一种免疫复合物吸附细胞的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种免疫复合物吸附细胞的制作方法，步骤包括载体构建、病毒包装制作、永生化B淋巴细胞制作和基因转染，本发明制作出了一套分别携带有特定基因的永生化的细胞，具有永生化(无限增殖分裂能力)和表达某一种免疫复合物受体于细胞表面的能力，通过扩增培养的细胞，建立免疫复合物分析组合，一次可以对血液或者身体组织的各种免疫复合物进行识别、分类、定量。还具有低成本无限增殖、检测速度快，操作简单等特点。本发明的目的是为了得到永生化的B淋巴细胞，该B淋巴细胞是能稳定表达一种免疫复合物受体基因，并且该受体能在细胞膜上存在，并能结合细胞外的对应的一种免疫复合物，并不局限于永生化B细胞。
【专利说明】一种免疫复合物吸附细胞的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种细胞制作的方法，具体是一种免疫复合物吸附细胞的制作方法。
【背景技术】
[0002] 免疫复合物：抗体与抗原结合所得到的一种复合物称为免疫复合物，是由各种免 疫细胞吞噬细菌，病毒，致敏物质共同死亡后结合而形成的，所以又称抗原一抗体复合物。 它在正常情况下，小分子可溶性免疫复合物被肾小球滤过排出，大分子不溶免疫复合物被 巨噬细胞吞噬消灭，这是机体防御机制的一部分。但在某些情况下，抗原与抗体在体内形成 的免疫复合物，沉积于血管壁基底部，从而激活补体，被激活的补体，发挥溶解细菌、病毒、 肿瘤细胞等作用。
[0003] 永生化细胞：一种细胞生物学术语。指动物细胞脱分化失败，受到病毒感染，外源 恶意代码转染，辐射或药剂作用后，细胞分裂次数限制机制和DNA检查-自毁机制失灵，导 致具有无限分裂生长的能力的过程。细胞永生化是癌变的必经途径。
[0004] 抗原和相应抗体结合形成的物质称为免疫复合物。由于免疫复合物能在循环血液 中检测到，故亦称之为循环免疫复合物。它和补体、其他免疫活性物质结合，沉积在血管壁， 可导致组织损伤及血管炎，引起一系列的疾病，如红斑狼疮。免疫复合物在体内存在有两种 方式，一是存在于血液中的循环免疫复合物（CIC)，一是组织中固定的免疫复合物。免疫复 合物的检测技术可分为抗原特异性方法和非抗原特异性方法。在大多数情况下，免疫复合 物中的抗原性质不太清楚或非常复杂，所以抗原特异性方法并不常用。
[0005] 根据形成免疫复合物的抗原-抗体的已知或未知的将CIC分为两大类，前者为特 异性免疫复合物（如乙型肝炎的HBsAg-抗-HBs，甲状腺蛋白抗原-甲状腺球蛋白抗体形成 的免疫复合物）；后者为非特异性免疫复合物（如肾小球肾炎、系统性红斑狼疮等）。
[0006] 抗原与抗体在体内形成的免疫复合物，沉积于血管壁基底部，从而激活补体，被激 活的补体，发挥溶解细菌、病毒、肿瘤细胞等作用。
[0007] 免疫复合物的疾病有：
[0008] 1)血清病：是由大小免疫复合物沉积在毛细血管壁，补体、吞噬细胞参与反应所 致。
[0009] 2)免疫复合物型肾小球炎：是由链球菌可溶性抗原与抗体结合，沉积于肾小球基 底膜，激活补体，吸引中性粒细胞，释放各种酶类损伤肾小球所致。
[0010] 3)类风湿性关节炎：是由类风湿因子与免疫球蛋白IgG结合形成的免疫复合物， 沉积于关节骨膜、皮下组织等处引起类风湿关节炎等。
[0011] 4)系统性红斑狼疮（SLE):是自身免疫疾病的一种，其病理机制还未明确，但 患者血清中常含有多种自身抗体和大量致病性循环免疫复合物（circ μ Lating immune complexes，CIC)，CIC的出现会激活补体，并沉积于毛细血管壁、肾小球基底膜以及其他血 管外组织中，造成炎症反应和免疫病理损伤。
[0012] 免疫复合物的检测技术可分为抗原特异性方法和非抗原特异性方法。在大多数情 况下，免疫复合物中的抗原性质不太清楚或非常复杂，所以抗原特异性方法并不常用。根据 免疫复合物的物理学、免疫学和生物学特性，已经设计出很多检测CIC的方法。
[0013] (一）物理测定法
[0014] L聚乙二醇法
[0015] 聚乙二醇（PEG)是乙二醇聚合而成的无电荷形多糖分子，分子量变化范围较大， 常用的分子量是6000。用3%?4%浓度的PEG可以选择性地将大分子免疫复合物沉淀下 来，其作用机制尚不甚清楚。将PEG溶液与待检血清混合，置4°C冰箱过夜后离心，将沉淀物 用PEG溶液充分洗涤，重新溶解于0. Olmol/L的NaOH中，在波长280nm下测量溶液的吸光 度；也可利用散射比浊法直接测定PEG沉淀的免疫复合物；以不同浓度的热聚合IgG作为 参考标准来计算CIC的含量。
[0016] 聚乙二醇法简单易行，可在临床工作中推广。但此法易受多种大分子蛋白和温度 的干扰，特异性稍差。PEG法还特别适用于沉淀获得CIC，再进行解离分析其中的抗原与抗 体。
[0017] 2.冷球蛋白测定在某些病理情况下，血清中的免疫复合物具有可逆性冷沉淀的特 性，于4°C冰箱中放置1?3天可自发地沉淀下来（参见第二十六章）；此种情况多见于冷 球蛋白血症，所涉及的抗原包括自身的IgG、IgM、核苷酸、肿瘤相关抗原、肾小管上皮、甲状 腺球蛋白、红细胞基质等，还有外源性抗原如乙肝病毒、EB病毒、巨细胞病毒、牛白蛋白和马 蛋白等。
[0018] (二）补体相关测定法
[0019] IgG和IgM类抗体与抗原结合后，重链CH2区的补体结合点暴露，可以固定Clq并 激活补体的系列反应，这是利用补体有关技术检测免疫复合物的基础。
[0020] I. Clq结合试验将待检血清先行加热56°C 30min，以灭活其中的补体和破坏已与 CIC结合的Clq，空出补体结合点。CIC与Clq的结合可用多种方法进行检测，常用的有以下 3种。
[0021] (1)液相法：先将同位素标记的Clq与灭活过的血清标本混合作用，再加入0. 5% (终浓度）的PEG将结合了 Clq的CIC沉淀下来，通过检测沉淀物中的放射活性来计算CIC 的含量。
[0022] (2)固相法：先将Clq吸附于固相载体表面，加入待检血清使CIC与Clq结合，再 加入同位标记的或酶标记的抗人IgG或SPA，最后检测其放射活性或酶活性。
[0023] (3) Clq偏离试验：先将同位素标记的Clq与灭活的血清标本混合，再加抗体致敏 的绵羊红细胞，温育后离心，检测红细胞上的放射活性。红细胞的放射活性与免疫复合物的 量呈负相关。
[0024] 2.补体试验本法的原理类似补体结合试验。将一定量的补体（多为混合豚鼠血 清）与灭活的待检血清混合温育，反应后加入致敏绵羊红细胞。如出现溶血表示血清中没 有CIC存在；不溶血说明标本中有CIC存在。将血清标本做不同稀释，并与已知的热聚合 IgG作对照，可以计算出CIC的含量。本方法的灵敏度较高，且易于在一般实验室开展，不足 之处是特异性较差。
[0025] 3.胶固素结合试验胶固素（conglutinin)是牛血清中的一种正常蛋白，能与C3d 特异性结合；体内与补体结合的CIC都带有C3d，因此胶固素可与CIC结合。用一定量的胶 固素包被塑料管，往管中加入稀释的血清标本，温育后再加入同位素标记或酶标记的抗人 IgG抗体，最后检测各管的放射活性或酶活性，计算CIC的含量。
[0026] 胶固素性质稳定、容易保存、来源方便、价格便宜，检测方法也不复杂，便于推广。 本法的不足是只能检出已结合补体的CIC，但不论何种激活途径都一样检出，并可用作CIC 分离。
[0027](三）抗球蛋白测定法
[0028] 类风湿因子（RF)为抗IgG的自身抗体，与变性IgG、热聚合IgG和IC都有较强的 亲和力。单克隆RF(mRF)可从待发性冷球蛋白血症的血清中提取，多克隆RF(pRF)可从类 风湿性关节炎的血清中提取。用mRF比pRF的敏感性更高一些。
[0029] I. mRF固相抑制试验将mRF吸附于固相载体上，随后加入血清标本，再加入同位素 标记的可溶性热聚合IgG。如果标本中含有1C，固相mRF已与IC结合，热聚合IgG与mRF 的结合使被抑制，所以固相中的放射活性与CIC的含量呈负相关。
[0030] 也可用同位素标记的mRF先与血清标本反应，再加入热聚合IgG附着的琼脂糖珠， 温育并离心洗涤后测量沉淀物的放射强度，测定值与CIC的含量呈负相关。此法的敏感性 比前法更高一些。
[0031] 2. pRF胶乳凝集抑制试验将pRF与血清标本混合，再加入IgG致敏的胶乳悬液。如 果标本中有CIC存在，则pRF先与之结合，凝集反应呈阴性。
[0032] 3.抗抗体法抗抗体可存在于极个别的健康人血清中，是一种抗IgGF(ab'）2的IgM 类抗体，能与已结合抗原的IgG反应，但不与游离的IgG或热聚合IgG反应，因而特异性较 高。先将抗抗体与待检血清混合，再加入IgG致敏的人0型Rh+红细胞；如标本中有CIC存 在，抗抗体被中和，致敏红细胞不出现凝集。
[0033] 以上各种抗球蛋白试验以mRF法敏感性最高，但是mRF较难寻找。这类方法易受 内源性RF的干扰，最好先行检查并除去标本中的内源性RF后再行试验。若遇标本中有聚 合Ig，RF法也易出现假阴性；改用抗抗体法可避免这种现象，但是抗抗体的来源困难。 [0034](四）细胞技术测定
[0035] 有些细胞表面具有Fc受体和（或）补体受体，可与免疫复合物相应成分特异性结 合，因而可用来对免疫复合物进行检测。
[0036] I. Raji细胞试验
[0037] Raji细胞是从Burkin淋巴瘤患者分离的一种B细胞株，表面有大量Clq、C3b和 C3d受体，但无表面免疫球蛋白；因此Raji细胞能与带有补体的免疫复合物结合。先在塑 料管中加处一定量的Raji，再加入待检血清，充分作用后离心洗涤；最后加入荧光素标记 的抗人IgG，洗涤后细胞表面显现荧光为试验阳性；但荧光法只能做定性检测。或加入同位 素标记的抗人IgG，离心洗涤后检测沉淀细胞的放射活性；以热聚合IgG作参考标准，可绘 制出CIC含量与放射活性的标准曲线，从而求得待测标本中CIC的含量。
[0038] Raji细胞法敏感性高、特异性强、方法简单、不受DNA与内毒素的影响；但Raji细 胞表面还有Fc受体，因此被检血清中的游离IgG通过Fc段与Raji细胞结合，造成假阳性。 在待检标本中有抗淋巴细胞抗体时也可导致假阳性。再则，维持Raji细胞的培养较困难， 培养条件的变化可改变Raji细胞表面受体的数目及亲和性，影响检测敏感性。
[0039] 2.人红细胞法人红细胞表面具有C3b受体，可与带有补体成分的CIC相结合。将 待检血清与4%的人O型红细胞悬液等量混合，37°C温育后离心洗涤；加入同位素标记的抗 人IgG抗体，再温育洗涤后测定红细胞的放射活性；以热聚合IgG作参考标准计算出标本中 CIC含量。但该法只能检测已结合补体的CIC。
[0040] 其他细胞法如血小板凝集试验、玫瑰花环形成抑制试验、ADCC抑制试验、巨噬细 胞吞噬抑制试验和中性粒细胞游走抑制试验等，也都可用来检测CIC，方法的敏感性也都很 高，但这些方法的影响因素多，可重复性差，所以实际中工作并不多用。
[0041] (五）免疫复合物的成分检测
[0042] 免疫复合物中抗原和抗体的性质及各类的检测对临床诊治疾病及深入研究疾病 的免疫病理机制有一定价值。但是由于所涉及的抗原种类很多，例如病原微生物、自身物 质、各类同种抗原等，检测方法可分别参见各种抗原的检测技术。免疫复合物中的抗体主要 涉及IgG及其亚类、IgM和IgA ;方法是将血清中免疫复合物分离出来，再用双抗体ELISA夹 心法等方法分析抗体的类别。
[0043] 循环免疫复合物的理想检测方法应具备以下特点：①敏感性高，②特异性强，可重 复性好，④操作简便，⑤适用面广。目前检测免疫复合物的方法虽发展到几十种，但还没有 一种方法具备上述所有的特点，综合相比之下，Clq结合试验、胶固素结合试验、Raji细胞 试验和RF抑制试验等方法比较好些。如果方法得当、试剂合格、标本新鲜、操作小心、分析 谨慎、CIC测定就会有较大的参考价值。
[0044] 二、组织固定免疫复合物的检测
[0045] 确定免疫复合物病的直接证据不是检出CIC，而是在病变部位查到固定的IC沉 积。在一些自身免疫病和免疫复合物病，例如系统性红斑狼疮、部分肾小球肾炎、类风湿性 关节炎、结节性多动脉炎和寻常型天疱疮等，组织沉积免疫复合物的检出对疾病的诊断和 发病机制的研究都比CIC的检出更有意义。
[0046] 检测组织沉淀免疫复合物常用免疫组织化学技术，首先从适当的病理部位采取组 织标本做冰冻切片，用荧光标记物的抗人IgG或抗人C3染色，在荧光显微镜下见到相应部 位显示荧光为阳性反应；也可用酶标抗人IgG或抗人C3与标本切片反应，再用酶的底物溶 液显色，用普通生物显微镜即可观察到相应部位被染色。
[0047] 三、免疫复合物检测的意义及应用
[0048] 判定免疫复合物为发病机制的证据有三：①病变局部有IC沉积；②CIC水平显著 升高；③明确IC中的抗原性质。第三条证据有时很难查到，但至少要具备前两条，单独CIC 的测定不足为凭。人体在健康状态下也存在少量的CIC (大约10?20 μ g/mL)，其生理与病 理的界限不易区分。另外，CIC检测的方法太多，其原理各不相同，用一种方法测定为阳性， 另一种方法检测可能为阴性；但与免疫组化法一起检测，其意义就大得多。
[0049]目前已经明确系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、部分肾小球肾炎和血管炎等疾 病为免疫复合物病，CIC检测对这些疾病仍是一种辅助诊断指标，对判断疾病活动和治疗效 果也有一定意义。在发现紫癜、关节痛、蛋白尿、血管炎和浆膜炎等情况时，可考虑免疫复合 物病的可能性，进行CIC和组织沉积IC的检测。另外，患有恶性肿瘤时CIC检出率也增高， 但不出现III型变态反应的损伤症状，称之为临床隐匿的IC病，然而这种状态常与肿瘤的 病情和预后相关。
[0050] 现有的多种技术存在各种不足，无法快速有效的对各种不同的免疫复合物进行分 离，现有的细胞吸附分离技术主要使用的是已有的携带多种或者单一补体或免疫球蛋白受 体的细胞，这些扩展功能有限，能结合的类型有限。
【发明内容】
[0051] 本发明的目的在于提供一种免疫复合物吸附细胞的制作方法，本发明使用B细胞 株构建技术，构建出永生化的B细胞，再分别使用质粒转入不同补体和球蛋白受体基因，携 带有不同受体的B细胞，可以分别用来筛选各种免疫复合物；并达到分离、筛选、定量不同 免疫复合物的目的。
[0052] 免疫复合物是现有的多种自身免疫疾病（如全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、 结节性多动脉炎等）的致病关键物，对其检测分析的关键是从血液中快速分离、区分不同 类型并对个不同类型的免疫复合物进行定量分析，现有的基础都存在这缺陷，无法有效解 决以上问题，本发明利用携带有不同免疫复合物受体基因的永生化B细胞作为吸附细胞， 分别使用细胞吸附不同的免疫复合物，并进行流式分析，从而快速解决以上3个问题，同 时，随着对个免疫复合物受体的研究，可以往永生化B淋巴细胞基因中插入不同的受体基 因，制造出吸附不同免疫受体的永生化B淋巴细胞，具有很强的功能扩增能力。
[0053] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0054] -种免疫复合物吸附细胞的制作方法，步骤包括载体构建、病毒包装制作、永生化 B淋巴细胞制作和基因转染，
[0055] 所述载体构建的步骤为：
[0056] (I. 1)设计三个基因，分别是CRl、CR2和⑶93 ;这三个基因是补体系统的膜上信号 蛋白受体，且分别结合血液中的C3b、C3d和Clq补体蛋白，起到捕获作用；
[0057] 设计引物为：
[0058] CRl 上游引物序列：5' -CTCGAGCGGAGCACAATGATTGGTCA-3'
[0059] CRl 下游引物序列：5' -CCTAGG TGGCTCCTTTCCCACCAAAA-3'
[0060] CR2 上游引物序列：5' -CTCGAGGGGTCTCGGAACGCATCC-3'
[0061] CR2 下游引物序列：5' -CCTAGGTCCAAGCAATGAGGCACACA-3'
[0062] CD93 上游引物序列：5' -CTCGAGGCCACACAGAGACCGGG-3'
[0063] CD93 下游引物序列：5' -CCTAGGTGTCTCTAGGGCCACCTCAC-3'。
[0064] (1.2) DNA 提取
[0065] 为了克隆出全长的CRl、CR2和⑶93序列，使用DNA抽屉试剂盒从海拉细胞中抽提 出DNA，再以上述引物为模板，通过PCR反应分别克隆出三个基因的基因片段；
[0066] (1.3)质粒构建和扩增、获取
[0067] 根据现代生物分子技术，通过酶切酶连技术，将pLVX-IRES-Neo从XhoI和 BamHI酶切位点切开，再使用连接酶将之前获得的基因片段连接到pLVX-IRES-Neo中；将 pLVX-IRES-Neo转入感受态菌株中，扩增培养，最后抽提感受态菌株的质粒；所述XhoI酶切 位点序列为：CTCGAG ;BamHI酶切位点序列为：GGATCC。
[0068] 作为本发明进一步的方案：步骤（1. 2)中所述的PCR反应的体系为：2 μ I PCR缓 冲液，2μ IlOmM dNTP 和 0.25U exTaq 聚合酶；PCR 扩增程序：先 94°C、30s，58°C、30s，74°C、 50s，35 个循环；然后 72°C，lOmin。
[0069] 作为本发明进一步的方案：所述Clq、C3b和C3d受体基因，分别在基因上游引物序 列的5'端加入了 XhoI酶切位点，在下游引物序列5'端加入了 BamHI酶切位点。
[0070] 作为本发明进一步的方案：所述XhoI酶切位点和BamHI酶切位点分别对应载体 pLVX-IRES-Neo的两个相同的酶切位点。
[0071] 作为本发明进一步的方案：所述病毒包装制作的步骤为：
[0072] (2. I) 293FT 细胞培养
[0073] 293FT细胞用含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基，在37°C饱和湿度、含5% CO2的 孵箱中培养；
[0074] 用0. 25%胰蛋白酶消化对数生长期的293FT细胞，以含10%血清的培养基调整细 胞密度为I. O7个细胞，重新接种于IOcm细胞培养皿内，37°C、5% CO2培养箱内培养，待细胞 汇合度达90%时即可用于转染；
[0075] (2· 2)转染 293FT 细胞
[0076] (2. 2. 1)转染前2小时，更换新鲜不含双抗的含10% FBS的完全培养基；
[0077] (2.2.2)向一灭菌离心管中加入所制备的三种DNA溶液，按照10yg，6.5yg， 3. 5 μ g，2. 5 μ g 的分别把 pLVX-IRES-Neo 加入到 1500 μ L OPTI-MEM 内混匀；
[0078] (2.2.3)将1^口〇2000试剂轻轻摇匀，取35以1^1^口〇2000加入到150(^1^0?1'1-]\^]\1 内混匀，两者迅速混合；
[0079] (2. 2. 4)混合后，室温静止15分钟，以便形成以DNA与Lip〇2000稀释液的转染复 合物；
[0080] (2. 2. 5)将DNA与Lipo2000稀释液的转染复合物逐滴加入到培养皿内，在37°C饱 和湿度、含5% CO2的孵箱中培养；
[0081] (2. 2. 6)培养12小时后更换不含双抗的含2% FBS的病毒收获培养基，继续37°C 饱和湿度、含5% CO2的孵箱中培养48小时；
[0082] (2. 3)病毒的收集及浓缩
[0083] (2. 3. 1)收集转染后48小时的293FT细胞上清液，冰上预冷；1500g，4摄氏度，离 心30分钟；
[0084] (2. 3. 2)用0· 45 μ m滤器过滤病毒上清液；
[0085] (2. 3. 3)过滤后，按照优化条件加入病毒浓缩液；4摄氏度静置过夜；
[0086] (2.3.4)过夜后，1500g，4摄氏度，离心45分钟；去上清，加入一毫升无血清培养基 重悬病毒聚集团块。
[0087] 作为本发明进一步的方案：所述永生化B淋巴细胞制作的步骤为：
[0088] (3. 1)试剂
[0089] (3. I. 1)淋巴细胞分离液：避光4°C保存，用前在37°C水浴中加温；整个分离过程 中，温度应控制在8-28°C，温度过高或过低均影响分离质量；
[0090] (3. 1.2)全培养基：RPM1640培养基，内含20 %胎牛血清，56 °C灭活30分钟， 1. 6-1. 8% IM的HEPES，I. 2%、0. 2mol/L谷氨酰胺，1%青霉素和链霉素；
[0091] (3. 1. 3)环胞酶素 A :250mg/瓶的5mL，用1640培养基稀释成0. 2mg/mL，使用时终 浓度为2 μ g/mL
[0092] (3. I. 4) EBV液：购自中国科学院遗传所，储存于零下80°C ;使用时从冰箱中取出， 37°C迅速融化，用0. 22 μ m的滤膜过滤，不要超过0. 5-1小时；
[0093] (3. 2)建株方法
[0094] (3. 2. 1)取外周血3-4mL，肝素抗凝，应用液浓度5 μ g/mL，加入5-10mL外周血；
[0095] (3. 2. 2)将血液与等量1640培养液混匀后，沿管壁渐渐加入到含有4mL淋巴细胞 分离液的离心管中，混合血：淋巴细胞分离液=6 : 4, 3000转离心10分钟；
[0096] (3. 2. 3)吸取白细胞层，移入另一支离心管中，加入不含血清的1640培养液6mL， 轻轻混匀，进行第一次洗涤；1500转离心15分钟；
[0097] (3. 2. 4)弃上清液，再加 6mL1640全培养液进行第二次洗涤，离心1500转15分钟；
[0098] (3. 2. 5)弃上清液，加入2mL1640全培养基，全培养基加入前，置37°C水浴10分 钟，然后加入环胞霉素 A和I. 2mL EBV液/份，充分混匀后移入到25平方厘米的培养瓶，置 37°C，CO2浓度为5%的培养箱中；
[0099] (3. 2. 6)每2-3天加入3mL新鲜配制的培养基，所述新鲜配制的培养基为I. 6% IM HEPES缓冲液；15%胎牛血清；1%青霉素和链霉素；PRMI 1640补足到100%;7天左右镜下 观察，可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象；
[0100] (3. 2. 7)如果细胞增长慢，或细胞密度低，或培养液pH值呈酸性，吸出半量培养 液，进行等量换液；
[0101] (3. 2. 8)当总量达到HmL时转移到75mL培养瓶中，每2-3周加入5-10mL新鲜培 养基；
[0102] (3. 2. 9)约6-8周，当总量达到45mL时，置50mL离心管中，离心1500转，10分钟； 弃上清，加入3mL冻存培养基，所述冻存培养基为5%二甲基亚枫，95% FBS混匀，成细胞悬 浮液；冻存管分装，ImL/管，立即置零下80度，1-2小时后移入液氮罐中；制备的淋巴细胞 即为EBV永生化B淋巴细胞。
[0103] 作为本发明进一步的方案：所述基因转染的步骤为：取处于对数生长期、生长状 态良好的永生化B淋巴细胞IO5个接种至T25细胞培养瓶；待永生化B淋巴细胞贴壁12h 后，将永生化B淋巴细胞在37°C，CO2浓度为5%的培养箱中继续培养；在转染后的第72h收 集细胞用于WB检测；最后收集到含目的基因的细胞即为目的免疫复合物吸附细胞，免疫复 合物吸附细胞根据所转入基因的不同而不同，分别对应用于C3b、C3d和Clq三个基因。
[0104] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明制作出了一套分别携带有特定基 因的永生化的细胞，具有永生化（无限增殖分裂能力）和表达某一种免疫复合物受体于细 胞表面的能力，通过扩增培养的细胞，建立免疫复合物分析组合，一次可以对血液或者身体 组织的各种免疫复合物进行识别、分类、定量。还具有低成本无限增殖、检测速度快，操作简 单等特点。另外，制作永生化B淋巴细胞所用的病毒是EBV病毒，又称人类疱疹病毒（Human herpesvirus4(HHV-4))，本发明的目的是为了得到永生化的B淋巴细胞，不限于采用该病 毒；所用永生化的B淋巴细胞来源于人体的外周血中的单核细胞；其中所述受体基因分别 分开制作成不同的病毒，而不是连接在一起；本发明最终的细胞是指具有永生化和表达某 一种免疫复合物受体基因的B淋巴细胞，该B淋巴细胞是能稳定表达一种免疫复合物受体 基因，并且该受体能在细胞膜上存在，并能结合细胞外的对应的一种免疫复合物，并不局限 于永生化B细胞。
【具体实施方式】
[0105] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0106] -种免疫复合物吸附细胞的制作方法，包括载体构建、病毒包装制作、EBV永生化 B淋巴细胞制作和基因转染，具体步骤如下：
[0107] (1)载体构建的步骤为：
[0108] (I. 1)设计三个基因，分别是CRl (NCBI Gene ID :1378)、CR2 (NCBI Gene ID :1380) 和⑶93(NCBI Gene ID :22918);这三个基因是补体系统的膜上信号蛋白受体，且分别结合 血液中的C3b、C3d和Clq补体蛋白，起到捕获作用；
[0109] 设计引物为：
[0110] CRl 上游引物序列：5' -CTCGAGCGGAGCACAATGATTGGTCA-3'
[0111] CRl 下游引物序列：5' -CCTAGG TGGCTCCTTTCCCACCAAAA-3'
[0112] CR2 上游引物序列：5' -CTCGAGGGGTCTCGGAACGCATCC-3'
[0113] CR2 下游引物序列：5' -CCTAGGTCCAAGCAATGAGGCACACA-3'
[0114] CD93 上游引物序列：5' -CTCGAGGCCACACAGAGACCGGG-3'
[0115] CD93 下游引物序列：5' -CCTAGGTGTCTCTAGGGCCACCTCAC-3'。
[0116] (1.2) DNA 提取
[0117] 为了克隆出全长的CR1、CR2和⑶93序列，使用DNA抽屉试剂盒从海拉细胞中抽 提出DNA，再以上述引物为模板，通过PCR反应分别克隆出三个基因的基因片段；其中，三个 基因片段的 PCR 反应体系为：2μ1 PCR 缓冲液（IOOmM Tris-HCl，pH8.3,500mM KCI，15mM MgCl2,0· 01 % (0· 01g/100mL) gelatin ;Takara 公司，大连），2 μ IlOmM dNTP (Takara 公司， 大连）和0· 25U exTaq聚合酶（Takara公司，大连）；PCR扩增程序：先94°C、30s，58°C、30s， 74°C、50s，35个循环；然后72°C，IOmin ;将得到的基因克隆到pLVX-IRES-Neo载体中。
[0118] (1.3)质粒构建和扩增、获取
[0119] 根据现代生物分子技术，通过酶切酶连技术，将pLVX-IRES-Neo从XhoI (Forward primer处引入）和BamHI (Reverse primer处引入）酶切位点切开，再使用连接酶将之前获 得的基因片段连接到pLVX-IRES-Neo中；将pLVX-IRES-Neo转入感受态菌株中，扩增培养， 最后抽提感受态菌株的质粒；所述XhoI酶切位点序列为：CTCGAG ;BamHI酶切位点序列为： GGATCC。
[0120] (2)病毒包装制作的步骤为：
[0121] (2. 1)293FT 细胞培养
[0122] 293FT细胞用含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基，在37°C饱和湿度、含5% CO2的 孵箱中培养；
[0123] 用0. 25%胰蛋白酶消化对数生长期的293FT细胞，以含10%血清的培养基调整细 胞密度为I. O7个细胞，重新接种于IOcm细胞培养皿内，37°C、5% CO2培养箱内培养，待细胞 汇合度达90%时即可用于转染。
[0124] (2. 2)转染293FT细胞（三种基因的DNA分开操作）
[0125] (2. 2. 1)转染前2小时，更换新鲜不含双抗的含10% FBS的完全培养基；
[0126] (2. 2. 2)向一灭菌离心管中加入所制备的三种DNA溶液，按照IOygJ. 5yg， 3. 5 μ g，2. 5 μ g 的分别把 pLVX-IRES-Neo 加入到 1500 μ L OPTI-MEM 内混匀；
[0127] (2.2.3)将1^口〇2000试剂轻轻摇匀，取35以1^1^口〇2000加入到150(^1^0?1'1-]\^]\1 内混匀，两者迅速混合；
[0128] (2. 2. 4)混合后，室温静止15分钟，以便形成以DNA与Lip〇2000稀释液的转染复 合物；
[0129] (2. 2. 5)将DNA与Lipo2000稀释液的转染复合物逐滴加入到培养皿内，在37°C饱 和湿度、含5% CO2的孵箱中培养；
[0130] (2. 2. 6)培养12小时后更换不含双抗的含2% FBS的病毒收获培养基，继续37°C 饱和湿度、含5% CO2的孵箱中培养48小时。
[0131] (2. 3)病毒的收集及浓缩
[0132] (2. 3. 1)收集转染后48小时的293FT细胞上清液，冰上预冷；1500g，4摄氏度，离 心30分钟；
[0133] (2. 3. 2)用0· 45 μ m滤器过滤病毒上清液；
[0134] (2. 3. 3)过滤后，按照优化条件加入病毒浓缩液；4摄氏度静置过夜；
[0135] (2. 3.4)过夜后，1500g，4摄氏度，离心45分钟；去上清，加入一毫升无血清培养基 重悬病毒聚集团块。
[0136] (3) EBV永生化B淋巴细胞制作的步骤为：
[0137] (3. 1)试剂
[0138] (3. I. 1)淋巴细胞分离液：避光4°C保存，用前在37°C水浴中加温；整个分离过程 中，温度应控制在8-28°C，温度过高或过低均影响分离质量；
[0139] (3. 1.2)全培养基（用前配置）：RPM1640培养基，内含20 %胎牛血清（Gibco) {56°C灭活30分钟}，1. 6-1. 8% IM的HEPES，I. 2%、0. 2mol/L谷氨酰胺，1%青霉素和链霉 素；
[0140] (3.1.3)环胞酶素八办4):51^(25〇11^)/瓶，用1640培养基稀释成0.211^/1^，使用 时终浓度为);
[0141] (3. I. 4) EBV液：购自中国科学院遗传所，储存于零下80°C ;使用时从冰箱中取出， 37°C迅速融化，用0. 22 μ m的滤膜过滤，不要超过0. 5-1小时。
[0142] (3. 2)建株方法
[0143] (3. 2. 1)取外周血3_4mL,肝素抗凝（血液室温可放置48小时），应用液浓度5 μ g/ mL,可加入5-10mL外周血；
[0144] (3. 2. 2)将血液与等量1640培养液混匀后，沿管壁渐渐加入到含有4mL淋巴细胞 分离液的离心管中（混合血：淋巴细胞分离液=6 : 4)，3000转离心10分钟；
[0145] (3. 2. 3)吸取白细胞层，移入另一支离心管中，加入不含血清的1640培养液6mL， 轻轻混匀，进行第一次洗涤；1500转离心15分钟；
[0146] (3. 2. 4)弃上清液，再加 6mL1640全培养液进行第二次洗涤，离心1500转15分钟；
[0147] (3. 2. 5)弃上清液，加入2mL1640全培养基（全培养基加入前，置37°C水浴10分 钟），然后加入环胞霉素 A (4% )和I. 2mL EBV液/份，充分混匀后移入到25平方厘米的培 养瓶，置37°C，CO2浓度为5%的培养箱中；
[0148] (3. 2. 6)每2-3天加入3mL新鲜配制的培养基（L 6% IM HEPES缓冲液；15 %胎牛 血清（FBS) ;1%青霉素和链霉素；PRMI1640补足到100%) ;7天左右镜下观察，可见淋巴细 胞明显增大，出现聚集现象；
[0149] (3. 2. 7)如果细胞增长慢，或细胞密度低，或培养液pH值呈酸性，吸出半量培养 液，进行等量换液；
[0150] (3. 2. 8)当总量达到HmL时转移到75mL培养瓶中，每2-3周加入5-10mL新鲜培 养基；
[0151] (3. 2. 9)约6-8周，当总量达到45mL时，置50mL离心管中，离心1500转，10分钟； 弃上清，加入3mL冻存培养基（5%二甲基亚枫（dimethyl sufoxide)，95%FBS)混匀，成细 胞悬浮液；冻存管分装，ImL/管，立即置零下80度，1-2小时后移入液氮罐中；制备的淋巴 细胞即为EBV永生化B淋巴细胞。
[0152] (4)基因转染：
[0153] 取处于对数生长期、生长状态良好的永生化B淋巴细胞IO5个接种至T25细胞培 养瓶；待永生化B淋巴细胞贴壁ia后，将永生化B淋巴细胞在37°C，CO 2浓度为5%的培 养箱中继续培养；在转染后的第72h收集细胞用于WB检测；最后收集到含目的基因的细胞 即为目的免疫复合物吸附细胞，免疫复合物吸附细胞根据所转入基因的不同而不同，分别 对应用于C3b、C3d和Clq三个基因。
[0154] 本发明制作出了一套分别携带有特定基因的永生化的细胞，具有永生化（无限增 殖分裂能力）和表达某一种免疫复合物受体于细胞表面的能力，通过扩增培养的细胞，建 立免疫复合物分析组合，一次可以对血液或者身体组织的各种免疫复合物进行识别、分类、 定量。还具有低成本无限增殖、检测速度快，操作简单等特点。
[0155] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论 从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。
[0156] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包 含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当 将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员 可以理解的其他实施方式。
【权利要求】
1. 一种免疫复合物吸附细胞的制作方法，其特征在于，步骤包括载体构建、病毒包装制 作、永生化B淋巴细胞制作和基因转染， 所述载体构建的步骤为： (1. 1)设计三个基因，分别是CR1、CR2和⑶93 ;这三个基因是补体系统的膜上信号蛋白 受体，且分别结合血液中的C3b、C3d和Clq补体蛋白，起到捕获作用； 设计引物为： CR1 上游引物序列：5' -CTCGAGCGGAGCACAATGATTGGTCA-3' CR1 下游引物序列：5' -CCTAGG TGGCTCCTTTCCCACCAAAA-3' CR2 上游引物序列：5' -CTCGAGGGGTCTCGGAACGCATCC-3' CR2 下游引物序列：5' -CCTAGGTCCAAGCAATGAGGCACACA-3' CD93 上游引物序列：5' -CTCGAGGCCACACAGAGACCGGG-3' CD93 下游引物序列：5' -CCTAGGTGTCTCTAGGGCCACCTCAC-3'。 (1. 2)DNA 提取 为了克隆出全长的CR1、CR2和CD93序列，使用DNA抽屉试剂盒从海拉细胞中抽提出 DNA，再以上述引物为模板，通过PCR反应分别克隆出三个基因的基因片段； (1.3)质粒构建和扩增、获取 根据现代生物分子技术，通过酶切酶连技术，将pLVX-IRES-Neo从Xhol和BamHI 酶切位点切开，再使用连接酶将之前获得的基因片段连接到pLVX-IRES-Neo中；将 pLVX-IRES-Neo转入感受态菌株中，扩增培养，最后抽提感受态菌株的质粒；所述Xhol酶切 位点序列为：CTCGAG ;BamHI酶切位点序列为：GGATCC。
2. 根据权利要求1所述的免疫复合物吸附细胞及其制作方法，其特征在于，步骤（1.2) 中所述的PCR反应的体系为：2μ 1 PCR缓冲液，2μ llOmM dNTP和0. 25U exTaq聚合酶；PCR 扩增程序：先941：、3〇8,581：、3〇8,741：、5〇8,35个循环；然后721：，1〇1^11。
3. 根据权利要求1所述的免疫复合物吸附细胞及其制作方法，其特征在于，所述Clq、 C3b和C3d受体基因，分别在基因上游引物序列的5'端加入了 Xhol酶切位点，在下游引物 序列5'端加入了 BamHI酶切位点。
4. 根据权利要求1所述的免疫复合物吸附细胞及其制作方法，其特征在于，所述Xhol 酶切位点和BamHI酶切位点分别对应载体pLVX-IRES-Neo的两个相同的酶切位点。
5. 根据权利要求1所述的免疫复合物吸附细胞及其制作方法，其特征在于，所述病毒 包装制作的步骤为： (2. 1)293FT细胞培养 293?1'细胞用含10%灭活胎牛血清的01^11培养基，在371：饱和湿度、含5%〇)2的孵 箱中培养； 用0. 25%胰蛋白酶消化对数生长期的293FT细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密 度为1. 07个细胞，重新接种于10cm细胞培养皿内，37°C、5% C02培养箱内培养，待细胞汇合 度达90%时即可用于转染； (2. 2)转染293FT细胞 (2. 2. 1)转染前2小时，更换新鲜不含双抗的含10% FBS的完全培养基； (2. 2. 2)向一灭菌离心管中加入所制备的三种DNA溶液，按照10 μ g，6. 5 μ g，3. 5 μ g， 2· 5 μ g 的分别把 pLVX-IRES-Neo 加入到 1500 μ L OPTI-MEM 内混匀； (2· 2· 3)将 Lipo2000 试剂轻轻摇匀，取 35 μ L Lipo2000 加入到 1500 μ L OPTI-MEM 内 混匀，两者迅速混合； (2. 2. 4)混合后，室温静止15分钟，以便形成以DNA与Lip〇2000稀释液的转染复合物； (2. 2. 5)将DNA与Lipo2000稀释液的转染复合物逐滴加入到培养皿内，在37°C饱和湿 度、含5%0)2的孵箱中培养； (2. 2. 6)培养12小时后更换不含双抗的含2% FBS的病毒收获培养基，继续37°C饱和 湿度、含5% C02的孵箱中培养48小时； (2. 3)病毒的收集及浓缩 (2. 3. 1)收集转染后48小时的293FT细胞上清液，冰上预冷；1500g，4摄氏度，离心30 分钟； (2. 3. 2)用0· 45 μ m滤器过滤病毒上清液； (2. 3. 3)过滤后，按照优化条件加入病毒浓缩液；4摄氏度静置过夜； (2. 3.4)过夜后，1500g，4摄氏度，离心45分钟；去上清，加入一毫升无血清培养基重悬 病毒聚集团块。
6.根据权利要求1所述的免疫复合物吸附细胞及其制作方法，其特征在于，所述永生 化B淋巴细胞制作的步骤为： (3· 1)试剂 (3. 1. 1)淋巴细胞分离液：避光4°C保存，用前在37°C水浴中加温；整个分离过程中，温 度应控制在8-28°C，温度过高或过低均影响分离质量； (3. 1. 2)全培养基：RPM1640培养基，内含20%胎牛血清，56°C灭活30分钟，1. 6-1. 8% 1M的HEPES，1. 2%、0. 2mol/L谷氨酰胺，1%青霉素和链霉素； (3. 1. 3)环胞酶素 A :250mg/瓶的5mL，用1640培养基稀释成0. 2mg/mL，使用时终浓度 为 2 μ g/mL (3. 1. 4)EBV液：购白中国科学院遗传所，储存于零下80°C ;使用时从冰箱中取出，37°C 迅速融化，用〇. 22 μ m的滤膜过滤，不要超过0. 5-1小时； (3. 2)建株方法 (3. 2. 1)取外周血3-4mL，肝素抗凝，应用液浓度5 μ g/mL，加入5-10mL外周血； (3. 2. 2)将血液与等量1640培养液混匀后，沿管壁渐渐加入到含有4mL淋巴细胞分离 液的离心管中，混合血：淋巴细胞分离液=6 : 4, 3000转离心10分钟； (3. 2. 3)吸取白细胞层，移入另一支离心管中，加入不含血清的1640培养液6mL，轻轻 混匀，进行第一次洗涤；1500转离心15分钟； (3. 2. 4)弃上清液，再加 6mL1640全培养液进行第二次洗涤，离心1500转15分钟； (3. 2. 5)弃上清液，加入2mL1640全培养基，全培养基加入前，置37°C水浴10分钟，然 后加入环胞霉素 A和1. 2mL EBV液/份，充分混匀后移入到25平方厘米的培养瓶，置37°C， C〇2浓度为5%的培养箱中； (3.2.6)每2-3天加入3mL新鲜配制的培养基，所述新鲜配制的培养基为1.6% 1M HEPES缓冲液；15%胎牛血清；1%青霉素和链霉素；PRMI1640补足到100% ;7天左右镜下 观察，可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象； (3. 2. 7)如果细胞增长慢，或细胞密度低，或培养液pH值呈酸性，吸出半量培养液，进 行等量换液； (3. 2. 8)当总量达到14mL时转移到75mL培养瓶中，每2-3周加入5-10mL新鲜培养基； (3. 2. 9)约6-8周，当总量达到45mL时，置50mL离心管中，离心1500转，10分钟；弃 上清，加入3mL冻存培养基，所述冻存培养基为5%二甲基亚枫，95% FBS混匀，成细胞悬浮 液；冻存管分装，lmL/管，立即置零下80度，1-2小时后移入液氮罐中；制备的淋巴细胞即 为EBV永生化B淋巴细胞。
7.根据权利要求1所述的免疫复合物吸附细胞及其制作方法，其特征在于，所述基因 转染的步骤为：取处于对数生长期、生长状态良好的永生化B淋巴细胞105个接种至T25细 胞培养瓶；待永生化B淋巴细胞贴壁ia后，将永生化B淋巴细胞在37°C，C0 2浓度为5% 的培养箱中继续培养；在转染后的第72h收集细胞用于WB检测；最后收集到含目的基因的 细胞即为目的免疫复合物吸附细胞，免疫复合物吸附细胞根据所转入基因的不同而不同， 分别对应用于C3b、C3d和Clq三个基因。
【文档编号】C12N15/869GK104293836SQ201410300880
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】易银沙, 张万明, 朱海强, 邹义洲, 许澎, 刘彩云, 袁炳秋, 吴小宁 申请人:长沙赢润生物技术有限公司