基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统及应用，由核酸酶TALEN和pMD18载体组成，核酸酶TALEN为剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子，TALEN由识别所述靶序列5’端的核酸酶TALEN-L和识别所述靶序列3’端的核酸酶TALEN-R组成；pMD18载体为插入人类AR定点突变基因的PMD18同源重组模板质粒，pMD18载体由靶基因的相应上下游序列和嘌呤霉素筛选标记组成。本发明使细胞基因组在TALEN切断双链DNA分子时，利用pMD18载体提供的同源序列，高效精确地对基因组进行编辑；采用导入同源序列以重新编辑DNA序列的同时，带入嘌呤霉素抗性基因，从而大大简化筛选过程中的人工劳动。
【专利说明】基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，特别是涉及基于TALEN和pMD18载体的人类AR基因定 点突变系统及其基因组水平定点突变系统的应用。
【背景技术】
[0002] 基因组靶向修饰是近年来生命科学研究的热点之一，特别是在基因治疗人类疾病 方面，基因组靶向修饰具有广阔的应用前景。通过转基因或者基因敲除等操作改变基因的 遗传组成，获得满足各种需要的基因工程工具。传统较常用的转基因方法为质粒稳定转染 法、反转录病毒携带法和同源重组法。但质粒转染稳定筛选的插入位点随机，且需要抗生素 维持，容易导致非正常的细胞表型；而反转录病毒携带目的基因的效率虽高，但是插入位点 不确定，影响其它内源基因的表达，限制了该方法的应用；另外，同源重组法虽然可以定点 插入，但是成功率很低(重组概率为1〇_ 6-1〇_7)。
[0003] 目前，基因组工程学中的三大利器为：ZFN (Zinc Finger Nucleases)、TALEN (Transcription Activator-like Effector Nuclease)和 CRISPR/Cas9〇
[0004] ZFN是指锌指蛋白，是转录因子，每个模块识别3-4个碱基序列，将这些模块混合 搭配，可以靶定任何序列，然后，通过C末端的Fok I核酸内切酶结构域可以切断双链DNA分 子。Sangamo生物科学公司和Sigma- Aldrich公司已经将ZFN技术商业化，推出CompoZr? ZFN平台。但是，由于锌指蛋白之间存在相互作用，锌指模块与DNA序列之间没有一个简单 的对应关系，所以以锌指蛋白为基础设计针对序列特异性DNA结合蛋白依然是个难题，并 且花费昂贵，经常要做大规模的筛选，构建过程长达几周至数月。
[0005] CRISPR/Cas9系统是由短的向导RNA介导，Cas9核酸酶在特定的双链DNA位点上 产生断裂。CRISPR/Cas可通过添加多个向导RNA而实现多重编辑。然而，由于向导RNA序 列比ZFN或TALEN所祀定的序列短，致使脱祀效应高。但Church最近发现，通过利用Cas9 的一种突变形式(只切割单链DNA)和两个紧挨着的向导RNA，有可能大大提高系统的切割 位点保真性，降低脱靶效应。
[0006] TALEN技术是一种崭新的分子生物学工具。TALEN是转录激活样效应因子，来源 于黄单胞杆菌。利用TALEN蛋白的核酸结合结构域的氨基酸序列与核酸序列有恒定的对 应关系，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，再通过添加非特异内切酶Fok I 结构域，TALEN蛋白在理论上可以靶向切割任意基因组DNA双链。TALEN蛋白中DNA结 合域为高度保守的重复单元，每个重复单元含有34个氨基酸，除了第12和13位氨基酸 变化外，其它氨基酸都是相同的，这两个可变氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基 (repeatvariable di-residues，RVD)，与碱基识别相关。TALEN识别DNA的机制在于每个 重复序列的RVD可以特异识别DNA的1个碱基，HD特异识别C碱基，NI识别A碱基，NN识 另Ij G碱基，NG识别T碱基。另外，通过对天然TALEN的研究发现，TALEN蛋白框架固定识别 1个T碱基，所以TALEN的识别序列总是以T碱基开始。
[0007] 在真核细胞内，TALEN切割的双链DNA，可以激活两条保守的DNA修复通路。非同源 末端连接修复（non-homologous end joining, NHEJ)，细胞基本上磨平断裂DNA的两端，再 将其彼此拉近，将断裂的染色体重新连接，这个过程往往产生移码，或者在断裂位点引进小 片段插入或删除，影响基因功能或产生基因敲除效应。同源指导修复（homology-directed repair，HDR)是指利用相似序列的DNA供体模板，代替断裂点周围的DNA序列，从而实现特 定突变或导入外源DNA序列的目的。在本发明专利中，采用携带同源模板的pMD18载体共 同转染细胞系的方法，使细胞基因组在TALEN切断双链DNA分子时，利用pMD18载体提供的 同源序列，高效精确地对基因组进行编辑。
[0008] TALEN技术可以广泛的应用于基因组编辑的各个方面：细胞水平的基因敲除，定 点突变，结构域缺失，定点整合等等，在疾病治疗领域具有广泛的应用前景。目前TALEN技 术主要的缺陷是效率相对较低，一般在5%-20%，无法直接获取100%编辑的细胞，只能通过 挑选阳性的单克隆细胞，扩增成为稳定株。在本发明专利中，采用导入同源序列以重新编辑 DNA序列的同时，带入嘌呤霉素抗性基因，从而大大简化筛选过程中的人工劳动。
【发明内容】
[0009] 基于此，本发明的目的是提供一种基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统及应 用，采用携带同源模板的PMD18载体共同转染细胞系的方法，使细胞基因组在TALEN切断双 链DNA分子时，利用pMD18载体提供的同源序列，高效精确地对基因组进行编辑；采用导入 同源序列以重新编辑DNA序列的同时，带入嘌呤霉素抗性基因，从而大大简化筛选过程中 的人工劳动。
[0010] 为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的： 一种基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统，由核酸酶TALEN和pMD18载体组成，所 述核酸酶TALEN为剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子，TALEN由识别所述靶序 列5'端的核酸酶TALEN-L和识别所述靶序列3'端的核酸酶TALEN-R组成；所述pMD18载 体为插入人类AR定点突变基因的pMD18同源重组模板质粒，pMD18载体由靶基因的相应上 下游序列和嘌呤霉素筛选标记组成。
[0011] 所述定点突变系统的定点突变方法为：切割目标基因组所形成的DNA断裂位点通 过同源重组修复，将一对TALEN质粒和携带同源重组基因的质粒共同转染受体细胞，TALEN 质粒表达的蛋白会在受体细胞基因组TALEN靶点的位置上切开一个口；外源基因会在切口 处同源重组入受体基因组；所述的目标基因为人类雄激素受体AR基因。
[0012] 一种基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统的应用，包括细胞株的构建和定点 突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR基因的应用，所述细胞株的构建方法如 下：对转染后的受体细胞进行稀释培养，药物筛选，获得细胞克隆，鉴定外源基因在受体细 胞基因组上整合的情况，挑选出符合整合位置要求的阳性细胞克隆； 所述定点突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR基因的应用为采用权利要 求2所述的定点突变系统为将相应质粒转入人类正常前列腺细胞系中，准确识别人类AR基 因的特定序列，并在基因组中实现定点突变，获得的稳定细胞株可以稳定传代。
[0013] 所述构建的细胞株为细胞株RWPE-AR-K0,所述细胞株为人正常前列腺离体细胞系 RWPE-I改造的细胞株，不表达AR蛋白。
[0014] 所述核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R ;所述pMD18载体包括 PMD18载体的第2外显子上游的同源左臂序列核苷酸和pMD18载体的第2外显子下游的同 源右臂序列核苷酸。
[0015] 所述构建的细胞株为细胞株RWPE-E872Q，所述细胞株RWPE-E872Q为人正常前列 腺离体细胞系RWPE-I改造的细胞株，稳定表达第872位氨基酸残基由谷氨酸突变为谷氨酰 胺的AR蛋白。
[0016] 所述构建的细胞株为细胞株RWPE-H874Y，所述细胞株RWPE-H874Y为人正常前列 腺离体细胞系RWPE-I改造的细胞株，稳定表达第874位氨基酸残基由组氨酸突变为酪氨酸 的AR蛋白。
[0017] 所述构建的细胞株为细胞株RWPE-T877A，所述细胞株RWPE-T877A为人正常前列 腺离体细胞系RWPE-I改造的细胞株，稳定表达第877位氨基酸残基由苏氨酸突变为丙氨酸 的AR蛋白。
[0018] 所述构建的细胞株为细胞株RWPE-T877S，所述细胞株RWPE-T877S为人正常前列 腺离体细胞系RWPE-I改造的细胞株，稳定表达第877位氨基酸残基由苏氨酸突变为丝氨酸 的AR蛋白。
[0019] 所述构建的细胞株为细胞株RWPE-M886I，所述细胞株RWPE-M886I为人正常前列 腺离体细胞系RWPE-I改造的细胞株，稳定表达第886位氨基酸残基由蛋氨酸突变为异亮氨 酸的AR蛋白。
[0020] 所述核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN Mut L和核酸酶TALEN Mut R ;所述pMD18载 体包括PMD18载体的携带点突变位点的同源左臂序列核苷酸和pMD18载体的第8外显子下 游的同源右臂序列核苷酸。
[0021] 所述人细胞株转染的pMD18载体含有抗嘌呤霉素的基因，能将嘌呤霉素抗性基因 带入基因组，从而表达抗嘌呤霉素的蛋白。
[0022] 本发明的有益效果如下： 本发明基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统及应用，由剪切目的基因靶序列的转 录激活子样效应因子核酸酶TALEN和插入人类AR定点突变基因的pMD18同源重组模板质 粒组成，并将该相应质粒转染入人类正常前列腺细胞系中，获得稳定细胞株，表达点突变的 AR。该系统能够准确识别人类AR基因的特定序列，并在基因组中实现定点突变，获得的稳 定细胞株可以稳定传代，遗传背景清晰，准确表达定点突变的AR。
[0023] 本发明采用携带同源模板的pMD18载体共同转染细胞系的方法，使细胞基因组在 TALEN切断双链DNA分子时，利用pMD18载体提供的同源序列，高效精确地对基因组进行编 辑；采用导入同源序列以重新编辑DNA序列的同时，带入嘌呤霉素抗性基因，从而大大简化 筛选过程中的人工劳动。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为人类雄激素受体AR蛋白的结构示意图和mRNA的结构示意图：其中，深色框 显示AR蛋白的结构域，包括：转录激活区、DNA结合区、铰链区和配体结合区，及各自对应的 外显子；黑色框显示Q重复区，为富含谷氨酰胺残基的区域；箭头标识突变位点； 图2为人类雄激素受体AR基因的序列图，AR基因由8个外显子和7个内含子组成，下 划线的序列为外显子序列；框出的序列为TALEN的识别位点；箭头指示出点突变的目标碱 基和本发明人工改造的替换碱基；其他序列已经省略； 图3为pMD18载体骨架的示意图； 图4为TALEN识别序列的上游(左）同源臂序列； 图5为TALEN识别序列的下游(右）同源臂序列； 图6为TALEN MutlE872Q识别序列上游的同源臂序列，带入突变体Mutl的突变位点 G/C ； 图7为TALEN Mut2 H874Y识别序列上游的同源臂序列，带入突变体Mut2的突变位点 C/T ； 图8为TALEN Mut3 T877A识别序列上游的同源臂序列，带入突变体Mut3的突变位点 A/G； 图9为TALEN Mut4 T877S识别序列上游的同源臂序列，带入突变体Mut4的突变位点 A/T ； 图10为TALEN Mut5 M886I识别序列上游的同源臂序列，带入突变体Mut5的突变位点 G/T ； 图11为TALEN Mut识别序列下游的同源臂序列； 图12为TALEN识别位点的上下游同源臂扩增电泳结果，TALEN Mut识别位点的上游5 种同源臂，分别带入人类雄激素受体AR基因的5种定点突变，和TALEN Mut识别位点下游 的同源臂的扩增电泳图，M为DL2000,自上而下的条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp 和 100bp。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于 此。
[0026] 本发明中基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统，由核酸酶TALEN和pMD18载 体组成，核酸酶TALEN为剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子，TALEN由识别所述 靶序列5'端的核酸酶TALEN-L和识别所述靶序列3'端的核酸酶TALEN-R组成；pMD18载 体为插入人类AR定点突变基因的pMD18同源重组模板质粒，pMD18载体由靶基因的相应上 下游序列和嘌呤霉素筛选标记组成。
[0027] 定点突变系统的定点突变方法为：切割目标基因组所形成的DNA断裂位点通过同 源重组修复，将一对TALEN质粒和携带同源重组基因的质粒共同转染受体细胞，TALEN质粒 表达的蛋白会在受体细胞基因组TALEN靶点的位置上切开一个口；外源基因会在切口处同 源重组入受体基因组；目标基因为人类雄激素受体AR基因，所述的DNA序列为核苷酸序列。
[0028] 本发明基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，包括细胞株的构建和定 点突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR基因的应用，所述细胞株的构建方法 如下：对转染后的受体细胞进行稀释培养，药物筛选，获得细胞克隆，鉴定外源基因在受体 细胞基因组上整合的情况，挑选出符合整合位置要求的阳性细胞克隆； 本发明定点突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR基因的应用为采用权利 要求2所述的定点突变系统为将相应质粒转入人类正常前列腺细胞系中，准确识别人类AR 基因的特定序列，并在基因组中实现定点突变，获得的稳定细胞株可以稳定传代。
[0029] 本发明中构建的细胞株为细胞株RWPE-AR-K0,所述细胞株细胞株为人正常前列腺 离体细胞系RWPE-I改造的细胞株，不表达AR蛋白。
[0030] 本发明中核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R，核酸酶TALEN-L 识别序列如SEQ ID NO. 1所示，核酸酶TALEN-R识别序列如SEQ ID NO. 2所示；pMD18载体 包括PMD18载体的第2外显子上游的同源左臂序列核苷酸和pMD18载体的第2外显子下游 的同源右臂序列核苷酸，PMD18载体的第2外显子上游的同源左臂序列如图4所示核苷酸， PMD18载体的第2外显子下游的同源右臂序列如图5所示核苷酸。
[0031] 本发明中构建的细胞株为细胞株RWPE-E872Q，细胞株RWPE-E872Q为人正常前列 腺离体细胞系RWPE-I改造的细胞株，稳定表达第872位氨基酸残基由谷氨酸突变为谷氨酰 胺的AR蛋白。
[0032] 本发明中构建的细胞株为细胞株RWPE-H874Y，细胞株RWPE-H874Y为人正常前列 腺离体细胞系RWPE-I改造的细胞株，稳定表达第874位氨基酸残基由组氨酸突变为酪氨酸 的AR蛋白。
[0033] 本发明中构建的细胞株为细胞株RWPE-T877A，细胞株RWPE-T877A为人正常前列 腺离体细胞系RWPE-I改造的细胞株，稳定表达第877位氨基酸残基由苏氨酸突变为丙氨酸 的AR蛋白。
[0034] 本发明中构建的细胞株为细胞株RWPE-T877S，细胞株RWPE-T877S为人正常前列 腺离体细胞系RWPE-I改造的细胞株，稳定表达第877位氨基酸残基由苏氨酸突变为丝氨酸 的AR蛋白。
[0035] 本发明中构建的细胞株为细胞株RWPE-M886I，细胞株RWPE-M886I为人正常前列 腺离体细胞系RWPE-I改造的细胞株，稳定表达第886位氨基酸残基由蛋氨酸突变为异亮氨 酸的AR蛋白。
[0036] 本发明中核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN Mut L和核酸酶TALEN Mut R，核酸酶 TALEN Mut L识别序列如SEQ ID NO. 3所示，核酸酶TALEN Mut R识别序列如SEQ ID NO. 4 所示；PMD18载体包括pMD18载体的携带点突变位点的同源左臂序列核苷酸和pMD18载体 的第8外显子下游的同源右臂序列核苷酸，pMD18载体的携带点突变位点的同源左臂序列 如图6-11所示核苷酸，pMD18载体的第8外显子下游的的同源右臂序列如图12所示核苷 酸。
[0037] 本发明中人细胞株转入的pMD18载体含有抗嘌呤霉素的基因，能将嘌呤霉素抗性 基因带入基因组，从而表达抗嘌呤霉素的蛋白。
[0038] 本发明的第一方面，提供2对剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子核酸 酶TALEN质粒，分别在人类AR基因的2个位点切断DNA双链，造成定点插入外源同源重组 序列的位点。其中，TALEN-L的识别序列如SEQ ID NO. 1所示，TALEN-R的识别序列如SEQ ID NO. 2所示。TALEN Mut L的识别序列如SEQ ID NO. 3所示，TALEN Mut R的识别序列如 SEQ ID NO. 4 所示。
[0039] 本发明的第二方面，提供5种定点改造人类AR基因的同源重组质粒，质粒的骨架 为PMD18载体，带有嘌呤霉素抗性基因。定点改造的人类AR基因序列如图6-11所示，扩增 同源序列的引物如SEQ ID NO. 9-19所示。
[0040] 进一步，提供AR敲除的同源臂扩增引物如SEQ ID N0.5-8所示。
[0041] 本发明的第三方面，提供一种构建稳定表达人类AR点突变体的细胞株的方法，该 细胞株的构建方法使用上述2对TALEN质粒中的一对，分别与5种同源重组模板pMD18质 粒组合。用脂质体包裹质粒混合物转染人类正常前列腺细胞系RWPE-I，嘌呤霉素筛选出稳 定整合点突变AR基因的细胞株，并传代、冻存、建系。
[0042] 本发明的第四方面，采用上述方法构建的5种细胞株：RWPE-E872Q，RWPE-H874Y， RWPE-T877A，RWPE-T877S和RWPE-M886I。遗传背景清楚，可以稳定传代，点突变AR表达稳 定，有嘌呤霉素抗性。
[0043] 具体操作过程按照下面步骤进行： (1) 根据需整合到受体细胞基因组上的位置而设计出识别特异序列的TALEN ; (2) 根据设计出的TALEN靶点序列构建TALEN质粒，同时，构建外源基因质粒； (3) 将TALEN质粒和外源基因共同转染受体细胞，TALEN质粒表达的蛋白会在受体细 胞基因组TALEN靶点的位置上切开一个口；外源基因会在切口处整合进入受体基因组； (4) 对转染后的受体细胞进行稀释培养，嘌呤霉素筛选，获得细胞克隆，鉴定外源基因 在受体细胞基因组上整合的情况，挑选出符合整合要求的阳性细胞克隆。
[0044] (5)所述的转染后得到的细胞克隆采用核酸PCR技术或测序进行鉴定，对外源基 因在受体细胞基因组上整合的细胞克隆传达、冻存、建系。
[0045] 本发明实施例中未注明具体条件的实验方法。通常按照常规条件，例如分子克隆 实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。涉 及的化学试剂盒、生物制品，如未特殊说明，表明它们均为商品化产品。
[0046] TALEN试剂盒购自上海斯丹赛生物技术有限公司。用于原代细胞/普通细胞/肿 瘤细胞基因打靶的专用TALEN载体包括10个，左右臂各5个，它们均含有CMV启动子，NLS， N端，C端，Fok I，嘌呤霉素抗性基因(仅在左臂)等基本结构。载体间的不同之处在于TALEN 识别序列的最后一个碱基的不同，分为A/T/C/G四种，此外，包括一个带有EGFP荧光标记的 TALEN右臂。左右臂骨架的Fok I序列不同，在TALEN作用时，Fok I酶会形成一个异源二 聚体的结构，大大增加TALEN切割的效率。
[0047] pMD18载体购自上海斯丹赛生物技术有限公司，经本发明发明人改建插入左右同 源重组臂。
[0048] 实施例中使用的细胞为人类正常前列腺细胞系RWPE-1，购自ATCC。
[0049] 实施例1 人类雄激素受体基因AR序列分析 从NCBI数据库下载人类雄激素受体基因AR的序列（NG_009014. 2)。序列分析显示该 基因包括8个外显子，7个内含子，如图2所示。按照基因敲除的一般原则，该基因的第二和 第三外显子为理想的敲除靶标位点，本实施例以第二外显子为敲除靶序列。
[0050] 序列的设计 根据人类雄激素受体基因AR的序列特征，我们选择第二外显子上的序列作为TALEN作 用的靶序列，人类雄激素受体基因AR第二外显子核苷酸序列如图2所示，根据TALEN原理 将结构为T (N11-18)的核苷酸序列SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2作为TALEN识别的靶位 点，其中N为A，G，T和C中的任一碱基。
[0051] 表达载体的构建 按照上海斯丹赛生物技术有限公司提供的试剂盒说明书构建核酸酶TALEN左右臂表 达载体。转化大肠杆菌感受态细胞，扩增后送测序，选择表达正确TALEN-L和TALEN-R的大 肠杆菌克隆进行大量扩增，提取质粒，用于后续试验。
[0052] 同源重组模板质粒pMD 18的改建 按照人类雄激素受体AR基因的序列（如图2所示)，在TALEN打靶位点的上下游 500-1000bp的距离内设计上下游同源臂的扩增引物，序列如SEQ ID NO. 5-8所示。
[0053] 高保真pfu酶扩增出的上游(左同源臂)片段(产物如图4所示，PCR扩增后的电泳 结果如图12所示)经BamH I和EcoR I双酶切后，插入pMD18骨架载体中；下游(右同源臂） 片段(产物如图5所示，PCR扩增后的电泳结果如图12所示）经Hind III和Xba I双酶切 后，插入PMD18骨架载体中。经连接、转化、测序验证得到正确插入上下游同源臂的pMD18 质粒。大量扩增后，提取质粒，用于后续试验。
[0054] 建立敲除人类雄激素受体AR的前列腺细胞株RWPE-AR-KO 细胞的培养：人类正常前列腺细胞系RWPE-I购自ATCC，用含有10%胎牛血清的1640 培养基于37°C，5% C02孵箱中培养。将对数生长期的细胞用胰酶消化于转染前一天铺6孔 板，使其转染时汇合率达到80%。
[0055] 质粒转染：按照Fugene 6说明书进行操作。TALEN-L质粒和TALEN-R质粒每6孔 板各2ug，pMD18质粒每6孔板0. 5ug。另外，按质粒：脂质体=1:3比例预混脂质体混合物。
[0056] 嘌呤霉素筛选：转染后24小时，换含0. 5ug/ml嘌呤霉素的完全培养液筛选3-4 天，待对照组细胞全部死亡，稀释传代于IOcm培养皿中培养，使细胞之间保持适当距离，便 于形成单个克隆，培养时可加嘌呤霉素也可不加嘌呤霉素，因为同源重组序列已经携带嘌 呤霉素抗性基因至基因组中，可以稳定遗传。
[0057] PCR扩增及测序鉴定：提取细胞基因组DNA，采用同源臂扩增引物SEQ ID NO. 5和 SEQ ID NO. 8进行PCR扩增验证和测序验证。 实施例2 实施例2与实施例1的不同之处在于：①实施例2的目的是构建5种人类雄激素受体 AR点突变体，而实施例1的目的是敲除AR，使其失活；②基于实施例2与实施例1的目的不 同，TALEN-L和TALEN-R的识别位点在人类雄激素受体AR基因的第8外显子下游，如图2所 示；③基于实施例2中的点突变位点均位于AR基因的第8外显子，故它们可以共用同源重 组右臂，如图11所示，由引物SEQ ID NO. 18和SEQ ID NO. 19扩增；④5种AR点突变体均 为人工设计合成引物带入突变位点，突变位点均为下游引物（如SEQ ID NO. 10、12、14、15、 17所示）带入，产物如图6-10所示。并且，上下游同源臂(左右同源臂）之间带有嘌呤霉素 抗性基因。
[0058] 本发明基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统及其应用，由剪切目的基因靶序 列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN和插入人类AR定点突变基因的pMD18同源重组 模板质粒组成，并将该相应质粒转入人类正常前列腺细胞系中，获得稳定细胞株，表达点突 变的AR。该系统能够准确识别人类AR基因的特定序列，并在基因组中实现定点突变，获得 的稳定细胞株可以稳定传代，遗传背景清晰，准确表达定点突变的AR。
[0059] 本发明采用携带同源模板的pMD18载体共同转染细胞系的方法，使细胞基因组在 TALEN切断双链DNA分子时，利用pMD18载体提供的同源序列，高效精确地对基因组进行编 辑；采用导入同源序列以重新编辑DNA序列的同时，带入嘌呤霉素抗性基因，从而大大简化 筛选过程中的人工劳动。
[0060] 上述实施例仅用于解释说明本发明的发明构思，而非对本发明权利保护的限定， 凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应落入本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 一种基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统，其特征在于：由核酸酶TALEN和 PMD18载体组成，所述核酸酶TALEN为剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子， TALEN由识别所述靶序列5'端的核酸酶TALEN-L和识别所述靶序列3'端的核酸酶TALEN-R 组成；所述PMD18载体为插入人类AR定点突变基因的pMD18同源重组模板质粒，pMD18载 体由靶基因的相应上下游序列和嘌呤霉素筛选标记组成。
2. 如权利要求1基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统，其特征在于所述定点突变 系统的定点突变方法为：切割目标基因组所形成的DNA断裂位点通过同源重组修复，将一 对TALEN质粒和携带同源重组基因的质粒共同转染受体细胞，TALEN质粒表达的蛋白会在 受体细胞基因组TALEN靶点的位置上切开一个口；外源基因会在切口处同源重组入受体基 因组；所述的目标基因为人类雄激素受体AR基因。
3. -种基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于包括：细胞株的 构建和定点突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR基因的应用；所述细胞株的 构建方法如下：对转染后的受体细胞进行稀释培养，药物筛选，获得细胞克隆，鉴定外源基 因在受体细胞基因组上整合的情况，挑选出符合整合位置要求的阳性细胞克隆； 所述定点突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR基因的应用为采用权利要 求2所述的定点突变系统为将相应质粒转入人类正常前列腺细胞系中，准确识别人类AR基 因的特定序列，并在基因组中实现定点突变，获得的稳定细胞株可以稳定传代。
4. 如权利要求3所述基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于：所 述构建的细胞株为细胞株RWPE-AR-KO,所述细胞株为人正常前列腺离体细胞系RWPE-I改 造的细胞株，不表达AR蛋白。
5. 如权利要求4所述基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于： 所述核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R ;所述pMD18载体包括pMD18载 体的第2外显子上游的同源左臂序列核苷酸和pMD18载体的第2外显子下游的同源右臂序 列核苷酸。
6. 如权利要求3所述基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于：所 述构建的细胞株为细胞株RWPE-E872Q，所述细胞株RWPE-E872Q为人正常前列腺离体细胞 系RWPE-I改造的细胞株，稳定表达第872位氨基酸残基由谷氨酸突变为谷氨酰胺的AR蛋 白。
7. 如权利要求3所述基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于：所 述构建的细胞株为细胞株RWPE-H874Y，所述细胞株RWPE-H874Y为人正常前列腺离体细胞 系RWPE-I改造的细胞株，稳定表达第874位氨基酸残基由组氨酸突变为酪氨酸的AR蛋白。
8. 如权利要求3所述基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于：所 述构建的细胞株为细胞株RWPE-T877A，所述细胞株RWPE-T877A为人正常前列腺离体细胞 系RWPE-I改造的细胞株，稳定表达第877位氨基酸残基由苏氨酸突变为丙氨酸的AR蛋白。
9. 如权利要求3所述基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于：所 述构建的细胞株为细胞株RWPE-T877S，所述细胞株RWPE-T877S为人正常前列腺离体细胞 系RWPE-I改造的细胞株，稳定表达第877位氨基酸残基由苏氨酸突变为丝氨酸的AR蛋白。
10. 如权利要求3所述基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于： 所述构建的细胞株为细胞株RWPE-M886I，所述细胞株RWPE-M886I为人正常前列腺离体细 胞系RWPE-I改造的细胞株，稳定表达第886位氨基酸残基由蛋氨酸突变为异亮氨酸的AR 蛋白。
11. 如权利要求6-10任一权利要求所述基于TALEN和PMD18载体的定点突变系统的应 用，其特征在于：所述核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN Mut L和核酸酶TALEN Mut R ;所述 PMD18载体包括pMD18载体的携带点突变位点的同源左臂序列核苷酸和pMD18载体的第8 外显子下游的同源右臂序列核苷酸。
12. 如权利要求6-10任一权利要求所述基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应 用，其特征在于：所述人细胞株转入的PMD18载体含有抗嘌呤霉素的基因，能将嘌呤霉素抗 性基因带入基因组，从而表达抗嘌呤霉素的蛋白。
【文档编号】C12N9/22GK104212778SQ201410299205
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】宋春娇, 茹国美, 郎娟, 郭艳, 张 林 申请人:绍兴市人民医院