/mLRNaseA，4°C保存。
[0021]3)以载体pBBRlMCS-2为模板，用KanCF、KanR为引物扩增片段kan_l ;以载体PUC18为模板用，0riEF、0riECR为引物扩增oriE-Ι ;以运动发酵单胞菌全基因组为模板，用OriZCF、OriZCR 为引物扩增 oriC。
[0022]PCR反应体系:2 XPCR buffer 25 μ L，上游引物1.5 μ L，下游引物1.5 μ L，模板DNA IyL,加水至 50 μ L。
[0023]PCR反应条件:98°C变性10 s，68°C延伸35s，共30个循环，72°C最后延伸5min。
[0024]PCR 结果如图 3 所示，kan-1、oriE-1、oriC PCR 产物大小分别为 1.1 kb，0.95 kb,
1.1 kb，与预期结果相符。
[0025]4) PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
[0026]5)片段不依赖基因序列和连接反应克隆(SLIC)，具体步骤如下:
在0.5mL的EP管中，按以下比例混合各组分:4 μ L 5 X T4 DNA聚合酶缓冲液(Fermentas), 0.1 μ L Τ4 DNA 聚合酶(5 U/μ L Fermentas), I μ L kan_l 片段、I μ L oriE-1片段、I μ L oriC-Ι 片段，加 ddH20 到 20 μ L。[0027]37°C孵育6 min，然后将EP管置于70°C的水浴中孵育lOmin，终止反应。取8 μ L上述Τ4 DNA聚合酶处理的DNA到另外一个新的0.5mL的EP管，加入2 μ L 10 X退火缓冲液，10 μ LddH2O0将混合物置于75°C的水浴中反应15min，然后自然冷却至室温。取5yL产物转化大肠杆菌。
[0028]6)电转化运动发酵单胞菌
挑取Z.mobilis单菌落培养于5 mL RM培养基中，得到菌液全部接种于100 mL RM培养基中，培养至OD6tltl为0.3-0.4。于4°C 6000 rpml0min收集菌体，用10 mL 10%甘油清洗菌体，于4°C 6000 rpm 10 min收集菌体，重复清洗一次,将收集到的菌体悬浮于2 mL 10%甘油中，制备感受态。
[0029]采用美国BTX公司的ECM830脉冲导入仪。将细胞悬浮液与质粒DNA注入反应小池内，并将小池插在支座上，导线与仪器连接；接通电源；根据需要选择所需的电容值、电压值和电阻值；检查上述操作无误后，开始脉冲；实验结束后，记录实验数据。
[0030]将I μ g质粒与200 μ L?.mobilis电击感受态混合后在2500 V、200 Ω、50 μ F条件下电击，电击后把菌液迅速转移至3mL RM培养基中静止恢复3 h，取100 μ L菌液涂布于含卡那霉素(200 μ g/mL)的平板,3 d后先出现转化子。
[0031]7) pSUZMl质粒的提取
接种菌落于2mL RM培养基,取1.5 mL菌液于EP管中，10, 000 rpm离心2 min,弃上清液。加入0.1mL溶液I，充分混合，静置5 min,加入0.2 mL溶液II，混匀，置冰浴上5 min,加入
0.15 mL溶液III，混匀后置冰浴上20 min。10, 000 rpm离心5 min,取上清液，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后于_20°C静置30 min。10, OOOrpm离心5 min，弃上清液，用70%乙醇清洗一次，1000rpm离心2min，弃上清，沉淀干燥后溶于50 μ L ddH20或TE中，加入0.5 μ LlOmg/mL RNaseA 37°C消化lOmin。获得重组载体pSUZMl，其质粒提取结果见图4.实例2载体pSUZM2的构建
载体PSUZM2的构建策略见图5，具体如下:
O设计筛选标记卡那霉素抗性基因的上游引物KanPlF，下游引物KanR;大肠杆菌PUC18质粒复制起点上游引物Or iEF，下游引物Or iEP IR ;运动发酵单胞菌ZM4质粒pZZM401复制起点和DNA复制酶基因上游引物OriZPlF，下游引物OriZPIR，具体引物序列见图6.2)以CTAB法分别提取运动发酵单胞菌DNA。具体步骤见实例I。
[0032]3)以载体pBBRlMCS-2为模板，用KanPlF、KanR为引物扩增kan_2 ;以载体pUC18为模板用OriEF、OriEPlR为引物扩增oriE-2 ;以运动发酵单胞菌全基因组为模板，用OriZPlF, OriZPlR 为引物扩增 OriPl0
[0033]PCR反应体系:2 XPCR buffer 25 μ L，上游引物1.5 μ L，下游引物1.5 μ L，模板DNA IyL,加水至 50 μ L。
[0034]PCR反应条件:98°C变性10 s，68°C延伸35s，共30个循环，72°C最后延伸5min。
[0035]PCR 结果如图 7 所示，kan-2、oriE-2、oriPl PCR 产物大小分别为 1.1 kb，0.95 kb,
2.8 kb，与预期结果相符。
[0036]4) PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
[0037]5)片段不依赖基因序列和连接反应克隆(SLIC)，具体步骤如下:
在0.5mL的EP管中，按以下比例混合各组分:4 μ L 5 X T4 DNA聚合酶缓冲液(Fermentas), 0.1 μ L Τ4 DNA 聚合酶(5 U/μ L Fermentas), I μ Lkan-2 片段、I μ LoriE_2片段、I μ LoriPl 片段，加 ddH20 到 20 μ L。
[0038]37°C孵育6 min，然后将EP管置于70°C的水浴中孵育lOmin，终止反应。取8 μ L上述Τ4 DNA聚合酶处理的DNA到另外一个新的0.5mL EP管，加入2 μ L 10 X退火缓冲液，10 μ LddH2Oo将混合物置于75°C的水浴中反应15min，然后自然冷却至室温。取5 μ L产物转化大肠杆菌。
[0039]6)电转化运动发酵单胞菌 具体步骤与实例I相同。
[0040]7 ) pSUZM2质粒的提取
具体步骤与实例I相同。获得重组载体PSUZM2，其质粒提取结果见图8.实例3载体pSUZM3的构建
载体PSUZM3的构建策略见图9，具体如下:
O设计筛选标记卡那抗性基因的上游引物KanPlF，下游引物KanR;大肠杆菌复制起点上游引物OriEF，下游引物OriEPlR ;运动发酵单胞菌ZM4染色体复制起点上游引物OriZPlF，下游引物OriZPIR，具体引物序列见图10.2)以CTAB法分别提取运动发酵单胞菌DNA。具体步骤见实例I。
[0041]3)以载体pBBRlMCS-2为模板，用KanP2F、KanR为引物扩增kan_3片段；以载体PUC18为模板用0 riEF、0riEP2R为引物扩增oriE_3片段；以运动发酵单胞菌全基因组为模板，用0riZP2F、0riZP2R为引物扩增oriP2片段。
[0042]PCR反应体系:2 XPCR buffer 25 μ L，上游引物1.5 μ L，下游引物1.5 μ L，模板DNA IyL,加水至 50 μ L。
[0043]PCR反应条件:98°C变性10 s，68°C延伸35s，共30个循环，72°C最后延伸5min。
[0044]PCR结果如图 11 所示，kan-3、oriE-3、oriP2 PCR产物大小分别为 1.1 kb,0.95 kb,
2.3 kb，与预期结果相符。
[0045]4) PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
[0046]5)片段不依赖基因序列和连接反应克隆(SLIC)，具体步骤如下:
在0.5mL的EP管中，按以下比例混合各组分:4 μ L 5 X T4 DNA聚合酶缓冲液(Fermentas), 0.1 μ L Τ4 DNA 聚合酶(5 U/μ L Fermentas), I μ Lkan-3 片段、I μ LoriE_3片段、I μ LoriP2 片段，加 ddH20 到 20 μ L。
[0047]37°C孵育6 min，然后将EP管置于70°C的水浴中孵育lOmin，终止反应。取8 μ L上述Τ4 DNA聚合酶处理的DNA到另外一个新的0.5mL EP管，加入2 μ L 10 X退火缓冲液，10 μ L ddH20o将混合物置于75°C的水浴中反应15min，然后自然冷却至室温。取5yL产物转化大肠杆菌。
[0048]6)电转化运动发酵单胞菌 具体步骤与实例I相同。
[0049]7 ) pSUZM3质粒的提取
具体步骤与实例I相同。获得重组载体PSUZM3，其质粒提取结果见图12.实例5复制载体pSUZMl，pSUZM2，pSUZM3的酶切鉴定
取新的 0.2ml 的 EP 管，pSUZMl，pSUZM2，pSUZM3 质粒分别 2 μ L, 10* Tango buffer I μ L,AfcoI 0.8 μ L，ddH20 6.2 μ L，37V反应3_4h，电泳检测酶切效果。
[0050]结果显示，复制载体？3似11、？3似12和？3似10用价01单酶切，酶切结果与预期大小相符(图13)。
[0051 ] 实例5载体pSUZMl，pSUZM2，pSUZM3的稳定性检测
挑取单菌落接种到RM培养基(kan，200)中，培养16 h后用于第一次接种，以后每隔24h转接一次，培养基均为RM，接种量均为1%。不同次转接培养物经过适当稀释后，涂布RM平板，然后各取160个生长菌落点接在RM培养基(kan，200 μ g/mL)平板，记录生长情况，统计平板上的菌落数，计算抗性菌落的百分数，每个样品3个重复。
[0052]结果表明(图 14)，载体 pSUZMl，pSUZM2，pSUZM3 在Ζ.mobiIisim 稳定性较好，转接10次抗性菌落数仍接近50%。复制载体PSUZM2和PSUZM3在Z.mobilisWZ25和Z.mobilisWZ25中的稳定性与在Z.mobiIisim中相当，但pSUZMl的稳定性较差，转接10次抗性菌落数接近O (图15，图16)。这3种载体转化麗^/7/^29191后，随着转接次数的增加，抗性菌落数 逐步减少，最后接近于O (图17)。
【权利要求】
1.一类能在运动发酵单胞菌-大肠杆菌中穿梭的环状载体pSUZMl、pSUZM2和pSUZM3，包含两个原核复制起点，筛选标记基因。
2.根据权利I所述的载体，其特征在于=PSUZMl包含来自于运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC和来自于质粒pUC18上的大肠杆菌质粒复制起点，卡那霉素筛选标记基因；PSUZM2包含来自于运动发酵单胞菌内源性质粒PZZM401的复制起点、DNA复制蛋白基因序列和来自于质粒PUC18上的大肠杆菌质粒复制起点、卡那霉素筛选标记基因；pSUZM3包含来自于运动发酵内源性质粒PZZM402上的复制起点、DNA复制蛋白基因序列和来自于质粒PUC18上的大肠杆菌质粒复制起点、卡那霉素筛选标记基因。
3.权利2所述的载体的构建方法，包括如下步骤: OpSUZMl的构建方法，包括 如下步骤: (1)以CTAB法分别提取运动发酵单胞菌DNA； (2)以运动发酵单胞菌全基因组DNA为模板，用以下引物5’-GGCACGACAGGTTTCCTCTTCGACCAGCGGTAAG-3’ 和 5’ -CCCACTGCAAGCTACCTTCAGTCGCGGCTTCTACC-3’ 进行 PCR 扩增，得到运动发酵单胞菌复制起点片段oriC ； (3)以载体pUC18 模板，用以下引物 5’ -GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC-3’ 和5’ -CTTACCGCTGGTCGAAGAGGAAACCTGTCGTGCC-3’，进行PCR扩增，得到大肠杆菌质粒复制起点片段oriE-Ι ； (4)以载体pBBRlMCS-2 为模板，用以下引物 5’ -GGTAGAAGCCGCGACTGAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3 ’和 5 ’ -GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC-3，，进行 PCR 扩增，得到筛选标记基因片段kan-Ι ； (5)将3个PCR产物oriC、oriE-1和kan_l分别经电泳凝胶回收后等摩尔混合,混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得权利要求2所述的载体PSUZMl ； 2)pSUZM2的构建方法，包括如下步骤: (1)以CTAB法分别提取运动发酵单胞菌DNA； (2)以运动发酵单胞菌全基因组DNA为模板，用以下引物5’-GGCACGACAGGTTTCCGCACCGCAAAGGACATG -3’ 和 5’ - CCCACTGCAAGCTACCTCGATTAACCGCAGGATTACG -3’ 进行 PCR 扩增，得到运动发酵单胞菌质粒PZZM401的复制起点和DNA复制酶基因片段oriPl ；
(3)以载体pUC18 模板，用以下引物 5’ -GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC -3’ 和5’ - GCATGTCCTTTGCGGTGCGGAAACCTGTCGTGCC -3’，进行PCR扩增，得到大肠杆菌质粒复制起点片段oriE-2 ； (4)以载体pBBRlMCS-2 为模板，用以下引物 5’-CGTAATCCTGCGGTTAATCGAGGTAGCTTGCAGTGGG -3’和 5’- GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC -3’，进行PCR扩增，得到片段kan_2 ； (5)将3个PCR产物oriPl、oriE-2和kan_2分别经电泳凝胶回收后等摩尔混合，混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得权利要求2所述的载体PSUZM2 ； 3)pSUZM3的构建方法，包括如下步骤: (1)以CTAB法分别提取运动发酵单胞菌DNA； (2)以运动发酵单胞菌全基因组DNA为模板，用以下引物5’-GGCACGACAGGTTTCCCGGAAAGGTCATCCTG -3’ 和 5’ - CCCACTGCAAGCTACCTCTGAGGCGACGACAG -3’ 进行 PCR 扩增，得到运动发酵单胞菌质粒PZZM402的复制起点和DNA复制酶基因片段oriP2 ；
(3)以载体pUC18 模板，用以下引物 5’ -GGGCTTCGGAATCGAGGATCTAGGTGAAGATCC -3’ 和5’ - CAGGATGACCTTTCCGGGAAACCTGTCGTGCC -3’，进行PCR扩增，得到大肠杆菌复制起点片段oriE-3 ； (4)以载体pBBRlMCS-2 为模板，用以下引物 5’-CTTCTGTCGTCGCCTCAGAGGTAGCTTGCAGTGGG -3’ 和 5’ - GGATCTTCACCTAGATCCTCGATTCCGAAGCCC -3’，进行 PCR 扩增，得到片段 kan_3 ； (5)将3个PCR产物oriP2、oriE-3和kan_3分别经电泳凝胶回收后等摩尔混合，混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得权利要求2所述的载体 PSUZM3。
【文档编号】C12N15/74GK104031932SQ201410296217
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月27日 优先权日:2014年6月27日
【发明者】谭雪梅, 曹庆华, 张义正, 王海燕, 冯红 申请人:四川大学